禾谷鐮孢碳源代謝調(diào)控因子FgCreA的功能

侯瑞，王晨芳

?

禾谷鐮孢碳源代謝調(diào)控因子FgCreA的功能

侯瑞1，王晨芳2

（1貴州大學(xué)林學(xué)院，貴陽 550025；2西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，陜西楊凌 712100）

【目的】敲除禾谷鐮孢（）中碳源代謝調(diào)控因子FgCreA，并對其營養(yǎng)生長、有性生殖和致病力等方面進(jìn)行研究，為研究禾谷鐮孢中碳源代謝機(jī)制提供依據(jù)?！痉椒ā扛鶕?jù)酵母數(shù)據(jù)庫SGD和NCBI數(shù)據(jù)庫中的序列，利用釀酒酵母中碳源代謝調(diào)控因子Mig1確定禾谷鐮孢中的碳源調(diào)控因子FgCreA；在NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索其他物種中碳源代謝調(diào)控蛋白，使用ClustalW2軟件進(jìn)行多重序列比對，并用MEGA5軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，同時在InterProScan網(wǎng)站上預(yù)測其蛋白結(jié)構(gòu)域；在NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索與禾谷鐮孢碳源吸收相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因和真菌毒素DON生物合成的相關(guān)基因，調(diào)取起始密碼子上游1 000 bp的片段，預(yù)測基因結(jié)合位點位置；用Primer5軟件設(shè)計引物，利用Split-PCR和PEG介導(dǎo)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法進(jìn)行基因敲除，并通過PCR和Southern blot驗證獲得基因敲除突變體。根據(jù)突變體營養(yǎng)生長、有性生殖和致病力等方面的變化分析的功能。【結(jié)果】通過生物信息學(xué)方法，明確禾谷鐮孢中只有一個碳源代謝調(diào)控因子基因(FGSG_09715)，氨基酸序列416 aa，共包含兩個保守的C2H2鋅指結(jié)構(gòu)區(qū)域。FgCreA同源蛋白在各類真菌中均存在一定程度的同源性，具有較高的保守性。禾谷鐮孢碳源吸收相關(guān)結(jié)構(gòu)基因（、、、、）和真菌毒素DON生物合成相關(guān)基因（、、、、、、、、、）啟動子區(qū)均含有DNA結(jié)合位點。采用Split-PCR技術(shù)和PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，通過PCR和Southern blot獲得并驗證了兩個基因敲除突變體。表型觀察發(fā)現(xiàn)，突變體的生長速度與野生型相比下降90%；分生孢子形態(tài)正常，但產(chǎn)孢量與野生型相比降低88%；有性生殖階段，突變體可以產(chǎn)生正常的子囊殼、子囊和子囊孢子，但需要比野生型長20—28 d；突變體對鈉鹽較敏感，侵染小麥穗不發(fā)病。【結(jié)論】獲得禾谷鐮孢碳代謝調(diào)控因子FgCreA敲除突變體，明確FgCreA參與營養(yǎng)生長和有性生殖，并能夠影響致病過程。但是否影響相關(guān)結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄水平和DON生物合成仍需進(jìn)一步驗證。

禾谷鐮孢；；基因敲除；表型；碳源代謝

0 引言

【研究意義】小麥赤霉?。‵usarium head blight，F(xiàn)HB）近年來已成為世界性病害，造成小麥大面積減產(chǎn)[1]。小麥赤霉病的主要致病菌為禾谷鐮孢（）[2-4]，其不僅可以影響小麥產(chǎn)量，還可產(chǎn)生真菌毒素脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）和玉米烯酮（zearalenone，ZEA）等[5-6]，嚴(yán)重影響小麥的品質(zhì)。近年來，禾谷鐮孢全基因組測序的工作已經(jīng)完成[7]，目前已經(jīng)開始進(jìn)行基因組[8]、蛋白質(zhì)組[9]、轉(zhuǎn)錄組[10-11]和代謝組學(xué)[12]等方面的研究。碳源代謝作為真菌生長發(fā)育重要的代謝途徑之一，其代謝機(jī)制對于生長發(fā)育、次生代謝產(chǎn)物、抗病性等方面都具有重要作用[13]。研究禾谷鐮孢碳源代謝調(diào)控因子基因的功能，明確其在生長發(fā)育階段和致病力方面的作用，對于研究禾谷鐮孢中碳源代謝機(jī)制具有至關(guān)重要的意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】微生物可以利用多種碳源物質(zhì)，但當(dāng)生長環(huán)境中存在碳源葡萄糖時，真菌會首先使用葡萄糖作為碳源，因此葡萄糖被稱為優(yōu)先碳源。當(dāng)生長環(huán)境中缺少葡萄糖時，其他碳源如半乳糖、蔗糖、麥芽糖和木聚糖等就會被吸收和利用，這些碳源被稱為次級碳源[14]。在酵母和絲狀真菌中，優(yōu)先碳源葡萄糖的存在會抑制吸收次級碳源的相關(guān)結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，故葡萄糖抑制也被稱為碳代謝抑制（carbon catabolite repression，CCR）[13]。碳源代謝調(diào)節(jié)機(jī)制就是使葡萄糖在生長環(huán)境中能夠被優(yōu)先吸收和利用，如果生長環(huán)境中沒有葡萄糖，酵母和絲狀真菌就可以選擇性地吸收和利用次級碳源。這種調(diào)節(jié)機(jī)制可以確保許多編碼酶類和通透酶類的結(jié)構(gòu)基因能夠被激活表達(dá)以吸收和利用次級碳源[15]。在酵母和絲狀真菌中，碳源代謝受Mig/CreA轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，多數(shù)結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄可被Mig/CreA轉(zhuǎn)錄因子激活。Mig/CreA轉(zhuǎn)錄因子含有兩個Cys2/Cys2-鋅指結(jié)構(gòu)，能夠識別目標(biāo)基因啟動子序列中DNA序列5′-SYGGRG-3′（其中，S代表C、G，Y代表C、T，R代表A、G）[16]。釀酒酵母（）中，葡萄糖抑制可被碳源代謝調(diào)節(jié)因子Mig1和Mig2調(diào)控，當(dāng)有葡萄糖存在時，與碳源代謝相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因，如、、和等，其轉(zhuǎn)錄水平都會受到抑制[17-18]。Mig1能夠結(jié)合碳源代謝相關(guān)結(jié)構(gòu)基因的啟動子區(qū)，與碳源共抑制因子Ssn6和Tup1形成復(fù)合體抑制碳源代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[19-21]。Mig1的活性受到蛋白激酶Snf1/Snf4的調(diào)節(jié)，當(dāng)環(huán)境中葡萄糖含量較高時，Mig1蛋白會被去磷酸化且定位于細(xì)胞核，抑制其他結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)葡萄糖含量較低時，Mig1蛋白會被迅速磷酸化并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)中[22]。然而的缺失，并沒有完全消除葡萄糖抑制機(jī)制，例如轉(zhuǎn)錄水平依然被抑制?，F(xiàn)已研究發(fā)現(xiàn)，Mig2作為另一碳源代謝因子也參與了調(diào)節(jié)，起著次要作用[23]。博伊丁假絲酵母（）中，葡萄糖能夠完全抑制甲醇誘導(dǎo)基因的表達(dá)，但基因敲除突變體卻能加強(qiáng)甲醇誘導(dǎo)的編碼醇氧化酶的表達(dá)，不過基因敲除突變體在各種碳源培養(yǎng)基中并沒有生長變化[24]。尖鐮孢（）中，CreA同源蛋白Cre1能夠抑制細(xì)胞壁降解酶CWDEs和吸收C2關(guān)鍵酶的轉(zhuǎn)錄水平[25]。構(gòu)巢曲霉（）中，CCR同樣可被轉(zhuǎn)錄因子CreA調(diào)控。在葡萄糖存在的情況下，編碼木聚糖酶、纖維素酶和阿拉伯糖酶等酶類的結(jié)構(gòu)基因會被抑制轉(zhuǎn)錄。CreA能夠直接結(jié)合木聚糖酶編碼基因和啟動子區(qū)來調(diào)節(jié)其表達(dá)[26]。此外，碳源代謝因子還參可與次生代謝產(chǎn)物的合成[27-28]。構(gòu)巢曲霉中，青霉素合成相關(guān)基因能夠被CreA抑制[27]。在藤倉赤霉（）中，許多赤霉素相關(guān)基因中都能找到潛在的CreA結(jié)合位點。說明可能參與了額外的激素水平的調(diào)節(jié)[28]?！颈狙芯壳腥朦c】禾谷鐮孢中碳源代謝調(diào)控因子編碼基因為（FGSG_09715）。碳源代謝是微生物生長的重要代謝途徑，但在禾谷鐮孢中尚未報道過碳源代謝調(diào)控因子的功能研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】利用同源重組和原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化等手段，獲得禾谷鐮孢的敲除突變體，鑒定該基因可參與調(diào)控禾谷鐮孢的營養(yǎng)生長、有性生殖和致病力等方面，為禾谷鐮孢中碳源代謝機(jī)制的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗于2014—2016年在西北農(nóng)林科技大學(xué)西農(nóng)普度聯(lián)合中心完成。

1.1 材料

1.1.1 菌株和試劑 禾谷鐮孢野生型PH-1菌株[29]、突變體菌株、質(zhì)粒pCB1003、載體PFL2和菌株DH10B等均保存于西北農(nóng)林科技大學(xué)西農(nóng)普度聯(lián)合中心實驗室。Tap酶和限制性內(nèi)切酶購于Fermentas公司，DNA膠回收試劑盒購于Bio-Teke公司，小量質(zhì)粒提取試劑盒購于OMEGA公司，DNA poly I klenow試劑盒購于Promega公司，其他常用試劑均為國內(nèi)采購。

1.1.2 培養(yǎng)基和溶液 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）培養(yǎng)基：PDA粉（國產(chǎn)）38 g·L-1；羥甲基化纖維素（carboxymethylcellulose，CMC）培養(yǎng)基：羥甲基化纖維素（低黏度，sigma公司）15 g·L-1，硝酸銨1g·L-1，磷酸二氫鉀1 g·L-1，七水硫酸鎂0.5 g·L-1，酵母提取物1g·L-1； YEPD（yeast extract peptone dextrose）液體培養(yǎng)基：酵母提取物3 g·L-1，蛋白棟10 g·L-1，葡萄糖20 g·L-1；胡蘿卜培養(yǎng)基：100 g·L-1胡蘿卜（用榨汁機(jī)榨成汁），瓊脂粉10 g。保存于室溫。

1×STC緩沖液、PTC緩沖液、TB3液體培養(yǎng)基、Bottom培養(yǎng)基/Top培養(yǎng)基、燕麥培養(yǎng)基、LB液體/固體培養(yǎng)基等具體配方詳見文獻(xiàn)[29]。1.2 mol·L-1KCl溶液、原生質(zhì)體緩沖液（酶解液）、CTAB抽提液、southern變性轉(zhuǎn)移液、southern中和液，20×SSC、50% PEG3350等主要溶液配方詳見文獻(xiàn)[30]。

1.2 氨基酸序列獲得與分析、結(jié)構(gòu)域預(yù)測及結(jié)合位點位置查找

從酵母數(shù)據(jù)庫（SGD: http://www.yeastgenome. org/）中得到釀酒酵母的Mig1蛋白序列，然后利用NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行蛋白序列比對，找到禾谷鐮孢中Mig1/CreA蛋白同源序列，之后進(jìn)行反向查找，最終確定禾谷鐮孢中CreA同源蛋白基因號和氨基酸序列。從NCBI數(shù)據(jù)庫或者真菌數(shù)據(jù)庫中獲得釀酒酵母、裂殖酵母（）、玉米黑粉菌（）、粗糙脈孢（）、稻瘟菌（）、構(gòu)巢曲霉、米曲霉（）、棒曲霉（）、禾谷鐮孢、擬輪枝鐮孢（）、尖鐮孢等碳源代謝調(diào)節(jié)因子蛋白序列，利用MEGA軟件進(jìn)行病原真菌碳源代謝調(diào)節(jié)因子蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建。并用InterProScan（http://www.ebi.ac.uk/interpro/）數(shù)據(jù)庫對其結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測。通過NCBI數(shù)據(jù)庫查找禾谷鐮孢真菌毒素DON生物合成相關(guān)基因家族主要基因和碳源吸收相關(guān)基因和以及CWDEs基因。下載相關(guān)基因啟動子區(qū)1 000 bp，查找基因結(jié)合位點5′-SYGGRG-3′（其中，S代表C、G，Y代表C、T，R代表A、G）。

1.3 重組片段的擴(kuò)增和轉(zhuǎn)化子的篩選

利用Split-PCR的方法進(jìn)行基因序列重組，之后進(jìn)行禾谷鐮孢野生型PH-1原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，用潮霉素（）抗性進(jìn)行初步篩選，提取初步篩選的轉(zhuǎn)化子DNA，利用4對引物進(jìn)行PCR驗證，分別為1：H852-F+H850-R，2：FgCREA-JF+H855-R，3：H856- F+FgCREA-JR以及4：FgCREA-OF+FgCREA-OR，獲得PCR驗證的敲除轉(zhuǎn)化子。根據(jù)目的基因的DNA序列以及敲除后的預(yù)設(shè)DNA序列選取限制性內(nèi)切酶Ⅰ進(jìn)行Southern blot驗證。Split-PCR和Southern blot的具體試驗方法參照文獻(xiàn)[31]。將含有的互補(bǔ)載體轉(zhuǎn)入PCR驗證的敲除轉(zhuǎn)化子原生質(zhì)體中，利用新潮霉素（）抗性進(jìn)行初步篩選，觀察表型是否能夠恢復(fù)（表1）。

1.4 禾谷鐮孢相關(guān)菌株表型分析

生長速率測定：將活化相同天數(shù)的野生型菌株和突變體菌株的菌餅接種至PDA固體培養(yǎng)基中，將菌餅正面朝下接到90 mm培養(yǎng)皿中心位置，各做5個重復(fù)。倒置培養(yǎng)皿于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，測量菌落半徑并拍照。

菌落邊緣菌絲形態(tài)的觀察：將15 ml 1/2 CM固體培養(yǎng)基倒至裝有載玻片的90 mm無菌玻璃皿內(nèi)。接種小塊菌株于凝固載玻片的兩端。各做5個重復(fù)。25℃恒溫培養(yǎng)16—24 h（根據(jù)菌株的生長速度決定），使菌絲剛好長到載玻片的邊緣位置。用無菌刀片將載玻片周圍培養(yǎng)基劃掉，將載玻片取出。在顯微鏡下進(jìn)行觀察，微分干涉照相。

表1 禾谷鐮孢FgCREA基因敲除和互補(bǔ)所用引物

產(chǎn)孢量測定：將活化相同天數(shù)的野生型菌株和突變體菌株用打孔器在菌落邊緣打孔。轉(zhuǎn)移一塊菌餅至裝有50 ml CMC培養(yǎng)基的150 ml三角瓶中。各做5個重復(fù)。在25℃恒溫?fù)u床中，175 r/min培養(yǎng)5 d，收集濾液用血球計數(shù)板計數(shù)CMC濾液中分生孢子的濃度。

分生孢子、分生孢子萌發(fā)形態(tài)觀察：分生孢子觀察時，直接吸取菌株CMC培養(yǎng)液，置于顯微鏡下觀察分生孢子形態(tài)并進(jìn)行微分干涉照相。分生孢子萌發(fā)觀察時，首先收集CMC培養(yǎng)液中的分生孢子，然后轉(zhuǎn)移分生孢子至150 ml三角瓶（內(nèi)含50 ml YEPD）中。在25℃恒溫?fù)u床中，175 r/min培養(yǎng)12 h后用顯微鏡觀察并進(jìn)行微分干涉照相。

有性生殖檢測：將活化相同天數(shù)野生型菌株、突變體菌株的菌落邊緣菌餅接種至胡蘿卜培養(yǎng)基的中心位置，各做5個重復(fù)。在25℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d后加入0.1% Tween-20濕潤氣生菌絲，使其貼伏于培養(yǎng)基表面，晾干。在黑光燈﹕黑暗=12 h﹕12 h，25℃條件下繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)，如果培養(yǎng)皿中有氣生菌絲生長出來則要及時壓（操作同上一步）。4周后對培養(yǎng)皿進(jìn)行拍照，在顯微鏡下觀察壓開的子囊殼內(nèi)的子囊及子囊孢子形態(tài)。

過氧化氫和氯化鈉壓力篩選：分別將活化相同天數(shù)的野生型菌株和突變體菌株的菌餅接到含0.03% H2O2、0.7 mol·L-1NaCl的PDA平板兩側(cè)，各做5個重復(fù)。25℃恒溫培養(yǎng)6 d后，觀察菌落生長情況，并照相。

致病力檢測：分別收集野生型菌株和突變體菌株的分生孢子懸浮液，然后將分生孢子懸浮液濃度調(diào)制（1.5—2.0）×105個孢子/ml，接種揚(yáng)花期小麥感病品種Norm，各做15個重復(fù)，保濕48 h，兩周后觀察致病情況。

2 結(jié)果

2.1 禾谷鐮孢FgCreA序列分析和相關(guān)基因啟動子區(qū)FgCREA結(jié)構(gòu)位點預(yù)測

從酵母數(shù)據(jù)庫中獲得已經(jīng)報道的釀酒酵母碳源代謝因子Mig1的氨基酸序列，利用NCBI BLASTP數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）選定生物名稱為禾谷鐮孢PH-1（taxid:569360），得到一個同源性最高（73%）的基因FGSG_09715（XP_011327987），氨基酸序列416 aa。對預(yù)測的禾谷鐮孢FgCreA轉(zhuǎn)錄因子FGSG_09715基因蛋白序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析（http://www.ebi.ac.uk/interpro/），發(fā)現(xiàn)具有兩個鋅指結(jié)構(gòu)（IPR013087，66-86；IPR013087，94-116）（圖1-a）。利用MEGA軟件進(jìn)行碳源代謝調(diào)節(jié)因子在真菌中的同源性分析。通過比對結(jié)果可以看出，碳源代謝調(diào)節(jié)因子在各類真菌中存在較高程度的同源性（圖1-b）。同時，預(yù)測了在禾谷鐮孢真菌毒素DON生物合成家族和碳源吸收相關(guān)結(jié)構(gòu)基因啟動子區(qū)的DNA結(jié)合位點，結(jié)果表明相關(guān)基因啟動子區(qū)域均有潛在的結(jié)合位點（表2）。

2.2 FgCREA基因敲除轉(zhuǎn)化子與互補(bǔ)菌株的篩選和驗證

通過Split-PCR的方法構(gòu)建的重組片段，然后轉(zhuǎn)入禾谷鐮孢野生型菌株P(guān)H-1的原生質(zhì)體中，通過潮霉素（）抗性篩選得到轉(zhuǎn)化子。對篩選得到的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行分子水平驗證（圖2-b），同時利用Southern blot對PCR驗證獲得的敲除轉(zhuǎn)化子進(jìn)一步驗證，獲得2個基因敲除突變體（圖2-d）。同時，克隆并構(gòu)建互補(bǔ)載體Com-CREA，轉(zhuǎn)化到Southern blot驗證后的敲除突變體原生質(zhì)體中，但由于敲除突變體生長速率太慢，得到的原生質(zhì)體數(shù)量太少，目前并沒有得到互補(bǔ)菌株。

a：禾谷鐮孢FgCreA與不同物種中碳源調(diào)節(jié)因子蛋白的鋅指結(jié)構(gòu)示意圖The zinc finger structure between FgCreA and CreA homologs from various fungi；b：禾谷鐮孢FgCreA與不同物種中碳源調(diào)節(jié)因子蛋白的進(jìn)化樹分析Phylogenetic analysis of FgCreA and CreA homologs from various fungi

表2 FgCREA在DON生物合成TRI家族主要基因及碳源吸收相關(guān)基因啟動子區(qū)潛在結(jié)合位點

結(jié)合位點5′-SYGGRG- 3′binding site 5′-SYGGRG- 3′

a：FgCREA基因敲除原理Schematic diagrams for FgCREA gene knockout；b：陽性轉(zhuǎn)化子的PCR驗證PCR screening for FgCREA mutants；c：FgCREA基因敲除Southern驗證原理FgCREA gene knockout construct；d：分子驗證轉(zhuǎn)化子的Southern驗證Southern blot verification for FgCREA mutants

2.3 FgCREA的缺失對營養(yǎng)生長的影響

基因敲除突變體在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d后，發(fā)現(xiàn)突變體菌落生長速率比野生型PH-1菌株減慢了90%左右（圖3-a、表3）。菌落邊緣觀察發(fā)現(xiàn)，突變體在72 h時氣生菌絲相比野生型變得致密且分枝變多（圖3-b）。結(jié)果表明，對菌絲的正常生長是必需的，但應(yīng)該只是嚴(yán)重影響生長速率，并不影響菌絲的形態(tài)。

圖3 FgCREA基因敲除突變體的菌落形態(tài)和菌絲生長

表3 FgCREA基因敲除突變體的生長速率及產(chǎn)孢量

數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（=3），數(shù)據(jù)后不同字母表示在＜0.05水平差異顯著（LSD法）

Data are average±SD (=3), different letters mean significant difference at＜0.05 level (LSD method)

2.4 FgCREA基因缺失對孢子萌發(fā)速率的影響

血球計數(shù)板統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，突變體分生孢子的產(chǎn)量大約為野生型PH-1菌株的12%（表3）。觀察突變體分生孢子產(chǎn)生過程，發(fā)現(xiàn)的缺失并未使產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)受到影響，產(chǎn)孢量下降應(yīng)該是由于突變體生長緩慢造成的。觀察還發(fā)現(xiàn)突變體分生孢子形態(tài)與野生型PH-1菌株的基本一致。對突變體分生孢子萌發(fā)12 h的菌絲形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，雖然其萌發(fā)速率降低，但孢子頂端、基部和中間的細(xì)胞也均會形成芽管（圖4）。

圖4 FgCREA基因敲除突變體分生孢子形態(tài)（a）和分生孢子萌發(fā)形態(tài)（b）

2.5 FgCREA基因缺失對有性生殖的影響

將活化好的突變體和野生型PH-1菌株接種于胡蘿卜培養(yǎng)基25℃恒溫培養(yǎng)10 d后（突變體生長速率過慢），使用0.1%的tween-20處理菌絲，之后以12 h黑光燈﹕12 h黑暗25℃誘導(dǎo)培養(yǎng)28 d，觀察并照相。結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變體只能產(chǎn)生較少數(shù)量的子囊殼（圖5-a）。壓開子囊殼，觀察子囊以及子囊孢子的形態(tài)，發(fā)現(xiàn)的缺失并未影響子囊和子囊孢子的形成（圖5-b）。

2.6 FgCREA基因缺失對細(xì)胞滲透壓的影響

通過壓力篩選（圖6），發(fā)現(xiàn)H2O2壓力脅迫對于突變體的相對抑制率為1%，說明的缺失對氧化還原通路沒有影響。但突變體對0.7 mol·L-1的NaCl表現(xiàn)敏感，幾乎停止生長，相對抑制率為95%。

2.7 FgCREA基因缺失對致病力的影響

利用分生孢子懸浮液接種揚(yáng)花期小麥穗部，發(fā)現(xiàn)突變體侵染小麥穗的致病力嚴(yán)重下降，僅在小麥穗接種點發(fā)?。▓D7）。

圖5 FgCREA基因敲除突變體子囊殼、子囊和子囊孢子形態(tài)

圖6 FgCREA基因敲除突變體的壓力篩選

3 討論

利用生物信息學(xué)方法，發(fā)現(xiàn)禾谷鐮孢中碳源代謝調(diào)節(jié)因子只有一個，即FGSG_09715。與絲狀真菌和酵母中碳源代謝調(diào)節(jié)因子結(jié)構(gòu)類似，均具有兩個C2H2鋅指結(jié)構(gòu)，能夠結(jié)合啟動子區(qū)DNA序列5′-SYGGRG-3′。通過構(gòu)建進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)同源基因的進(jìn)化關(guān)系與物種進(jìn)化趨勢一致，說明應(yīng)為釀酒酵母碳源代謝因子的直系同源基因。因此，的功能應(yīng)與碳源代謝相關(guān)。

在細(xì)胞壁降解酶CWDEs基因、、，異檸檬酸裂解酶基因，蔗糖酶基因啟動子區(qū)均有DNA結(jié)合位點，這些碳源吸收結(jié)構(gòu)基因在釀酒酵母和尖鐮孢中均已報道能夠與互作或者可受到基因調(diào)控[43]。突變體在生長速率、產(chǎn)孢量、分生孢子萌發(fā)速率和有性生殖方面均存在嚴(yán)重缺陷，應(yīng)該是由于基因缺失導(dǎo)致利用次級碳源的相關(guān)結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄水平下降所致[44]。釀酒酵母中，Mig1和Kin2互作[45]，Kin2和Ssk2互作[46]，而Ssk2蛋白是真菌滲透壓調(diào)控Hog1信號通路中的MAPKKK（mitogen activated protein kinase kinase kinase）[47]。突變體對滲透壓的敏感性表明在禾谷鐮孢中，可能也通過與FgSsk2（FGSG_00408）互作而參與調(diào)控滲透壓信號通路。突變體侵染小麥穗部僅在接種點發(fā)病，表明致病力下降的主要原因是受到生長速率和分生孢子萌發(fā)率的影響。因為侵染試驗中接種的孢子數(shù)量是相同的，所以產(chǎn)孢量對致病性的影響并沒有作為考慮因素。另外，突變體對滲透壓敏感，可能會通過Hog1途徑而影響致病力[48]。因此，突變體致病力下降的主要原因應(yīng)該是生長速率減慢、分生孢子萌發(fā)率下降和滲透壓敏感。

圖7 FgCREA基因敲除突變體對小麥穗部的致病力

禾谷鐮孢中葡萄糖不能抑制真菌毒素DON生物合成家族的表達(dá)以及DON的生物合成，但蔗糖卻能夠強(qiáng)烈誘導(dǎo)。在用蔗糖作為唯一碳源的培養(yǎng)基中額外加入葡萄糖，也不能夠抑制DON生物合成，說明碳源代謝抑制CCR應(yīng)該是沒有參與DON生物合成系統(tǒng)[49]。但在DON生物合成家族主要基因啟動子區(qū)均有DNA結(jié)合位點，表明FgCreA應(yīng)該是與DON生物合成相關(guān)。研究已發(fā)現(xiàn)，釀酒酵母中Mig1蛋白能夠和促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路中Pmk1途徑中心激酶Set7互作[50]。敲除禾谷鐮孢中的激酶基因（FGSG_09903）可導(dǎo)致DON生物合成量急劇降低且影響病原菌在小麥穗部的定殖和擴(kuò)展[48,51]。Mig1蛋白同時還可與環(huán)腺苷酸單磷酸-蛋白激酶A（cyclic adenosine phosphate-protein kinase A，cAMP-PKA）通路中的cAMP磷酸二酯酶基因互作[52]。敲除可以激活PKA活性并增加DON的合成[53]。禾谷鐮孢中是否可與FgSte7和FgPde2蛋白互作，是否可參與調(diào)控DON生物合成還需進(jìn)一步驗證。白色念珠菌（）中，CaMig1蛋白缺乏潛在的激酶Snf1磷酸化位點[54]。子囊菌紅褐肉座菌（）中，Cre1雖然具有潛在的激酶Snf1磷酸化位點，但激酶Snf1并不能夠磷酸化碳源代謝調(diào)節(jié)因子Cre1[55]，通過生物信息學(xué)方法預(yù)測到禾谷鐮孢中CreA蛋白具有磷酸化位點，接下來將會進(jìn)一步驗證CreA蛋白是否能夠被激酶Snf1磷酸化。

4 結(jié)論

利用Split-PCR和Southern blot等方法得到禾谷鐮孢中碳源代謝調(diào)節(jié)因子基因缺失突變體。能夠影響營養(yǎng)生長、產(chǎn)孢量、孢子萌發(fā)速率、有性生殖、致病力和對鈉鹽的滲透壓敏感度，但是否參與了碳源代謝抑制和DON生物合成還需后期驗證。

[1] Muriuki J G. Deoxynivalenol and nivalenol in pathogenesis of Fusarium head blight in wheat[D]. USA: University of Minnesota, 2001.

[2] Bai G H, Shaner G. Management and resistance in wheat and barley to Fusarium head blight., 2004, 42(1): 135-161.

[3] Goswami R S, Kistler H C. Heading for disaster:on cereal crops., 2004, 5(6): 515-525.

[4] 王裕中, J D米勒. 中國小麥赤霉病菌優(yōu)勢種—禾谷鐮刀菌產(chǎn)毒素能力的研究. 菌物學(xué)報, 1994, 13(3): 229-234.

Wang Y Z, Miller J D. Toxin producing potential offrom China., 1994, 13(3): 229-234. (in Chinese)

[5] O’Donnell K, Kistler H C, Tacke B K, Casper H H. Gene genealogies reveal global phylogeographic structure and reproductive isolation among lineages of, the fungus causing wheat scab., 2000, 97(14): 7905-7910.

[6] 王琢, 閆培生. 真菌毒素產(chǎn)生菌的分子鑒定研究進(jìn)展. 中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報, 2010, 12(5): 42-50.

Wang Z, Yan P S. Research progress on molecular identification of mycotoxin-producing fungi., 2010, 12(5): 42-50. (in Chinese)

[7] Cuomo C A, Güldener U, Xu J R, Trail F, Turgeon B G, Di Pietro A, Walton J D, Ma L J, Baker S E, Rep M, Adam G, Antoniw J, Baldwin T, Calvo S, Chang Y L, Decaprio D, Gale L R, Gnerre S, Goswami R S, Hammond-Kosack K, Harris L J, Hilburn K, Kennell J C, Kroken S, Magnuson J K, Mannhaupt G, Mauceli E, Mewes H W, Mitterbauer R, Muehlbauer G, Münsterk?tter M, Nelson D, O'donnell K, Ouellet T, Qi W, Quesneville H, Roncero M I, Seong K Y, Tetko I V, Urban M, Waalwijk C, Ward T J, Yao J, Birren B W, Kistler H C.Thegenome reveals a link between localized polymorphism and pathogen specialization., 2007, 317(5843): 1400-1402.

[8] 張大軍, 邱德文, 蔣伶活. 禾谷鐮刀菌基因組學(xué)研究進(jìn)展. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2009, 37(17): 7892-7894.

Zhang D J, QIu D W, JIang L H. Research progress on the genomics of., 2009, 37(17): 7892-7894. (in Chinese)

[9] Brown D W, Cheung F, Proctor R H, Butchko R A, Zheng L, Lee Y, Utterback T, Smith S, Feldblyum T, Glenn A E, Plattner R D, Kendra D F, Town C D, Whitelaw C A. Comparative analysis of 87,000 expressed sequence tags from the fumonisin-producing fungus., 2005, 42(10): 848-861.

[10] Sikhakolli U R, Lopez-Giraldez F, Li N, Common R, Townsend J P, Trail F. Transcriptome analyses during fruiting body formation inandreflect species life history and ecology., 2012, 49(8): 663-673.

[11] Lysoe E, Seong K Y, Kistler H C. The transcriptome ofduring the infection of wheat., 2011, 24(9): 995-1000.

[12] Kumaraswamy K G, Kushalappa A C, Choo T M, Dion Y, Rioux S. Mass spectrometry based metabolomics to identify potential biomarkers for resistance in barley against fusarium head blight ()., 2011, 37(8): 846-856.

[13] Ruiz B, Chavez A, Forero A, García-Huante Y, Romero A, Sánchez M, Rocha D, Sánchez B, Rodríguez-Sanoja R, Sánchez S, Langley E. Production of microbial secondary metabolites: regulation by the carbon source., 2010, 36(2): 146-167.

[14] Ruijter G J, Visser J. Carbon repression in., 1997, 151(2): 103-114.

[15] Ries L N, Beattie S R, Espeso E A, Cramer R A, Goldman G H. Diverse regulation of the CreA carbon catabolite repressor in., 2016, 203(1): 335-352.

[16] Carlson M. Glucose repression in yeast., 1999, 2(2): 202-207.

[17] Gancedo J M. Yeast carbon catabolite repression., 1998, 62(2): 334-361.

[18] Johnston M. Feasting, fasting, and fermenting: glucose sensing in yeast and other cells., 1999, 15(1): 29-33.

[19] Trumbly R J. Glucose repression in the yeast., 1992, 6(1): 15-21.

[20] Treitel M A, Carlson M. Repression by SSN6-TUP1 is directed by MIG1, a repressor/activator protein., 1995, 92(8): 3132-3136.

[21] Tzamarias D, Struhl K. Distinct TPR motifs of Cyc8 are involved in recruiting the Cyc8-Tup1 corepressor complex to differentially regulated promoters., 1995, 9(7): 821-831.

[22] Treitel M A, Kuchin S, Carlson M. Snf1 protein kinase regulates phosphorylation of the Mig1 repressor in., 1998, 18(11): 6273-6280.

[23] Park S H, Koh S S, Chun J H, Hwang H J, Kang H S. Nrg1 is a transcriptional repressor for glucose repression ofgene expression in., 1999, 19(3): 2044-2050.

[24] Zhai Z, Yurimoto H, Sakai Y. Molecular characterization ofand its role in the regulation of methanol- inducible gene expression., 2012, 29(7): 293-301.

[25] Jonkers W, Rep M. Mutation ofreverts the pathogenicity defects of thedeletion mutant., 2009, 74(5): 1100-1113.

[26] Tamayo E N, Villanueva A, Hasper A A, de Graaff L H, Ramón D, Orejas M.mediates repression of the regulatory genewhich controls the production of xylanolytic enzymes in., 2008, 45(6): 984-993.

[27] Espeso E A, Fernández-Ca?ón J, Pe?alva M A. Carbon regulation of penicillin biosynthesis in: a minor effect of mutations inand., 1995, 126(1): 63-67.

[28] Tudzynski, B, Liu S, Kelly J M. Carbon catabolite repression in plant pathogenic fungi: isolation and characterization of theandgenes., 2000, 184(1): 9-15.

[29] Brown D W, Butchko R A E, Proctor R H. Fusarium genomic resources: Tools to limit crop diseases and mycotoxin contamination., 2006, 162(3): 191-199.

[30] Catlett N L, Lee B N, Yoder O C, Turgeon B G. Split-marker recombination for efficient targeted deletion of fungal genes., 2003, 50: 9-11.

[31] Zhao X H, Xu J R. A highly conserved MAPK-docking site in Mst7 is essential for Pmk1 activation in., 2007, 63(3): 881-894.

[32] McCormick S P, Harris L J, Alexander N J, OUELLET T,SaparnoA, AllardS,DesjardinsA E.encodes a P450 oxygenase., 2004, 70(4): 2044-2051.

[33] Tokai T, Takahashi-Ando N, Izawa M, Kamakura T, Yoshida M, Fujimura M, Kimura M. 4--acetylation and 3--acetylation of trichothecenes by trichothecene 15--acetyltransferase encoded by., 2008, 72(9): 2485-2489.

[34] Menke J, Weber J, Broz K, Kistler H C. Cellular development associated with induced mycotoxin synthesis in the filamentous fungus., 2013, 8(5): e63077.

[35] Boenisch M J, Schafer W.forms mycotoxin producing infection structures on wheat., 2011, 11: 110.

[36] Seong K Y, Pasquali M, Zhou X, Song J, Hilburn K, McCormick S, Dong Y, Xu J R, Kistler H C. Global gene regulation bytranscription factorsandreveals adaptations for toxin biosynthesis., 2009, 72(2): 354-367.

[37] Chandler E A, Simpson D R, Thomsett M A, Nicholson P. Development of PCR assays toandtrichothecene biosynthetic genes, and characterisation of chemotypes of,and., 2003, 62(6): 355-367.

[38] McCormick S P, Alexander N J.encodes a trichothecene C-3 esterase., 2002, 68(6): 2959-2964.

[39] Menke J, Dong Y, Kistler H C.Tri12p influences virulence to wheat and trichothecene accumulation., 2012, 25(11): 1408-1418.

[40] Garvey G S, McCormick S P, Alexander N J, Rayment I. Structural and functional characterization oftrichothecene 15-O-acetyltransferase from., 2009, 18(4): 747-761.

[41] Park Y, Cho Y, Lee Y H, Lee Y W, Rhee S. Crystal structure and functional analysis of isocitrate lyases fromand., 2016, 194(3): 395-403.

[42] AndreLeroux G, Tessier D, Bonnin E. Action pattern ofendopolygalacturonase towards pectin fragments: Comprehension and prediction., 2005, 1749(1): 53-64.

[43] Needham P G, Trumbly R J.characterization of the Mig1 repressor fromreveals evidence for monomeric and higher molecular weight forms., 2006, 23(16): 1151-1166.

[44] Qin S, Ji C, Li Y, Wang Z. Comparative transcriptomic analysis of race 1 and race 4 off. sp.induced with different carbon sources., 2017, 7(7): 2125-2138.

[45] Ptacek J, Devgan G, Michaud G, Zhu H, Zhu X, Fasolo J, Guo H, Jona G, Breitkreutz A, Sopko R, McCartney R R, Schmidt M C, Rachidi N, Lee S J, Mah A S, Meng L, Stark M J, Stern D F, De Virgilio C, Tyers M, Andrews B, Gerstein M, Schweitzer B, Predki P F, Snyder M. Global analysis of protein phosphorylation in yeast., 2005, 438(7068): 679-684.

[46] Sharifpoor S, Dyk D V, Costanzo M, Baryshnikova A, Friesen H, Douglas A C, Youn J Y, VanderSluis B, Myers C L, Papp B, Boone C, Andrews B J. Functional wiring of the yeast kinome revealed by global analysis of genetic network motifs., 2012, 22(4): 791-801.

[47] Zheng D W, Zhang S J, Zhou X Y, Wang C, Xiang P, Zheng Q, Xu J R. The FgHOG1 pathway regulates hyphal growth, stress responses, and plant infection in., 2012, 7(11): e49495.

[48] Wang C, Zhang S, Hou R, Zhao Z, Zheng Q, Xu Q, Zheng D, Wang G, Liu H, Gao X, Ma J W, Kistler H C, Kang Z, Xu J R. Functional analysis of the kinome of the wheat scab fungus., 2011, 7(12): e1002460.

[49] Jiao F, Kawakami A, Nakajima T. Effects of different carbon sources on trichothecene production and Tri gene expression byin liquid culture., 2008, 285(2): 212-219.

[50] Karunanithi S, Cullen P J. The filamentous growth MAPK pathway responds to glucose starvation through the Mig1/2 transcriptional repressors in., 2012, 192(3): 869-887.

[51] Jenczmionka N J, Maier F J, Losch A P, Sch?fer W. Mating, conidiation and pathogenicity of, the main causal agent of the head-blight disease of wheat, are regulated by the MAP kinase gpmk1., 2003, 43(2): 87-95.

[52] Balciunas D, Ronne H. Yeast genes: multicopy suppressors of the Gal- phenotype ofcells., 1999, 262(4/5): 589-599.

[53] Jiang C, Zhang C, Wu C, Sun P, Hou R, Liu H, Wang C F, Xu J R.andplay different roles in the regulation of deoxynivalenol (DON) production by cAMP signalling in., 2016, 18(11): 3689-3701.

[54] Zaragoza O, Rodríguez C, Gancedo C. Isolation of thegene fromand effects of its disruption on catabolite repression., 2000, 182(2): 320-326.

[55] Cziferszky A, Seiboth B, Kubicek C P. The Snf1 kinase of the filamentous fungusphosphorylates regulation- relevant serine residues in the yeast carbon catabolite repressor Mig1 but not in the filamentous fungal counterpart Cre1., 2003, 40(2): 166-175.

（責(zé)任編輯 岳梅）

The Function of the carbon metabolism regulator FgCreA in

HOU Rui1, WANG ChenFang2

(1College of Forestry, Guizhou University, Guiyang 550025;2College of Plant Protection, Northwest A&F University, Yangling 712100, Shaanxi)

【Objective】The objective of this study is to knock out the FgCreA of, which is the carbon source metabolic regulation factor, to research the vegetative growth, sexual reproduction and pathogenicity of the knock out mutant, and to provide a basis for carbon source metabolic mechanism of. 【Method】 According to the budding yeast carbon source regulation factorMig1gene sequence on SGD and NCBI databases, the carbon source regulation factor FgCreA inwas determined. the sequences of FgCreA orthologs of other species were retrieved from NCBI database. multiple sequence alignment of CreA orthologs was performed with ClustalW2 software, and phylogenetic tree was constructed by MEGA5 software to determine their evolutionary relationships. The protein properties of FgCreA were predicted via InterProScan. The promotor regions of the carbon absorption structure genes and DON biosynthesis genes were obtained from the NCBI database, then the potentialbinding sites in these promotor regions were analyzed. Primer5 software was used to design primers, thegene knockout construct was generated by Split-PCR and then introduced into the wild type strain PH-1 by PEG-mediated protoplast transformation. PCR and Southern blot were used to confirm thegene deletion mutants (). The function ofwas analyzed according to the vegetative growth, sexual reproduction and pathogenicity of themutants. 【Result】There is only one carbon metabolism regulator gene(FGSG_09715) in. The 416-amino acid protein encoded byhas two conserved C2H2 zinc finger regions.FgCreA homologue proteins have a certain degree of homology and are highly conserved in fungi. The promoter regions of the carbon absorption structure genes (,,,,) and DON biosynthesis genes (,,,,,,,,,) containedDNA binding sites. Twogene knockout mutants were obtained and screened by PCR and Southern blot. The growth rate ofmutants was 90% lower than that of wild type. The conidia morphology of mutants was normal, but the conidiation decreased by 88% compared with the wild type. In the sexual reproduction stage,themutants could produce normal perithecia, ascus and ascospore, but it delayed 20-28 d longer than the wild type. Themutants were sensitive to salt stress, and were almost non-pathogenic on wheat.【Conclusion】The carbon metabolic regulator FgCreA plays important roles in vegetative growth and sexual reproduction, and is essential for plant infection in. However, whether FgCreA affects transcription of the carbon absorption structure genes and DON biosynthesis genes remains to be verified.

;; gene knockout; phenotype; carbon metabolism

2017-07-21；

2017-09-05

國家自然科學(xué)基金（31271989）、陜西省科技新星項目（2014KJXX-41）、貴州省科技支撐項目（黔科合支撐（2017）2567）、貴州省留學(xué)人員科技創(chuàng)新項目（黔人項目資助合同（2016）23號）、貴州大學(xué)引進(jìn)人才項目（貴大人基合字（2015）65號）

侯瑞，E-mail：jiayouhourui123@163.com。

王晨芳，E-mail：wangchenfang@nwsuaf.edu.cn