2,6-二氰基-3-吡啶基-5-雄甾烯基苯胺對食管癌EC109細(xì)胞周期及凋亡的影響

石曉麗，徐曉微，秦甜甜，劉衛(wèi)華，張秀娟，周凱瑞，霍金玲，楊騰蛟，王 淙

鄭州大學(xué)藥學(xué)院 鄭州 450001

食管癌是世界最常見癌癥之一，主要包括鱗癌和腺癌兩種，在中國以鱗癌為主要發(fā)病類型，西方發(fā)達(dá)國家主要以腺癌為主[1-2]。為了治療這種癌癥，常使用吉西他濱、5-氟尿嘧啶和紫杉醇聯(lián)合化療，長期治療容易使患者產(chǎn)生耐藥，降低治療效果[3]。甾族化合物是一類重要的多環(huán)化合物，在維持人體功能、調(diào)節(jié)代謝等方面發(fā)揮著重要的作用。1994年，F(xiàn)otsis等[4]發(fā)現(xiàn)雌激素代謝產(chǎn)物2-甲氧基雌二醇能夠抑制血管生成而抑制腫瘤生長，這為抗癌藥物的研發(fā)提供了新思路：對甾體類化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造和修飾，獲得新型抗癌化合物。該實(shí)驗(yàn)旨在探討2,6-二氰基-3-吡啶基-5-雄甾烯基苯胺(簡稱4d)對食管癌EC109細(xì)胞的作用，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞和主要試劑化合物4d合成方法，碳譜、氫譜及質(zhì)譜分析方法見參考文獻(xiàn)[5]。4d溶解于二甲基亞砜(DMSO)中，化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。食管癌細(xì)胞株EC109、正常食管上皮細(xì)胞Het-1a由鄭州大學(xué)藥物研究院保存。RPMI 1640培養(yǎng)基及胰蛋白酶消化液(北京索萊寶公司)，標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清(以色列BI公司)，Bcl-2、Bax、Bid抗體(美國CST公司)，Mcl-1和β-actin抗體(南京恩晶生物科技有限公司)。凋亡檢測試劑盒、細(xì)胞周期檢測試劑(南京凱基生物科技有限公司)。

圖1 4d結(jié)構(gòu)式

1.2細(xì)胞培養(yǎng)EC109及Het-1a細(xì)胞在RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基中補(bǔ)充體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清。細(xì)胞在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2加濕環(huán)境中培養(yǎng)，2～3 d傳代1次，隔天更換RPMI 1640培養(yǎng)基，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3MTT法檢測細(xì)胞增殖抑制率分別收集2種細(xì)胞，計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。用RPMI 1640培養(yǎng)基調(diào)整每孔細(xì)胞數(shù)約3×103個，將細(xì)胞接種于96孔板中培養(yǎng)過夜。細(xì)胞貼壁后，分別加入0.40、0.80、1.60、3.25、6.25、12.50、25.00、50.00、100.00 μmol/L的化合物4d作為實(shí)驗(yàn)組，并設(shè)置陰性對照組和空白對照組，每組設(shè)置3個復(fù)孔。48 h或72 h后，每孔加入20 μL MTT，37 ℃孵育4 h，然后小心除去培養(yǎng)基并向每孔加入150 μL DMSO，置于搖床10 min使其充分溶解，酶標(biāo)儀測定570 nm處的吸光度(A)值。增殖抑制率=(對照孔A值-實(shí)驗(yàn)孔A值)/(對照孔A值-空白孔A值)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4細(xì)胞凋亡檢測將EC109細(xì)胞接種到6孔板中，加入含4d(0.0、0.5、2.0、4.0 μmol/L)的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，使用不含EDTA的胰蛋白酶消化，分別收集細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞密度為1×106mL-1，每孔細(xì)胞重懸于500 μL Binding Buffer中，加入5 μL Annexin V和5 μL PI避光染色15 min。采用流式細(xì)胞儀在1 h內(nèi)上機(jī)檢測和分析結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5細(xì)胞周期檢測含0.0、0.5、2.0、4.0 μmol/L的4d的培養(yǎng)基作用EC109 細(xì)胞24 h后，分別收集細(xì)胞并用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇在4 ℃過夜固定。小心吸去固定液，用PBS洗滌固定的細(xì)胞，加入400 μL的PI和100 μL的RNase A。樣品避光孵育30 min，并采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6細(xì)胞線粒體膜電位檢測使用JC-1染料測量線粒體膜電位。1×105個EC109細(xì)胞接種于96孔板中，孵育過夜后，細(xì)胞用4d(0.0、0.5、2.0或4.0 μmol/L)處理6 h，JC-1(5 mg/L)染色20 min后使用溫?zé)岬腞PMI 1640培養(yǎng)基洗去染料。染色的細(xì)胞通過高通量篩選系統(tǒng)成像。根據(jù)高通量篩選系統(tǒng)對采集到的熒光強(qiáng)度進(jìn)行量化統(tǒng)計(jì)，單體用488 nm波長激光(綠色)激發(fā)，而聚集體用561 nm波長激光(紅色)激發(fā)。紅色熒光代表JC-1聚合體減少，綠色熒光代表JC-1單體增加，結(jié)果用綠色與紅色細(xì)胞群的熒光強(qiáng)度比值即JC-1單體與聚合體的比值表示。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7Westernblot檢測Bcl-2家族蛋白的表達(dá)EC109細(xì)胞用4d(0.0、0.5、2.0或4.0 μmol/L)處理24 h，收集細(xì)胞后PBS清洗2遍，加入裂解液后于冰上裂解30 min，低溫離心機(jī)4 ℃離心收集上清，使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。加入6×Loading Buffer，100 ℃水浴變性10 min。通過SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。用含體積分?jǐn)?shù)0.5%Tween20和體積分?jǐn)?shù)5%脫脂牛奶的Tris緩沖鹽水(pH=7.8)在室溫下封閉2 h，然后在4 ℃與一抗孵育過夜。TBST洗膜3次，在室溫下溫育二抗2 h?；瘜W(xué)發(fā)光顯色，暗室曝光。以陰性對照組各蛋白的相對表達(dá)量為1，采用Image J分析各蛋白的相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。4d處理不同時間后 Het-1細(xì)胞、EC109細(xì)胞增殖抑制率的比較采用析因設(shè)計(jì)的方差分析；不同組間EC109細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞周期、線粒體膜電位及Bcl-2家族蛋白相對表達(dá)量的比較均采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 4d對Het-1細(xì)胞和EC109細(xì)胞增殖的影響結(jié)果見表1、2?？梢娀衔?d對食管癌細(xì)胞有明顯的增殖抑制作用。

F時間=43.073，P<0.001;F濃度=358.051，P<0.001;F交互=323.054，P<0.001

表2 4d處理不同時間后EC109細(xì)胞增殖抑制率的比較(n=3) %

F時間=40.608，P<0.001;F濃度=117.980，P<0.001;F交互=109.383，P<0.001

2.2 4d對EC109細(xì)胞凋亡的影響結(jié)果見表3。由表3可知，4d處理后EC109細(xì)胞凋亡率增加。

表3 各組EC109細(xì)胞凋亡率的比較 %

F=354.940,P=0.006;*：與陰性對照組相比，P<0.05

2.3 4d對EC109細(xì)胞周期的影響結(jié)果見表4。由表4可知，4d處理后的EC109細(xì)胞出現(xiàn)S期阻滯。

表4 各組EC109細(xì)胞周期的比較(n=3) %

*：與陰性對照組相比，P<0.05

2.4 4d對EC109細(xì)胞線粒體膜電位和Bcl-2家族蛋白表達(dá)的影響各組EC109細(xì)胞線粒體膜電位的比較見圖2及表5。Bcl-2家族蛋白的表達(dá)見圖3及表6。可知，4d可降低Mcl-1的表達(dá)水平。

A：陰性對照組；B：0.5 μmol/L 4d組；C：2.0 μmol/L 4d組；D：4.0 μmol/L 4d組圖2 各組EC109細(xì)胞線粒體膜電位的變化(×400)

組別n線粒體膜電位陰性對照組31．27±0．170．5μmol/L4d組32．47±0．372．0μmol/L4d組34．00±0．164．0μmol/L4d組36．20±0．45?

F=91.136,P=0.005;*：與陰性對照組相比，P<0.05

1：陰性對照組；2：0.5 μmol/L 4d組；3：2.0 μmol/L 4d組；4：4.0 μmol/L 4d組圖3 各組EC109細(xì)胞Bcl-2家族蛋白的表達(dá)

組別Mcl?1BaxBcl?20．5μmol/L4d組0．60±0．082．40±0．080．59±0．062．0μmol/L4d組0．41±0．08?2．93±0．050．24±0．044．0μmol/L4d組0．39±0．06?3．20±0．080．06±0．01F36．059475．704218．168P0．0040．0090．006

*：與0.5 μmol/L 4d組相比，P<0.05

3 討論

甾體類化合物對許多癌細(xì)胞具有廣譜的細(xì)胞毒性[6]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，化合物4d可以有效地抑制食管癌EC109細(xì)胞的增殖，且具有濃度依賴性和時間依賴性。實(shí)驗(yàn)也表明4d對正常的食管上皮細(xì)胞Het-1a有一定的細(xì)胞毒性。

越來越多的研究[7]表明Bcl-2家族在細(xì)胞凋亡方面具有重要作用，這些蛋白使線粒體功能障礙，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Huang等[8]發(fā)現(xiàn)僅具有Bcl-2細(xì)胞結(jié)構(gòu)域之一的Bcl-2家族的成員，是細(xì)胞凋亡的必需引發(fā)劑。一系列Bcl-2家族的抑制劑，如TW37和ABT737已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段[9-10]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)化合物4d能使Bcl-2家族中Mcl-1表達(dá)下降，這與線粒體功能障礙、線粒體膜電位改變的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。表明4d誘導(dǎo)EC109細(xì)胞凋亡與啟動Bcl-2家族介導(dǎo)的線粒體凋亡程序有關(guān)。

綜上所述，化合物4d可以體外抑制食管癌EC109細(xì)胞的增殖，抑制增殖的機(jī)制與細(xì)胞阻滯和細(xì)胞凋亡相關(guān)；進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的途徑是Bcl-2家族介導(dǎo)的細(xì)胞線粒體損傷。

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