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    川藏公路拉薩-林芝沿線藏豬大腸桿菌血清型調(diào)查及耐藥性檢測(cè)

    2018-02-05 11:23:12王潤(rùn)錦馬金英
    養(yǎng)豬 2018年1期
    關(guān)鍵詞:公路沿線肉湯林芝

    王潤(rùn)錦,陳 羲,馬金英

    (1.西藏自治區(qū)山南市畜牧獸醫(yī)總站,西藏 山南 856100;2.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,西藏 拉薩 850009)

    大腸埃希氏菌(Escherichia coli)通常被稱為大腸桿菌,是人和動(dòng)物腸道共生菌,可以作為社區(qū)和農(nóng)場(chǎng)中各種細(xì)菌耐藥性發(fā)生情況的指標(biāo)菌,而藏豬主要分布于雅魯藏布江流域中游河谷區(qū)和藏東三江流域中游海拔為3 500 m左右的氣候條件惡劣的高原地帶,是我國(guó)唯一的高原豬種[1-2]。藏豬具有肉質(zhì)優(yōu)良、耐嚴(yán)寒、耐粗飼、抗逆性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。但隨著川藏公路拉薩-林芝沿線藏豬養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展,藏豬養(yǎng)殖初具規(guī)?;?,一些傳染性疾病也日漸嚴(yán)重,給養(yǎng)豬業(yè)造成不小經(jīng)濟(jì)損失。對(duì)藏豬源大腸桿菌和腸球菌開(kāi)展耐藥性調(diào)查及其耐藥機(jī)制研究,在獸醫(yī)及人醫(yī)領(lǐng)域均有重要的公共衛(wèi)生意義[3]。筆者于2016年8月對(duì)拉薩-林芝公路沿線12個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)藏豬采集直腸棉拭子共計(jì)1 200份,分離出了大腸桿菌,在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步做了菌株分離及耐藥性的檢測(cè),結(jié)果如下。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 試驗(yàn)菌株 拉薩-林芝公路沿線蔡公堂鄉(xiāng)、章多鄉(xiāng)、甲瑪鄉(xiāng)、工卡鎮(zhèn)、扎西崗鄉(xiāng)、日多鄉(xiāng)、加興鄉(xiāng)、金達(dá)鎮(zhèn)、巴河鎮(zhèn)、百巴鎮(zhèn)、更章門巴民族鄉(xiāng)、八一鎮(zhèn)為采樣點(diǎn),采集被檢藏豬直腸棉拭子1 200頭份,保存于1 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯的滅菌醫(yī)用配離心管,車載冰箱4℃保存。標(biāo)明樣品采集時(shí)間、地點(diǎn)、編號(hào)。

    采樣原則:每個(gè)采樣點(diǎn)分別采集1歲以上藏豬直腸棉拭子40頭份、斷奶仔藏豬60頭份。

    1.1.2 標(biāo)準(zhǔn)菌株 大腸桿菌(ATCC25922)購(gòu)于杭州天和微生物試劑有限公司。

    1.1.3 細(xì)菌培養(yǎng)基及配制 普通營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基購(gòu)于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。稱取營(yíng)養(yǎng)肉湯粉末18 g,加入蒸餾水或去離子水1 L,攪拌加熱煮沸至完全溶解,分裝三角瓶,121℃高壓滅菌15 min,待冷至常溫,備用。

    麥康凱瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。稱取麥康凱瓊脂粉末55 g,加入蒸餾水或去離子水1 L,攪拌加熱煮沸至完全溶解,分裝三角瓶,121℃高壓滅菌15 min。待培養(yǎng)基冷至50~55℃傾注滅菌平皿,待凝固后,備用。

    科瑪嘉?大腸桿菌顯色培養(yǎng)基(ECC)購(gòu)于博賽生物技術(shù)股份有限公司。取瓶?jī)?nèi)干粉37.3 g溶于1 000 mL去離子水的潔凈三角瓶中,充分?jǐn)嚢杌靹?,高壓滅菌?21℃,15 min)。加熱后的培養(yǎng)基冷卻至45~50℃,輕輕地?fù)u動(dòng)均勻,傾注平皿,使其凝固,晾干備用。

    伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基(EMB)購(gòu)于青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。稱取伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基粉末42.5 g,加熱溶解于1 000 mL蒸餾水中,121℃高壓滅菌15 min,備用。

    LB營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板購(gòu)于上海凡儀科技發(fā)展有限公司。

    1.1.4 大腸桿菌API-20E生化鑒定試紙條 生化反應(yīng)鑒定試紙條API-20E購(gòu)于法國(guó)梅里埃生物技術(shù)有限公司,用于腸桿菌屬細(xì)菌的快速生化鑒定。

    1.2 方法

    1.2.1 大腸桿菌的分離和初步鑒定 用無(wú)菌接種環(huán)蘸取少量被檢藏豬直腸棉拭子的營(yíng)養(yǎng)肉湯,劃線接種在麥康凱瓊脂平板上,37℃恒溫培養(yǎng)16~18 h,挑取紅色或粉紅色的單菌落(每個(gè)樣本挑取一個(gè)),在LB肉湯中37℃培養(yǎng)18 h左右,取菌液劃線接種于ECC顯色培養(yǎng)基,在37℃培養(yǎng)18~24 h,觀察菌落形態(tài),呈現(xiàn)光滑、邊緣整齊、直徑為1~2 mm的藍(lán)色或綠色圓形菌落可初步判斷為大腸桿菌[4]。

    1.2.2 大腸桿菌API-20E試紙條的生化鑒定 將少量可疑細(xì)菌接種于API-20E試紙條,培養(yǎng)20 h左右,加入相應(yīng)顯色試劑后觀察其顏色的變化,根據(jù)說(shuō)明表判讀反應(yīng),參照分析圖索引和APLAB PLus軟件得到鑒定結(jié)果。

    1.2.3 致病性試驗(yàn) 將生化反應(yīng)特征符合大腸桿菌的菌株接種營(yíng)養(yǎng)肉湯,37℃培養(yǎng)18 h后,分別腹腔接種小白鼠,0.2 mL/只,觀察存活情況。剖檢死亡小白鼠,取其臟器用伊紅美蘭培養(yǎng)基進(jìn)行種菌回收試驗(yàn),其培養(yǎng)特性、形態(tài)、染色反應(yīng)均符合大腸桿菌,判定為致病性大腸桿菌[3,5]。

    1.2.4 大腸桿菌O抗原血清型鑒定 將經(jīng)分離鑒定為致病性大腸桿菌的菌株接種于普通瓊脂培養(yǎng)基上,進(jìn)行純培養(yǎng),用少量0.5%石炭酸生理鹽水洗下菌落,制成濃稠菌懸液,121℃高壓滅菌2 h,破壞K抗原,冷卻后用微量移液器吸取25 μL與等量標(biāo)準(zhǔn)血清進(jìn)行玻片凝集試驗(yàn),5 min內(nèi)出現(xiàn)明顯凝集者為陽(yáng)性反應(yīng),同時(shí)以生理鹽水作對(duì)照,觀察有無(wú)自凝現(xiàn)象[5-6]。

    1.3 藥敏試驗(yàn)

    青霉素、慶大霉素、諾氟沙星、左氟沙星、阿莫西林、卡那霉素、環(huán)丙沙星、氟苯尼考、先鋒霉素9種藥,按照常規(guī)藥敏紙片擴(kuò)散法進(jìn)行操作,并根據(jù)抑菌圈直徑(Ф)判定藥物敏感性,Ф≥20 mm為高度敏感,15 mm≤Ф<20 mm為中度敏感,Ф<15 mm為耐藥。

    2 結(jié)果

    2.1 分離菌株鑒定結(jié)果

    從拉薩-林芝公路沿線蔡公堂鄉(xiāng)、章多鄉(xiāng)、甲瑪鄉(xiāng)、工卡鎮(zhèn)、扎西崗鄉(xiāng)、日多鄉(xiāng)、加興鄉(xiāng)、金達(dá)鎮(zhèn)、巴河鎮(zhèn)、百巴鎮(zhèn)、更章門巴民族鄉(xiāng)、八一鎮(zhèn)采集被檢藏豬直腸棉拭子1 200頭份的樣品中,共分離鑒定出99株致病大腸桿菌菌株。其培養(yǎng)特性及染色、生化反應(yīng)特征為:革蘭氏染色均為革蘭氏陰性桿菌;在普通肉湯中呈均勻混濁,液面有菌膜,管底有白色沉淀,振蕩呈云霧狀散開(kāi);普通瓊脂平板上生長(zhǎng)呈灰白色、半透明、表面隆起、光滑濕潤(rùn)、邊緣整齊的圓形菌落,直徑1~3 mm;麥康凱培養(yǎng)基上生長(zhǎng)呈粉紅色菌落;ECC培養(yǎng)呈藍(lán)色;伊紅美蘭培養(yǎng)基上生長(zhǎng)呈紫黑色帶金屬光澤菌落;API-20E試紙條的生化鑒定為大腸桿菌。

    2.2 菌株血清型鑒定結(jié)果

    用50種O抗原血清對(duì)99株分離株進(jìn)行血清型鑒定,除14株未鑒定出血清型外,其余85株血清型 分 屬 于 O21(15/85)、O9(12/85)、O101(9/85)、O18(9/85)、O85(9/85)等22個(gè)血清型(表1)。其中O21、O101、O18、O9、O85有54株,共占所鑒定分離菌株的63.53%(54/85),這幾種血清型均為拉薩-林芝公路沿線目前流行的主要血清型。

    表1 豬大腸桿菌分離菌株血清型鑒定結(jié)果

    2.3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

    藥敏試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),拉薩-林芝公路沿線蔡公堂鄉(xiāng)、章多鄉(xiāng)、甲瑪鄉(xiāng)、工卡鎮(zhèn)、扎西崗鄉(xiāng)、日多鄉(xiāng)、加興鄉(xiāng)、金達(dá)鎮(zhèn)、巴河鎮(zhèn)、百巴鎮(zhèn)、更章門巴民族鄉(xiāng)、八一鎮(zhèn)不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)分離獲得的藏豬大腸桿菌致病菌株對(duì)藥物的敏感性差異較小。對(duì)卡那霉素、環(huán)丙沙星、氟苯尼考、先鋒霉素4種藥高度敏感,對(duì)慶大霉素、諾氟沙星、左氟沙星、阿莫西林中度敏感,對(duì)青霉素耐藥。其中77.13%的菌株對(duì)青霉素耐藥,對(duì)慶大霉素、諾氟沙星、左氟沙星、阿莫西林耐藥的菌株分別為19.47%、18.10%、17.77%和15.39%。

    3 討論

    大腸桿菌引起的仔豬下痢仍然是導(dǎo)致藏豬養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟(jì)效益較差的重要原因之一,長(zhǎng)期困擾著藏豬養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。在當(dāng)?shù)孬F醫(yī)指導(dǎo)下,經(jīng)藥物治療后雖然仔豬死亡率不高,但常引起發(fā)病仔豬生長(zhǎng)發(fā)育遲緩、生產(chǎn)能力低下,給拉薩-林芝公路沿線藏豬養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

    77.13%的菌株對(duì)青霉素耐藥,說(shuō)明拉薩-林芝公路沿線藏農(nóng)牧民經(jīng)常盲目給發(fā)病豬使用青霉素,致使大腸桿菌產(chǎn)生耐藥。對(duì)發(fā)病藏豬,在確診的基礎(chǔ)上,與相關(guān)教學(xué)科研單位協(xié)作,通過(guò)藥敏試驗(yàn),有目的、有針對(duì)性地用藥,且用藥應(yīng)有足夠療程和劑量,盡量減少耐藥菌株產(chǎn)生[5,7]。

    選擇適合本地血清型的大腸桿菌疫苗,方能有效預(yù)防本病發(fā)生。在血清型鑒定中發(fā)現(xiàn),O21、O101、O18、O9、O85有 54株,共占所鑒定分離菌株的 63.53%(54/85),即這幾種血清型是拉薩-林芝公路沿線目前流行的主要血清型。不同區(qū)域流行菌株血清型差異較大,而且同一藏豬養(yǎng)殖較為集中的鄉(xiāng)鎮(zhèn)也存在多種血清型,因此,在大腸桿菌的免疫預(yù)防中,應(yīng)充分考慮其血清型的多樣性、易變性[7],尤其是藏豬養(yǎng)殖較為集中的鄉(xiāng)鎮(zhèn)最好每年進(jìn)行一次血清分型鑒定,以便有針對(duì)性地進(jìn)行免疫。

    [1]強(qiáng)巴央宗,謝莊,田發(fā)益.高原藏豬現(xiàn)狀與保種策略[J].中國(guó)畜牧雜志,2001,37(6):46-47.

    [2]唐建華,馮靜,陳曉英,等.藏豬種質(zhì)資源保護(hù)與利用研究[J].養(yǎng)豬,2016(1):68-70.

    [3]陳溥言.獸醫(yī)傳染病學(xué)[M].第6版.北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2016:108-117.

    [4]李鵬.藏豬源大腸桿菌和腸球菌耐藥性調(diào)查及其耐藥機(jī)制的研究[D].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué),2015.

    [5]謝永平,楊威,陳澤祥,等.廣西地區(qū)豬大腸桿菌血清型調(diào)查及耐藥性檢測(cè)[J].廣西農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,41(4):380-382.

    [6]陸承平.獸醫(yī)微生物學(xué)[M].第5版.北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2013:78-86.

    [7]嚴(yán)亮.大腸桿菌多重耐藥株的體外誘導(dǎo)初步研究[J].畜牧與飼料科學(xué),2015,36(4):15-17.

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