黑米花色苷對(duì)哮喘小鼠氣道炎癥的影響

車 楠，葉 晶，姜京植，延光海，李良昌

延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室 吉林延吉 133002

過(guò)敏性哮喘是一種復(fù)雜的炎癥氣道疾病，最常見的癥狀特點(diǎn)是氣道炎癥、黏液分泌過(guò)多、氣道高反應(yīng)[1]。輔助性T細(xì)胞2型(T-helper type 2，Th2)細(xì)胞因子介導(dǎo)的炎癥在哮喘過(guò)程中發(fā)揮重要作用，如白細(xì)胞介素4(interleukin-4，IL-4)刺激免疫球蛋白E(IgE)的產(chǎn)生，參與過(guò)敏炎癥和氣道重塑；IL-5能夠促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞的聚集和生長(zhǎng)[2]。而在哮喘中Th1細(xì)胞通過(guò)分泌干擾素(interferon，IFN)抑制Th2細(xì)胞因子介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。因此，Th1/Th2細(xì)胞因子失平衡是哮喘發(fā)病的免疫學(xué)機(jī)制之一[3]。黑米花色苷(anthocyanin-rich extract from black rice，AEBR)屬黃酮多酚類化合物，近年來(lái)研究[4-5]發(fā)現(xiàn)，AEBR能夠通過(guò)抑制肥大細(xì)胞的活化而發(fā)揮抗過(guò)敏作用，抑制脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子和IL-6，在抗炎方面也具有不可忽視的作用。但AEBR對(duì)哮喘的作用還缺乏深入的研究。本實(shí)驗(yàn)將利用雞卵白蛋白(ovalbumin，OVA)誘導(dǎo)建立小鼠哮喘模型，觀察AEBR對(duì)哮喘小鼠炎癥的影響，確定AEBR的抗哮喘作用及其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1藥品、試劑和儀器OVA、氫氧化鋁粉(分析純)(購(gòu)自美國(guó)Sigma公司)，IL-4、IL-5、IFN-γ和NF-κB p65(購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司)，Histon和β-actin(購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司)， IL-4、IL-5和IFN-γ ELISA試劑盒(購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司)，黑米花色苷(由延邊大學(xué)藥學(xué)院提取)；402型超聲霧化器(上海四菱醫(yī)療器械廠生產(chǎn))，RT-2100C酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(美國(guó)Rayto公司)，電泳儀及電泳槽、Western blot轉(zhuǎn)膜儀和Gel Doc凝膠成像儀(Bio Rad公司)。

1.2哮喘模型的建立和動(dòng)物分組雄性BALB/c小鼠50只，體重(18±5)g，由延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)SCXK(吉)2003-000。采用隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠分為正常對(duì)照組、模型組、AEBR低劑量組、AEBR中劑量組、AEBR高劑量組。除正常對(duì)照組外，其余各組小鼠分別于第1、14天腹腔注射50 μg OVA+1 mg氫氧化鋁和生理鹽水的混合液200 μL。第21天將致敏小鼠置于玻璃罩內(nèi)，每組以0.1 g OVA+10 mL生理鹽水霧化激發(fā)30 min，1次/d，共5 d。AEBR低、中、高劑量組分別在激發(fā)前灌服黑米花色苷提取物50、150或300 mg/(kg·d)，共計(jì)7 d。

1.3實(shí)驗(yàn)樣本獲取與處理末次激發(fā)48 h后處死小鼠，以磷酸鹽緩沖液1 mL行支氣管肺泡灌洗，收集支氣管肺泡灌洗液(broncho-alveolar lavage fluid，BALF)。血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)細(xì)胞總數(shù)。然后4 ℃、3 000g離心5 min，取上清液，-80 ℃低溫保存，待測(cè)細(xì)胞因子。離心沉淀涂片后Diff-quik染色，鏡下進(jìn)行細(xì)胞分類計(jì)數(shù)。取右肺下葉，用體積分?jǐn)?shù)10%甲醛溶液固定，石蠟包埋后切片，進(jìn)行HE染色觀察肺部炎癥情況。其余各肺葉放入液氮中速凍，-80 ℃保存待用。

1.4細(xì)胞核蛋白的萃取參照文獻(xiàn)[6]方法，細(xì)胞破碎后放入2倍體積的1.3 mol/L蔗糖、1.0 mmol/L MgCl2、10 mmol/L PBS緩沖液(pH=7.2)，4 ℃、1 000g離心15 min；沉淀再懸浮于2.2 mol/L蔗糖、1.0 mmol/L MgCl2、10 mmol/L PBS緩沖液(pH=7.2)中，1.0×105g離心1 h；獲得的細(xì)胞核在0.25 mol/L蔗糖、0.5 mmol/L MgCl2的20 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH=7.2)中清洗，然后1 000g離心10 min；所得沉淀在含有0.3 mol/L蔗糖、50 mmol/L Tris-HCl(pH=7.2)、150 mmol/L NaCl、2 mmol/L EDTA、200 g/L甘油、20 g/L Triton X-100、2 mmol/L PMSF和蛋白酶抑制劑混合物中裂解，冰浴1 h后1.2×104g離心30 min，收集上清液作為可溶性核蛋白進(jìn)行分析。

1.5肺組織中IL-4、IL-5、IFN-γ和NF-κBp65的Westernbot檢測(cè)參照文獻(xiàn)[7]方法。收集細(xì)胞進(jìn)行裂解獲取蛋白，BCA方法測(cè)定蛋白濃度，每個(gè)泳道加樣30 μg總蛋白，在100 g/L SDS-PAGE膠上120 V、90 min進(jìn)行蛋白分離，分離的蛋白在250 mA、90 min電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，50 g/L脫脂奶粉TBS-T緩沖液孵育1 h封閉膜上非特異性位點(diǎn)，分別加入相應(yīng)的稀釋抗體4 ℃過(guò)夜。第2天，洗膜后再用HRP標(biāo)記的二抗雜交，37 ℃孵育1 h。洗膜后加ECL發(fā)光試劑，利用Gel Doc進(jìn)行圖像采集。

1.6BALF中細(xì)胞因子IL-4、IL-5和IFN-γ含量的ELISA分析具體操作按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，結(jié)果的單位以pg/L表示。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 14.0進(jìn)行分析，應(yīng)用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)比較各組BALF中細(xì)胞數(shù)目和炎癥細(xì)胞因子水平、小鼠肺組織相關(guān)細(xì)胞因子和NF-κB p65的變化，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1各組小鼠BALF中炎癥細(xì)胞的變化見圖1、表1。Diff-quik染色結(jié)果顯示，正常組以巨噬細(xì)胞為主，偶見淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞；模型組和AEBR低劑量組嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)明顯增多，占細(xì)胞總數(shù)的68%以上；AEBR中、高劑量組嗜酸性粒細(xì)胞明顯減少，以巨噬細(xì)胞為主。各組BALF中細(xì)胞變化。與正常對(duì)照組比較，模型組BALF中炎癥細(xì)胞總數(shù)和淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯升高(P<0.05)；AEBR中、高劑量組能明顯降低哮喘小鼠BALF中炎癥細(xì)胞總數(shù)和淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)目(P<0.05)；單核細(xì)胞數(shù)目在各組之間無(wú)明顯變化(P>0.05)。

A：正常組；B：模型組；C：AEBR低劑量組；D：AEBR中劑量組；E：AEBR高劑量組；箭頭所示為嗜酸性粒細(xì)胞圖1 各組小鼠BALF中炎癥細(xì)胞變化(Diff-quik染色，×200)

×104/mL

*：與正常組比較，P<0.05；#：與模型組比較，P<0.05

2.2AEBR對(duì)BALF中IL-4、IL-5和IFN-γ水平的影響見表2。

2.3AEBR對(duì)小鼠肺部炎癥的影響見圖2。HE染色結(jié)果顯示，正常對(duì)照組氣道壁及氣道軟組織結(jié)構(gòu)完整。模型組和AEBR低劑量組氣道黏膜水腫，氣道的平滑肌增厚明顯，可見氣道上皮脫落，在小的氣管和血管周圍可見大量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，炎癥細(xì)胞多層圍繞著管腔周圍。AEBR中、高劑量組氣道和血管周圍的炎癥細(xì)胞明顯減少，氣道平滑肌增生不明顯。氣道結(jié)構(gòu)性比較完整，結(jié)果表明AEBR能夠明顯抑制哮喘小鼠的肺部炎癥。

表2 各組小鼠BALF中IL-4、IL-5和IFN-γ水平的變化(n=10) pg/L

*:與正常組比較，P<0.05; #:與模型組比較，P<0.05

A：正常組；B：模型組；C：AEBR低劑量組；D：AEBR中劑量組；E：AEBR高劑量組圖2 各組小鼠肺部炎癥的變化(SP，×200)

2.4AEBR對(duì)肺組織細(xì)胞因子IL-4、IL-5、IFN-γ蛋白表達(dá)水平的影響見圖3、表3。與正常組相比，模型組小鼠肺組織中IL-4、IL-5蛋白表達(dá)增高，而IFN-γ蛋白表達(dá)降低(P<0.05)；AEBR中、高劑量組IL-4、IL-5蛋白表達(dá)明顯降低，而IFN-γ蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)。AEBR低劑量組小鼠肺組織中IL-4、IL-5和IFN-γ蛋白表達(dá)水平與哮喘模型組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1：正常組；2：模型組；3：AEBR低劑量組；4：AEBR中劑量組；5：AEBR高劑量組圖3 各組小鼠肺組織IL-4、IL-5和IFN-γ 蛋白的表達(dá)

組別IL?4IL?5INF?γ正常組0．031±0．0120．035±0．0230．852±0．031模型組1．105±0．128?1．164±0．1850．395±0．114?AEBR低劑量組0．891±0．1641．196±0．1210．242±0．093AEBR中劑量組0．513±0．099#0．389±0．091#0．875±0．081#AEBR高劑量組0．132±0．085#0．265±0．087#0．892±0．091#F212．532189．32478．561P<0．001<0．001<0．001

*:與正常組比較，P<0.05; #:與模型組比較，P<0.05

2.5AEBR對(duì)肺組織細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中NF-κBp65表達(dá)的影響圖4、表4。與正常組相比，模型組NF-κB p65核轉(zhuǎn)位明顯增加，細(xì)胞質(zhì)中NF-κB p65明顯減少(P<0.05)。AEBR中、高劑量組NF-κB p65核轉(zhuǎn)位減少，細(xì)胞質(zhì)中NF-κB p65表達(dá)明顯增加(P<0.05)。AEBR低劑量組細(xì)胞質(zhì)NF-κB p65和細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65表達(dá)與哮喘模型組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1：正常組；2：模型組；3：AEBR低劑量組；4：AEBR中劑量組；5：AEBR高劑量組圖4 各組小鼠肺組織中NF-κB蛋白的表達(dá)

分組細(xì)胞質(zhì)NF?κBp65細(xì)胞核NF?κBp65正常組0．752±0．0150．554±0．031模型組0．422±0．123?0．875±0．113?AEBR低劑量組0．465±0．1410．818±0．122AEBR中劑量組0．792±0．091#0．642±0．091#AEBR高劑量組0．775±0．087#0．474±0．092#F15．36817．652P<0．001<0．001

*:與正常組比較，P<0.05; #:與模型組比較，P<0.05

3 討論

哮喘氣道炎癥反應(yīng)機(jī)制是復(fù)雜的多種炎癥細(xì)胞反應(yīng)。在過(guò)敏性氣道疾病中，嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)非常明顯，被認(rèn)為是哮喘的一個(gè)標(biāo)志性病理特征[8-9]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，給予150和300 mg/kg的AEBR灌胃治療，能明顯降低BALF中嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)，同時(shí)細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞數(shù)和淋巴細(xì)胞數(shù)也明顯降低。同時(shí)AEBR能明顯降低哮喘下滑所的肺部炎癥反應(yīng)，表明AEBR能明顯抗哮喘作用。

現(xiàn)在研究[10]普遍認(rèn)為哮喘發(fā)病與Th1/Th2細(xì)胞失平衡有關(guān)。Th2分泌的細(xì)胞因子包括IL-4、IL-5和IL-13等，是體液免疫應(yīng)答的重要介質(zhì)，能夠誘導(dǎo)IgE產(chǎn)生、促進(jìn)氣道嗜酸性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)。此外，Th2細(xì)胞因子誘導(dǎo)組胺和白三烯釋放與AHR相關(guān)聯(lián)。Th1細(xì)胞因子如IFN-γ參與細(xì)胞免疫反應(yīng)，這些細(xì)胞因子能夠?qū)筎h2介導(dǎo)的免疫反應(yīng)和減少IgE合成從而抑制哮喘的發(fā)生[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，給予150和300 mg/kg的AEBR灌胃后，能明顯提高哮喘小鼠肺組織IFN-γ蛋白表達(dá)并降低IL-4、IL-5蛋白表達(dá)，表明AEBR能夠影響IFN-γ、IL-4和IL-5的表達(dá)，改變Th1/Th2細(xì)胞因子失衡，從而影響哮喘小鼠肺部炎癥。暗示AEBR可能通過(guò)影響Th1/Th2細(xì)胞因子失衡來(lái)減輕哮喘小鼠肺部炎癥。

NF-κB是非常重要的一種核轉(zhuǎn)錄因子，研究[12]表明，當(dāng)包括T淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的NF-κB被激活后，能明顯提高IL-4和IL-5蛋白質(zhì)表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，OVA誘導(dǎo)建立的哮喘模型小鼠肺組織細(xì)胞質(zhì)內(nèi)NF-κB p65蛋白水平明顯降低，而細(xì)胞核蛋白中NF-κB p65蛋白水平明顯升高，提示哮喘過(guò)程中NF-κB被激活，由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核中，啟動(dòng)包括IL-4和IL-5等靶基因的轉(zhuǎn)錄。而給予150和300 mg/kg的AEBR灌胃治療后，AEBR能夠提高哮喘小鼠肺組織細(xì)胞質(zhì)內(nèi)NF-κB p65的表達(dá)，減少了哮喘小鼠細(xì)胞核內(nèi)的NF-κB p65的表達(dá)。提示AEBR能夠抑制哮喘過(guò)程中NF-κB的活化，阻止NF-κB向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)位、抑制NF-κB p65活化轉(zhuǎn)錄功能，直接或間接影響Th1/Th2細(xì)胞因子失衡。

綜上所述，AEBR能抑制哮喘小鼠氣道和肺部炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，AEBR的抑制哮喘炎癥作用機(jī)制可能是通過(guò)抑制NF-κB活化從而影響Th1/Th2細(xì)胞因子失衡。

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