RNAi沉默Nrf2基因增強(qiáng)煤焦瀝青煙提取物對BEAS-2B細(xì)胞的毒性作用

曹會(huì)敏，倪 靜，玉崧成，馮斐斐，吳擁軍

鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生毒理學(xué)教研室 鄭州 450001

多環(huán)芳烴類混合物(polycyclicaormatic hydorcarbons, PAHs)是煤焦瀝青(coal tar pitch，CTP)的主要成分，長期接觸大量PAHs，可產(chǎn)生多種損傷，如氧化應(yīng)激、加合物形成、微核率增加[1]、炎性反應(yīng)等，最終引起癌癥或其他疾病[2]。接觸CTP早期可致肺部的炎癥反應(yīng)，長期刺激可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化、引發(fā)肺癌[3]。而人體持續(xù)暴露于內(nèi)源性或外源性的氧化劑或親電子劑化學(xué)物，使機(jī)體內(nèi)活性氧或活性氮升高，破壞機(jī)體的氧化還原平衡，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷(包括脂肪、蛋白質(zhì)和核酸)，引起慢性炎癥[4-5]，繼而引發(fā)一系列疾病，如癌癥、心血管疾病、神經(jīng)性病變、炎性疾病等[6-7]。細(xì)胞可通過各種修復(fù)和抗氧化防御機(jī)制抵抗各種氧化刺激[8]。研究[9]表明，轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)可以保護(hù)細(xì)胞和器官免受多種多樣的毒性損傷。醌氧化還原酶1[NAD(P)H quinone dehydrogenase 1, NQO1]在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)方面具有重要作用[10]。Logsdon等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在人胰腺癌細(xì)胞中NQO1的表達(dá)是正常組織細(xì)胞的12倍，認(rèn)為NQO1是胰腺癌的生物學(xué)標(biāo)志物。其他研究[12-13]發(fā)現(xiàn)NQO1在肺癌、乳腺癌等腫瘤細(xì)胞中也處于異常高表達(dá)狀態(tài)，且與Nrf2通路其他下游靶向基因的表達(dá)水平保持一致。Nrf2基因缺乏小鼠表現(xiàn)出對腫瘤基因的高度靈敏性[14]，在肺癌中發(fā)現(xiàn)Nrf2基因的異常，而該變化能對化學(xué)治療與放射治療產(chǎn)生抵抗作用[15-16]，且有利于腫瘤的生長，影響預(yù)后。因此，深入了解Nrf2在細(xì)胞保護(hù)中的調(diào)節(jié)作用可以對肺癌的發(fā)生機(jī)制及新型的抗腫瘤藥物的探索提供線索。該研究應(yīng)用RNA干擾技術(shù)(RNA interfering, RNAi)沉默BEAS-2B細(xì)胞中Nrf2基因的表達(dá)，建立Nrf2基因沉默穩(wěn)定表達(dá)株，并利用煤焦瀝青煙提取物(coal tar pitch smoke extract，CTPE)作為誘導(dǎo)劑，體外建立BEAS-2B細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化模型，動(dòng)態(tài)觀察不同代次細(xì)胞中Nrf2基因及蛋白的表達(dá)，探討CTPE可能的致癌機(jī)制以及Nrf2在致細(xì)胞發(fā)生惡性改變過程中的作用，為探索肺癌的發(fā)生機(jī)制提供線索。

1 材料與方法

1.1主要試劑與細(xì)胞CTPE由中國鋁業(yè)股份有限公司河南分公司提供；G418、瓊脂糖(美國Invitrogen公司)；定量PCR試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司]；兔抗Nrf2、NQO1、β-actin一抗和辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔-IgG(英國Abcam公司)。BEAS-2B細(xì)胞由鄭州大學(xué)特聘教授吳衛(wèi)東老師饋贈(zèng)，用含體積分?jǐn)?shù)12%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)于體積分?jǐn)?shù)5% CO2、37 ℃飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞融合至90%時(shí)傳代。

1.2RNAi沉默Nrf2細(xì)胞的建立篩選BEAS-2B細(xì)胞株對氨基糖苷類抗生素G418最低耐受濃度；對GenBank 上公布的人 Nrf2核苷酸序列設(shè)計(jì)4條RNA抑制靶序列(分別標(biāo)記Nrf2-1、Nrf2-2、Nrf2-3、Nrf2-4)，1條陰性對照序列(記為shNC)及1條陽性對照序列(記為shGAPDH)進(jìn)行RNAi-Mate轉(zhuǎn)染，篩選出沉默Nrf2基因的最佳序列，熒光顯微鏡觀察及RT-PCR驗(yàn)證其結(jié)果。利用最佳濃度的G418篩選細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-Nrf2重組質(zhì)粒，將細(xì)胞分為目的基因?qū)嶒?yàn)組、空白對照組、G418對照組和轉(zhuǎn)染試劑對照組。由RT-PCR測定Nrf2 mRNA相對表達(dá)量，將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)并凍存。

1.3細(xì)胞染毒及惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞株的建立當(dāng)BEAS-2B細(xì)胞生長融合至70%左右時(shí)，PBS沖洗2遍，更換新的完全培養(yǎng)基5 mL，將細(xì)胞分為二甲基亞砜(DMSO)陰性對照組、B(a)P陽性對照組、CTPE染毒組和Nrf2轉(zhuǎn)染組。分別吸取10 μL的DMSO 溶液、以10 μL 2.5g /L DMSO為溶劑配制的B(a)P母液、7.5 μL 2 g/L的CTPE，加入到5 mL新鮮完全培養(yǎng)基充分混合的溶液，反復(fù)吹打使培養(yǎng)基與該染毒物充分混勻后處理上述分組的細(xì)胞。24 h后常規(guī)傳代培養(yǎng)，如此反復(fù)3次，最后一次染毒結(jié)束后首次傳代定為第1代。Nrf2轉(zhuǎn)染組在傳代過程中每隔5代進(jìn)行一次轉(zhuǎn)染，并一直應(yīng)用半數(shù)抑制濃度60%的G418完全培養(yǎng)基維持。

1.4軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)用3 g/L胰蛋白酶消化對數(shù)生長期細(xì)胞，并用含體積分?jǐn)?shù)20%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基輕輕吹打，使之成為單細(xì)胞，用PBS制備12和7 g/L 2個(gè)質(zhì)量濃度的低熔點(diǎn)瓊脂糖液，按11(體積比)比例使12 g/L的瓊脂糖和2×培養(yǎng)基(含有2×抗生素和體積分?jǐn)?shù)20%的小牛血清)混合后，6孔板中每孔注入2 mL作底層瓊脂，置于CO2培養(yǎng)箱中；按11比例使7 g/L的瓊脂糖和2×培養(yǎng)基在15 mL離心管中混勻，再向管中加入單細(xì)胞懸液0.2 mL，吹打混勻，緩慢注入鋪有12 g/L瓊脂糖的6孔板中，瓊脂凝固后，每孔加入完全培養(yǎng)基2 mL，置CO2溫箱中培養(yǎng)10～14 d；于倒置顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)，觀察克隆形成率。

1.5各組細(xì)胞mRNA的提取和Nrf2和NQO1的RT-PCR檢測各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)24～48 h后提取細(xì)胞總RNA，細(xì)胞總RNA的提取嚴(yán)格按照RNAiso Plus試劑說明書進(jìn)行，引物寡核苷酸序列參照GenBank中Nrf2和NQO1的DNA序列，委托寶生物工程(大連)有限公司設(shè)計(jì)并合成，以GAPDH作內(nèi)參照。同一樣本均設(shè)3個(gè)平行樣，PCR儀自動(dòng)繪制擴(kuò)增曲線和溶解曲線。反應(yīng)程序設(shè)定：預(yù)變性95 ℃，10 min，然后95 ℃，5 s；55 ℃，15 s；72 ℃，15 s，擴(kuò)增20～30個(gè)循環(huán)。溶解曲線程序設(shè)定：95 ℃，1 min；55 ℃，30 s；95 ℃，30 s，1個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因在各組細(xì)胞中的相對表達(dá)量。

1.6各組細(xì)胞中Nrf2和NQO1蛋白表達(dá)的Westernblot檢測各組細(xì)胞按試劑盒說明書提取細(xì)胞總蛋白，各組標(biāo)本加入蛋白上樣緩沖液行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、ECL發(fā)光顯色。采用KONDA2000凝膠成像系統(tǒng)成像，用 GENESNAP 軟件統(tǒng)計(jì)各條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參照，計(jì)算目的基因與內(nèi)參照吸光度的相對比值。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 21.0進(jìn)行分析，應(yīng)用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)比較各組細(xì)胞克隆形成率、不同代次各組細(xì)胞中Nrf2、NQO1 mRNA和蛋白表達(dá)的差異，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1Nrf2抑制基因的篩選及細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功的驗(yàn)證結(jié)果見圖1。 倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及生長情況，第1天各孔細(xì)胞生長良好，形態(tài)正常；第7天濃度為400 mg/L的孔中細(xì)胞密度低于50%；第13天細(xì)胞全部凋亡、脫壁；因此400 mg/L為G418最佳篩選濃度。Nrf2-1組(0.150±0.009)、Nrf2-2組(0.345±0.014)、Nrf2-3組(0.414±0.016)、Nrf2-4組(0.237±0.014)Nrf2 mRNA表達(dá)水平均明顯低于陰性對照組(1.001±0.107)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=149.399，P<0.001)，Nrf2-1組與陽性對照組(0.144±0.015)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；故選Nrf2-1組為RNAi最佳序列。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞經(jīng)傳代培養(yǎng)后，siRNA組(0.147±0.002)Nrf2 mRNA相對表達(dá)水平明顯低于空白對照(1.026±0.297)、G418對照組(0.993±0.032)和轉(zhuǎn)染試劑對照組(1.211±0.085)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=28.291，P<0.001)。

A：400 mg/L G418處理1 d后；B：400 mg/L G418處理7 d后；C：400 mg/L G418處理13 d后圖1 G418處理BEAS-2B細(xì)胞不同時(shí)期細(xì)胞形態(tài)變化(×100)

2.2軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)見表1。

2.3不同代次各組細(xì)胞中Nrf2、NQO1mRNA的表達(dá)情況見表2。

表1 各組細(xì)胞克隆形成率比較(n=3)

*：與DMSO組比較，P<0.001，#：與B(a)P組比較，P<0.001，▲：與CTPE組比較，P<0.001

2.4不同代次各組細(xì)胞中Nrf2、NQO1蛋白的表達(dá)情況見圖2及表3。誘導(dǎo)后(CTPE組)第10代、20代、30代細(xì)胞中Nrf2與NQO1的蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(rS=0.913，P<0.001)。

圖2 不同代次各組 細(xì)胞中Nrf2(左)、NQO1(右)蛋白的表達(dá)

基因組別10代20代30代FPNrf2DMSO組1．001±0．1071．000±0．0320．998±0．0220．0020．988B(a)P組1．097±0．0451．260±0．1051．279±0．0814．5800．062CTPE組1．090±0．0221．248±0．0911．264±0．1612．3550．176RNAi組0．151±0．0090．139±0．0130．144±0．0081．0490．407F169．125164．980103．038P<0．001<0．001<0．001NQO1DMSO組1．003±0．0290．970±0．0451．003±0．0500．6040．577B(a)P組2．373±0．0583．056±0．3003．374±0．31612．1900．008CTPE組2．167±0．2323．461±0．1663．512±0．23338．582<0．001RNAi組1．147±0．0461．272±0．0131．566±0．18111．8230．008F97．481144．544101．924P<0．001<0．001<0．001

表3 不同代次各組細(xì)胞中Nrf2、NQO1蛋白的表達(dá)情況(n=3)

3 討論

環(huán)境中毒物的種類眾多,如空氣污染物、有機(jī)溶劑、金屬和類金屬等，其中，多數(shù)毒物均可引起機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)。為應(yīng)對外來有毒化學(xué)物質(zhì)對機(jī)體的損害，哺乳動(dòng)物在不斷進(jìn)化過程中體內(nèi)逐漸形成了一套復(fù)雜的抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)。而 Nrf2是經(jīng)典的調(diào)控機(jī)體抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵因子，Nrf2在激活后可誘導(dǎo)抗氧化蛋白的表達(dá)，提高機(jī)體的抗氧化應(yīng)激能力，在保護(hù)細(xì)胞和組織免受活性氧自由基損害中起著重要的作用[17-18]。研究[19]發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用致癌物4-硝基喹啉-1-氧化物(4-Nitroquinoline 1-oxide, 4NQO)誘導(dǎo)Nrf2基因敲除(Nrf2-KO)小鼠和野生型小鼠癌變過程中，與野生型小鼠相比，Nrf2-KO小鼠對4NQO更加敏感，更容易患口腔癌和食管癌，說明了Nrf2在癌癥預(yù)防方面的重要性。本研究采用RNAi技術(shù)建立Nrf2沉默的BEAS-2B細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)株。siRNA組Nrf2 mRNA相對表達(dá)水平明顯低于空白對照、G418對照組和轉(zhuǎn)染試劑對照組，說明成功進(jìn)行了細(xì)胞轉(zhuǎn)染。在經(jīng)CTPE刺激后的傳代過程中，RNAi組從20代起軟瓊脂克隆形成率就顯著高于CTPE組和B(a)P組，說明Nrf2沉默增強(qiáng)了CTPE誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用，使細(xì)胞惡變提前發(fā)生，提示Nrf2在預(yù)防癌癥發(fā)生過程中具有重要作用，與文獻(xiàn)[19]的研究結(jié)果一致。RT-PCR及Western blot檢測結(jié)果顯示，隨傳代次數(shù)增加，B(a)P組和CTPE組Nrf2 mRNA及蛋白表達(dá)逐漸升高，而DMSO組Nrf2 mRNA雖然能檢測到，但Nrf2蛋白卻幾乎檢測不到，提示Nrf2蛋白在正常生理狀態(tài)下被迅速泛素化而降解，以維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，而當(dāng)受CTPE刺激后，Nrf2穩(wěn)定性及含量均增加，在CTPE誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞發(fā)生惡變中發(fā)揮保護(hù)作用。而第10代細(xì)胞各組間克隆形成率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明在細(xì)胞癌前病變階段Nrf2即有了較明顯的表達(dá)特點(diǎn)，其可能是焦?fàn)t工等罹患肺癌的早期生物標(biāo)志。有研究[16, 20]顯示，盡管Nrf2表現(xiàn)出對腫瘤基因的抵制作用，但是Nrf2 水平的升高卻表現(xiàn)出對腫瘤細(xì)胞的保護(hù)作用并影響預(yù)后，且肺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化后可能通過Nrf2通路介導(dǎo)了癌細(xì)胞的多藥耐藥性[21]。后期實(shí)驗(yàn)將繼續(xù)探討Nrf2對CTPE所致BEAS-2B細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化后細(xì)胞的生長與增殖的影響。

NQO1是一種重要黃素腺嘌呤二核苷酸依賴的黃素蛋白酶類，能夠調(diào)控磺胺類、苯醌類以及多環(huán)芳烴類化合物等的代謝，具有多重細(xì)胞保護(hù)作用。B(a)P作用于小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞后，可以通過增強(qiáng)Sp1-AhR-Nrf2信號級聯(lián)反應(yīng)使過氧化氫酶過度表達(dá)從而上調(diào)NQO1的表達(dá)[22]。Kim等[23]研究發(fā)現(xiàn)，NQO1在肺癌尤其是肺鱗癌的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用，而且吸煙與NQO1的相關(guān)性是肺癌的危險(xiǎn)因素。作者分別采用RT-PCR和Western blot檢測NQO1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞第10代、20代、30代均表現(xiàn)為B(a)P組和CTPE組表達(dá)量高于DMSO組，且隨傳代次數(shù)增加，B(a)P組、CTPE組和RNAi組的表達(dá)量均逐漸升高，且NQO1和Nrf2的蛋白表達(dá)呈正相關(guān)；另外RNAi組NQO1的表達(dá)量低于CTPE組，提示CTPE刺激細(xì)胞后，Nrf2可參與NQO1的調(diào)控來保護(hù)細(xì)胞。研究[24]發(fā)現(xiàn)，Keap1-Nrf2/ARE通路調(diào)控NQO1的表達(dá)對肺癌的發(fā)生發(fā)展具有重要的作用。但RNAi組在細(xì)胞傳代過程中NQO1表達(dá)量也呈上升趨勢，提示在CTPE誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化過程中NQO1并非僅受Nrf2調(diào)控。

綜上所述，Nrf2在CTPE誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞發(fā)生惡變過程中是抑癌基因；且NQO1和Nrf2蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，表明Nrf2可能通過上調(diào) NQO1的表達(dá)對抗CTPE對BEAS-2B細(xì)胞的毒性作用，發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)功能。而且NQO1與Nrf2均具有在細(xì)胞形態(tài)學(xué)發(fā)生變化但未發(fā)生癌變時(shí)表達(dá)量即明顯增加的特點(diǎn)，說明在癌前病變階段兩者即發(fā)生變化以應(yīng)對CTPE對細(xì)胞的毒性作用，可能有助于接觸CTPE高危人群罹患肺癌的預(yù)警及篩查。

[1] 張笑,關(guān)蕾,黃坤,等.外周血淋巴細(xì)胞微核率對多環(huán)芳烴接觸工人早期健康監(jiān)護(hù)的意義[J].中華勞動(dòng)衛(wèi)生職業(yè)病雜志,2012,30(12):968

[2] FENG FF,YANG YL,LI ZT,et al.Changes in telomere length and telomerase activity in human bronchial epithelial cells induced by coal tar pitch extract[J].Toxicol Res (Camb),2015,4(6):1535

[3] 宋金燕,馮亞男,杜麗鵬,等.煤焦瀝青煙提取物誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞發(fā)生炎性凋亡的研究[J].中華勞動(dòng)衛(wèi)生職業(yè)病雜志,2013,31(1):53

[4] ANDREOLI R,PROTANO C,MANINI P, et al. Association between environmental exposure to benzene and oxidative damage to nucleic acids in children[J].Med Lav,2012,103(5):324

[5] JUNG MH,KIM HR,PARK YJ, et al.Genotoxic effects and oxidative stress induced by organic extracts of particulate matter (PM10) collected from a subway tunnel in Seoul, Korea[J].Mutat Res,2012,749(1/2):39

[6] GORUDKO IV,KOSTEVICH VA,SOKOLOV AV,et al.Functional activity of neutrophils in diabetes mellitus and coronary heart disease: role of myeloperoxidase in the development of oxidative stress[J].Bull Exp Biol Med,2012,154(1):23

[7] GOLDSCHMIDT R,ARCE PM,KHDOUR OM,et al.Effects of cytoprotective antioxidants on lymphocytes from representative mitochondrial neurodegenerative diseases[J].Bioorg Med Chem,2013,21(4):969

[8] SEN S,CHAKRABORTY R,SRIDHAR C, et al. Free radicals, antioxidants, diseases and phytomedicines:current status and future prospect[J].IJPSRR,2010,3(3):91

[9] AHMED A. Review of NRF2-regulated genes induced in response to antioxidants[J].JMRHS,2014,3(2):428

[10]LI Z, ZHANG Y，JIN T, et al. NQO1 protein expression predicts poor prognosis of non-small cell lung cancers[J]. BMC Cancer,2015,15:207

[11]LOGSDON CD,SIMEONE DM,BINKLEY C,et al.Molecular profiling of pancreatic adenocarcinoma and chronic pancreatitis identifies multiple genes differentially regulated in pancreatic cancer[J].Cancer Res,2003,63(10):2649

[12]GLORIEUX C,SANDOVAL JM,DEJEANS N,et al.Overexpression of NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1 (NQO1) and genomic gain of the NQO1 locus modulates breast cancer cell sensitivity to quinones[J].Life Sci,2016,145:57

[13]MADAJEWSKI B,BOATMAN MA,CHAKRABARTI G, et al.Depleting tumor-NQO1 potentiates anoikis and inhibits growth of NSCLC[J].Mol Cancer Res,2015,14(1):14

[14]CHEUNG KL,LEE JH,KHOR TO,et al.Nrf2 knockout enhances intestinal tumorigenesis in apcmin mice due to attenuation of anti-oxidative stress pathway while potentiates inflammation[J].Mol Carcinog,2014,53(1):77

[15]JI L,LI H,GAO P,et al.Nrf2 pathway regulates multidrug-resistance-associated protein 1 in small cell lung cancer[J].PLoS One,2013,8(5):e63404

[16]KAWASAKI Y,OKUMURA H,UCHIKADO Y,et al.Nrf2 is useful for predicting the effect of chemoradiation therapy on esophageal squamous cell carcinoma[J].Ann Surg Oncol,2014,21(7):2347

[17]曹惠敏,余剛.Nrf2在阿爾茨海默病中的研究現(xiàn)狀[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,2015,42(6):533

[18]聶慧芳,李冰.核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2信號通路在環(huán)境毒物暴露中的作用研究進(jìn)展[J].環(huán)境與健康雜志,2015,32(2):179

[19]OHKOSHI A,SUZUKI T,ONO M, et al.Roles of Keap1-Nrf2 system in upper aerodigestive tract carcinogenesis[J].Cancer Prev Res,2013,6(2):149

[20]KANAMORI M,HIGA T,SONODA Y,et al.Activation of the NRF2 pathway and its impact on the prognosis of anaplastic glioma patients[J].Neuro Oncol,2015,17(4):555

[21]崔小川,丁軍利,萬小蘞,等.肺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化后引發(fā)Nrf2介導(dǎo)的多藥耐藥的研究[J].腫瘤防治研究,2015,42(5):432

[22]LIN X,YANG H,ZHOU L, et al.Nrf2-dependent induction of NQO1 in mouse aortic endothelial cells overexpressing catalase[J].Free Radic Biol Med,2011,51(1):97

[23]KIM JH,HONG YC.Interactive effect of smoking and NQO1 haplotypes on lung cancer risk[J].J Korean Med Sci,2015,30(3):221

[24]倪靜,秦麗娟,吳擁軍,等.肺癌組織中Nrf2、Keap1和NQO1蛋白的表達(dá)[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2012,47(4):456