OP16聯(lián)合雷帕霉素對人食管鱗癌裸鼠移植瘤生長和細胞凋亡的影響

李浩男，彭柯崢，師瑩瑩，劉小林，曹燕君，郝雨桐，覃佳寧，侯桂琴

鄭州大學藥學院臨床藥學系 鄭州 450001

食管鱗癌是我國常見的惡性腫瘤，早期診斷困難、侵襲性強、預后差、易耐藥的特點是其病死率居高不下的主要原因[1]。盡管近年來治療手段不斷進步，但是患者的5 a生存率仍然很低，因此尋找新的治療食管鱗癌的方法及開發(fā)新的抗食管鱗癌藥物就顯得非常急迫。冬凌草作為傳統(tǒng)中藥，對多種腫瘤尤其是消化道腫瘤具有良好的治療效果，而且較傳統(tǒng)化療藥物具有不良反應少等優(yōu)點，其化學成分主要包括冬凌草甲素、乙素、丙素等[2]。其中冬凌草甲素是冬凌草主要的抗腫瘤有效成分，通過阻滯細胞周期、誘導細胞凋亡和自噬等作用，對多種腫瘤均有抑制作用[3]。然而，冬凌草甲素水溶性較差，作用機制尚不完全明確，且抗腫瘤活性相對傳統(tǒng)化療藥物較差，這些缺點限制了冬凌草甲素的臨床應用[4]。OP16是本課題組所在的鄭州大學國家藥物關鍵制備技術教育部重點實驗室對冬凌草甲素進行結構改造得到的一系列小分子化合物之一，其理化性質更穩(wěn)定、抗腫瘤活性更強[5]。作者的前期研究[5]已證實OP16在體外能明顯抑制食管鱗癌細胞增殖，并能顯著抑制食管鱗癌細胞中Akt的磷酸化激活，因而與雷帕霉素在體外聯(lián)用時具有較強的協(xié)同作用。因此本研究擬通過建立食管鱗癌裸鼠移植瘤模型，對OP16與雷帕霉素單獨或聯(lián)合應用的抗腫瘤效果進行體內評價，并對可能的分子機制進行探討，為OP16作為一種抗腫瘤新藥的開發(fā)提供實驗和理論依據。

1 材料與方法

1.1材料食管鱗癌EC9706細胞購自中科院上海細胞庫；RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自以色列BI生物科技公司；雷帕霉素購自美國Sigma-Aldrich公司；SPF級BALB/c裸鼠(6周齡)購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司；PI3K p85α、PI3K p110α、p-Akt(Thr308)、p-Akt(Ser473)、p-mTOR(Ser2448)、mTOR和GAPDH兔抗人單克隆抗體均購自美國CST公司；TUNEL試劑盒購自美國Roche公司。

1.2細胞培養(yǎng)及動物飼養(yǎng)食管鱗癌EC9706細胞在含有體積分數10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，于37 ℃、含體積分數5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。裸鼠在鄭州大學藥學院動物中心無菌空氣層流室飼養(yǎng)，且保持恒溫(26～28 ℃)及恒濕(相對濕度40%～60%)。所有鼠籠、墊料、飼料及飲水全部經過高壓蒸汽滅菌處理。動物飼養(yǎng)過程完全符合SPF標準。

1.3成瘤實驗40只裸鼠適應性飼養(yǎng)7 d后，取對數生長期的EC9706細胞進行消化、離心、重懸、計數，調整細胞密度至2×107mL-1。裸鼠在無菌室內常規(guī)消毒后，于右前肢皮下接種0.2 mL的細胞懸液。接種成功后定期觀察小鼠的日常情況包括精神、飲食及排便等，稱重并用游標卡尺測定腫瘤的長徑(a)和短徑(b)，按以下公式計算腫瘤體積：V=0.5ab2。該組成瘤率為100%。

1.4裸鼠分組及治療當移植瘤體積達到60～80 mm3時，采用隨機數字表法將裸鼠分為4組，每組10只，分別為：對照組(尾靜脈注射生理鹽水，隔 d 1次)；OP16組(尾靜脈注射，20 mg/kg，隔d 1次)；雷帕霉素組(腹腔注射，50 μg/kg，隔d 1次)；聯(lián)合治療組，給藥方式及劑量分別同單獨治療組，2種藥物每d注射其中1種，輪流注射。給藥期間，每d觀察裸鼠飲食飲水、精神狀態(tài)和排便情況等，并用游標卡尺測量腫瘤大小。以生長時間為橫坐標，腫瘤體積為縱坐標，繪制腫瘤生長曲線。治療2周后麻醉處死小鼠，剝取瘤組織，稱重并拍照。

1.5各組腫瘤組織中細胞凋亡的TUNEL法檢測

將取出的腫瘤組織在40 g/L多聚甲醛中固定后進行石蠟包埋，然后按5 μm的厚度進行切片，使用TUNEL試劑盒對腫瘤組織中細胞凋亡情況進行檢測，實驗步驟按照試劑盒說明書進行操作。將切片在顯微鏡下進行觀察，正常細胞為藍色，細胞核內著棕黃色顆粒為TUNEL陽性細胞。每張切片選取5個視野(×400)，計數TUNEL陽性細胞數，計算TUNEL陽性率。

1.6各組腫瘤組織中PI3K/Akt/mTOR通路相關蛋白表達量的Westernblot檢測用含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的裂解液裂解腫瘤組織，提取總蛋白。BCA法測定蛋白濃度，上樣量均為30 μg。SDS-PAGE法分離蛋白，然后將蛋白轉移至硝酸纖維素膜。用含50 g/L脫脂奶粉的T-BST封閉2 h后，分別加入PI3K p85α、PI3K p110α、p-Akt(Thr308)、p-Akt(Ser473)、p-mTOR(Ser2448)、mTOR和GAPDH兔抗人單克隆抗體(按11 000稀釋)，4 ℃過夜。次日用PBST洗3次，10 min/次，隨后加入含二抗的T-BST(按110 000稀釋)，室溫封閉2 h。然后PBST洗3次，10 min/次。ECL超敏發(fā)光液孵育1 min后，暗室曝光。實驗重復3次，結果用Image J軟件進行統(tǒng)計。

1.7統(tǒng)計學處理采用SPSS 19.0進行分析，應用析因設計的方差分析對實驗數據進行處理，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 4組荷瘤裸鼠的腫瘤生長情況見圖1。在給藥期間，4組裸鼠飲食飲水及精神狀態(tài)良好，體重差異無統(tǒng)計學意義，無死亡出現(xiàn)。雖然治療期間OP16組、雷帕霉素組腫瘤體積仍在增大，但與對照組相比生長速度相對緩慢，而聯(lián)合治療組腫瘤組織則幾乎停止生長(P<0.01)。治療結束后OP16組、雷帕霉素組和聯(lián)合治療組的腫瘤質量分別為(0.510±0.100) g、(0.490±0.170) g和(0.170±0.050) g，與對照組(0.900±0.150) g比較均減小；且聯(lián)合治療組與OP16組和雷帕霉素組相比，腫瘤質量進一步減小(FOP16=17.562，F(xiàn)雷帕霉素=18.302，F(xiàn)交互=20.716，P<0.001)。

A:各組裸鼠腫瘤生長曲線；B：各組裸鼠處死后剝離的瘤組織圖1 OP16聯(lián)合雷帕霉素對腫瘤生長的影響

2.2 4組腫瘤組織中細胞凋亡情況比較見圖2。對照組TUNEL陽性率(5.800±0.520)%明顯小于OP16組(56.867±6.300)%、雷帕霉素組(21.733±1.880)%和聯(lián)合治療組(71.800±5.320)%，差異有統(tǒng)計學意義(FOP16=209.515，F(xiàn)雷帕霉素=230.235，F(xiàn)交互=445.186，P<0.001)；且聯(lián)合治療組與OP16組或雷帕霉素組相比，TUNEL陽性率更大(P<0.01)。

A：對照組；B：OP16組；C：雷帕霉素組；D：聯(lián)合治療組圖2 OP16聯(lián)合雷帕霉素對腫瘤組織中細胞凋亡的影響(DAB染色，×400)

2.3治療后各組腫瘤組織中相關蛋白表達情況見表1、圖3。

表1 治療后各組腫瘤組織中PI3K/Akt/mTOR通路相關蛋白表達量的比較(n=3)

1：對照組；2：OP16組；3：雷帕霉素組；4：聯(lián)合治療組圖3 OP16聯(lián)合雷帕霉素對腫瘤 組織中PI3K/Akt/mTOR通路相關蛋白表達的影響

3 討論

PI3K/Akt/mTOR是一條細胞內重要的信號轉導通路，且在多種腫瘤中都處于異常激活狀態(tài)[6]。其中，PI3K是一種胞內磷脂酰肌醇激酶，可使蛋白激酶Akt第308位上的蘇氨酸位點磷酸化而激活Akt，而活化的Akt可以通過磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)的第2 448位的絲氨酸位點激活mTOR，從而在細胞周期、細胞凋亡、細胞增殖等方面發(fā)揮重要作用[7]。mTOR是一種非典型絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在多種腫瘤包括食管鱗癌中均為異常激活狀態(tài)[8]。mTOR由mTORC1和mTORC2兩個復合物組成，其中mTORC1主要調控細胞生長和蛋白合成，mTORC2主要調控細胞凋亡[9]。雷帕霉素通過與FKBP-12結合形成復合物從而抑制mTOR通路，因此具有較好的抗腫瘤作用，其衍生物依維莫司等已被用于晚期腎細胞癌、乳腺癌等多種癌癥的治療[10]。作者的前期研究發(fā)現(xiàn)，食管鱗癌EC9706細胞中mTOR信號通路處于激活狀態(tài)[11]，并且雷帕霉素可以通過抑制mTOR信號通路從而抑制EC9706細胞的生長[12]。但后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，這些抑制劑在抑制mTOR從而產生抗腫瘤作用的同時，也能通過一些負反饋通路促進Akt的磷酸化激活[13]，Akt的激活對細胞增殖和凋亡有促進作用[14]，從而削弱了雷帕霉素及其衍生物的抗腫瘤活性。因此本研究擬建立人食管鱗癌裸鼠移植瘤模型，對OP16和雷帕霉素的聯(lián)用效果進行體內評價，并對二者聯(lián)用的分子機制進行進一步探討。

本研究結果顯示，雷帕霉素在單獨應用時，確實能使mTOR的表達及磷酸化受到抑制，因此可以抑制裸鼠移植瘤的生長；但與此同時，雷帕霉素也使PI3K的p85α和p110α亞基的表達升高，并促進Akt在Thr308位點及Ser473位點的磷酸化，這也是雷帕霉素單獨應用對細胞凋亡的影響較小的原因。然而OP16在單獨應用時，能夠有效地抑制PI3K的p85α和p110α亞基的表達，同時抑制Akt在Thr308位點及Ser473位點的磷酸化，因此可以抑制腫瘤生長并促進腫瘤組織中細胞凋亡的發(fā)生。當二者聯(lián)用時，OP16可以有效地抑制雷帕霉素引起的PI3K/Akt負反饋激活，且二者聯(lián)用可以協(xié)同抑制Akt下游的mTOR的表達及磷酸化，因此二者聯(lián)用可以有效地抑制裸鼠移植瘤的生長，并且促進裸鼠移植瘤中細胞凋亡的發(fā)生。

綜上所述，該研究通過體內實驗初步證實了OP16與雷帕霉素聯(lián)用具有較強協(xié)同抗腫瘤活性，并初步探明了二者協(xié)同作用的分子機制，為食管鱗癌治療提供了新的思路，并為OP16作為抗腫瘤注射劑的開發(fā)提供實驗基礎和理論依據。然而OP16的抗腫瘤機制并不完全明確，有待于進一步的臨床前和臨床試驗進行研究。

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