一株尖孢鐮刀菌細(xì)胞色素P450氧化酶基因的克隆及生物信息學(xué)分析

單麗紅，姜冬冬，趙沙沙，黃佳佳，朱 麗，劉宏民

1)鄭州大學(xué)藥學(xué)院 鄭州 450001 2)鄭州大學(xué)新藥研究開發(fā)中心 鄭州 450001

屈螺酮及其類似物是一種高效、低毒、無不良反應(yīng)的新一代甾體類避孕藥，最早是由Schering公司于2000年開發(fā)的第4代口服避孕藥[1]，具有抗鹽皮質(zhì)激素和抗雄激素的作用，具有廣闊的市場前景[2]。課題組篩選到一株對去氫表雄酮(dihydroepiandrosterone，DHEA)具有羥基化作用的霉菌，經(jīng)分子生物學(xué)的方法鑒定為尖孢鐮刀菌，暫編號為LZ22，目前國內(nèi)外均未見其用于轉(zhuǎn)化DHEA獲得3β，7α，15α-三羥基雄甾-5-烯-17-酮的報道。在微生物作用下甾體發(fā)生的羥基化離不開細(xì)胞色素P450氧化酶(CYP)。CYP為一類亞鐵血紅素-硫醇鹽蛋白超家族，因其還原態(tài)與一氧化碳結(jié)合后在450 nm處的特征吸收峰而得名[3]。CYP一直是醫(yī)藥學(xué)關(guān)注的重點(diǎn)，CYP在甾體類生物轉(zhuǎn)化也成績斐然[4]。對羥化酶重組菌的研究[5]，一般集中在CYP基因的研究和改造。本課題組通過基因工程的手段，篩選到參與該催化過程的關(guān)鍵酶基因CYP6003A1。為了更好地闡述尖孢鐮刀菌LZ22菌株7α,15α-羥化酶系統(tǒng)的分子催化機(jī)制，本研究通過數(shù)據(jù)庫測序信息，采用PCR克隆了尖孢鐮刀菌LZ22菌株的CYP基因，并利用生物信息學(xué)對其產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行了分析。

1 材料與方法

1.1菌株及試劑尖孢鐮刀菌LZ22菌株(鄭州大學(xué)藥物研究院生物轉(zhuǎn)化實驗室自篩和保藏)，Trizol試劑(北京博邁德生物公司)，Taq DNA聚合酶(TaKaRa公司)，PCR純化試劑盒(康寧生命科學(xué)有限公司)，cDNA合成試劑盒(TaKaRa公司)。培養(yǎng)基:葡萄糖3 kg/L，K2PO40.09 kg/L，蛋白胨1.2 kg/L，酵母膏0.1 kg/L。

1.2菌株培養(yǎng)30 ℃、190 r/min搖床培養(yǎng)菌株48 h后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)1% DHEA進(jìn)行誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.3RNA提取、cDNA合成與PCR擴(kuò)增Trizol法提取以DHEA為底物誘導(dǎo)48 h的尖孢鐮刀菌的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，取1 μL cDNA作為PCR擴(kuò)增的模板。引物，上游5’-CGAAGAGAATGATT GAGAC-3’，下游5’-CGAAGGAAGAATGACAGAA-3’。PCR反應(yīng)體系25 μL，包括上下游引物各1 μL,cDNA 1 μL，Taq DNA聚合酶12.5 μL ，水9.5 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)。

1.4CYP6003A1基因的生物信息學(xué)分析通過軟件拼接以及NCBI在線分析，得到CYP6003A1 cDNA全長以及對應(yīng)的氨基酸序列。委托蘇州金唯智公司測序，將CYP6003A1基因的氨基酸序列通過NCBI上的BLAST進(jìn)行在線比對[6]。將序列數(shù)據(jù)以fasta格式形成一個文件后，用ClustalX2進(jìn)行全序列自動比對。輸出格式為Clustal格式(.aln)；利用MEGA 6.0進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。采用MEGA 6.0的鄰接法建樹。利用ExPASy在線蛋白質(zhì)分析軟件ProtParam分析CYP6003A1基因編碼的氨基酸；利用PROFsec網(wǎng)站預(yù)測CYP6003A1蛋白的二級結(jié)構(gòu)；利用丹麥理工大學(xué)生物序列分析中心提供的蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測服務(wù)器CPHmodels運(yùn)用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行同源建模預(yù)測蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)，并在Pymol中進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)顯示，創(chuàng)建高品質(zhì)的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1尖孢鐮刀菌CYP基因的克隆從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)一個編碼CYP的基因，該基因的開放閱讀框為2 073 bp，預(yù)測編碼691個氨基酸的多肽。為克隆其完整的閱讀框架，利用上述總RNA，通過反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并設(shè)計了一對特異性引物，擴(kuò)增出大約3 500 bp的片段，電泳結(jié)果見圖1，送蘇州金唯智公司全長測序，結(jié)果表明基因序列大小為3 459 bp。

1：CYP6003A1全長基因片段；2：DNA Marker圖1 尖孢鐮刀菌CYP基因PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖

2.2尖孢鐮刀菌CYP基因的序列分析將測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST搜索，發(fā)現(xiàn)尖孢鐮刀菌CYP與下列真菌的CYP基因具有很高的同源性：尖孢鐮刀菌EWZ38580.1、輪狀鐮刀霉菌EWG49946.1、燕麥鐮刀菌KIL95759.1、梨孢鐮刀菌OBS15561.1、禾生炭疽菌XP_008091343.1、彎頸孢霉KND86690.1、尖端賽多孢子菌XP_016646336.1、厚垣普奇尼亞菌OAQ60718.1、莢膜組織胞漿菌EEH05495.1；其中與尖孢鐮刀菌氨基酸序列一致性最高，其高度保守區(qū)域見圖2。BLAST比對結(jié)果顯示，與CYP6003A1相似度前10個基因有3個是CYP基因，其余均是與CYP基因相關(guān)的基因(圖3、4)。

圖2 尖孢鐮刀菌CYP基因與其他真菌的CYP基因氨基酸序列的多重比對結(jié)果

圖3 CYP6003A1氨基酸序列BLAST比對結(jié)果

圖4 尖孢鐮刀菌CYP基因 與其他9個真菌基因之間的親緣關(guān)系

2.3CYP6003A1氨基酸組成分析CYP6003A1蛋白氨基酸組成見表1。CYP6003A1等電點(diǎn)為6.78，蛋白質(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)為34.47，屬于穩(wěn)定蛋白質(zhì)。利用PROFsec網(wǎng)站預(yù)測的CYP6003A1蛋白的二級結(jié)構(gòu)見圖5。

表1 CYP6003A1蛋白的氨基酸組成分析

褐色：α-螺旋，38.31%;藍(lán)色：β-折疊，3.91%;白色：β-轉(zhuǎn)角，57.78%圖5 CYP6003A1蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

2.4CYP6003A1蛋白結(jié)構(gòu)模擬對CYP6003A1蛋白三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，該基因包含CYP典型功能區(qū)：離子對結(jié)合區(qū)和血紅素結(jié)合位點(diǎn)，見圖6。

圖6 CYP6003A1蛋白三級結(jié)構(gòu)示意圖

3 討論

本研究用Trizol法提取以DHEA為底物誘導(dǎo)48 h的尖孢鐮刀LZ22菌株的總RNA，通過PCR擴(kuò)增克隆CYP基因并進(jìn)行基因測序；運(yùn)用生物信息學(xué)分析得到的cDNA序列[5]，成功擴(kuò)增出全長3 459 bp的cDNA片段，測序后將序列提交至NCBI進(jìn)行BLAST，發(fā)現(xiàn)CYP6003A1相似度前10個基因有3個是CYP基因，其余均是與CYP基因相關(guān)的基因。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，該基因片段編碼691個氨基酸的多肽，并對CYP6003A1蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行Pymol分子模擬，將CYP6003A1與其他真菌該蛋白質(zhì)進(jìn)行了同源性及進(jìn)化樹分析。

屈螺酮是目前最好的第4代口服避孕藥物，具有重要的商業(yè)價值[2]。課題組篩選到一株能高效轉(zhuǎn)化DHEA 為7α，15α-二羥基DHEA的菌株，該產(chǎn)物可作為重要中間體合成屈螺酮，并且該路線簡便易行，收率較高，有望進(jìn)一步降低屈螺酮的制備成本。

CYP在生物轉(zhuǎn)化合成屈螺酮關(guān)鍵中間體7α,15α-二羥基DHEA階段發(fā)揮重要作用[7]。CYP是藥物生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)的主要代謝酶。越來越多的CYP被發(fā)現(xiàn)參與了多種化合物的生物轉(zhuǎn)化[8]，尤其是后修飾過程，使得CYP在微生物新藥發(fā)掘領(lǐng)域脫穎而出[9]。

本研究通過克隆獲得尖孢鐮刀菌LZ22菌株CYP6003A1基因，并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，其結(jié)果一方面可為此類重組菌的構(gòu)建奠定基礎(chǔ)，另一方面也可進(jìn)一步豐富甾體羥化酶的研究內(nèi)容，同時也可為解決甾體藥物羥基化反應(yīng)收率低下的瓶頸問題提供新的思路和方法。

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