正交設(shè)計(jì)優(yōu)化山豆根黃酮、皂苷提取工藝

何婷婷+柴軍紅+張蕾

摘要：以山豆（Sophora tonkinensis Gapnep.）根為原料，采用了閃式提取法、超聲波提取法、酶促?gòu)?fù)合提取法等進(jìn)行對(duì)比研究。以總皂苷、總黃酮的得率為指標(biāo)，正交設(shè)計(jì)探討了超聲提取法的最佳提取條件和參數(shù)。結(jié)果表明，最佳工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，料液比1∶20（g∶mL），超聲時(shí)間40 min，超聲功率500 W，超聲溫度80 ℃。在最佳提取條件下，放大10倍總皂苷、總黃酮的得率分別為1.22%、2.48%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在2%以內(nèi)。

關(guān)鍵詞：山豆（Sophora tonkinensis Gapnep.）根；總黃酮；總皂苷；工藝優(yōu)化

中圖分類號(hào)：TQ460.6+2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2018）01-0097-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.01.025

Abstract： Using the root of Sophora tonkinensis Gapnep. as material，herbal flash，ultrasonic and composite enzymatic methods were used to extract total flavonoids and saponins. The yield of total saponins and flavonoids was taken as the index，and their extraction conditions were optimized by orthogonal test. The results showed that the optimum technological condition was that ethanol concentration was 50%，solid-liquid ratio was 1∶20（g∶mL），ultrasonic time was 40 min，ultrasonic power was 500 W and ultrasonic temperature 80 ℃. Under the optimum extraction conditions，the process is magnified ten times，total sponnins and flavonoids were 1.22%，2.48%，the relative standard deviation was less than 2%.

Key words： the root of Sophora tonkinensis Gapnep.；flavonoids；total saponins；optimization of process

山豆根又名“廣豆根”，豆科越南槐（Sophora tonkinensis Gapnep.）的干燥根莖，可入藥[1]，含黃酮、生物堿、多糖、萜類及其皂苷[2]、酚類物質(zhì)、咖啡酸等[3]多種藥理活性成分，具有顯著抗炎抑菌、抗病毒、抗腫瘤、免疫激活等療效[3]，其水提取物對(duì)急性炎癥有療效[3]。山豆根醇提物對(duì)大腸桿菌、金黃葡萄菌、甲型鏈球菌等具有顯著抑制作用[4]?，F(xiàn)代藥理研究表明，黃酮、萜類及其皂苷與抗炎抑菌、抗病毒有密切關(guān)系[4，5]。此外，山豆根含生物堿是其藥效成分之一，也是引起或誘發(fā)毒副反應(yīng)的主要原因，為了進(jìn)一步研究山豆根藥用部位，提高藥品質(zhì)量安全性或增加相關(guān)適應(yīng)癥，有必要研究其提取工藝。本研究討論常規(guī)提法、閃式提取法、超聲波提取法、酶促-微波提取法等方法，以總黃酮及皂苷為指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)法優(yōu)化工藝參數(shù)，以期為山豆根開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

乙醇（AR，天津市進(jìn)豐化工有限公司），香草醛（AR，天津科密歐試劑廠），蘆丁、三七總皂苷標(biāo)準(zhǔn)品（>98%，貴州迪大科技有限責(zé)任公司），冰乙酸（AR，遼寧泉瑞試劑有限公司），高氯酸（AR，天津市東方化工廠），纖維素酶（WOLSEN公司），亞硫酸鈉（AR，天津市福晨化學(xué)試劑廠）等。

1.2 主要儀器

T6型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器公司）；BSA224S-CW型電子天平（德國(guó)賽多利斯集團(tuán)）；R210型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Buchi公司）；SL-2010N型超聲波提取器（南京順流設(shè)備有限公司）；JHBE-50T型閃式提取器（南京庚辰科學(xué)儀器有限公司）等。

1.3 活性成分測(cè)定方法

1.3.1 總黃酮測(cè)定方法 采用亞硝酸鈉-硝酸鋁法[5，6]，建立相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)曲線。取適量提取浸膏，少量甲醇超聲處理溶解，70%甲醇定容于100 mL容量瓶中，移取0.5～1.0 mL上清液進(jìn)行測(cè)定。

1.3.2 總皂苷測(cè)定方法 采用香草醛-冰乙酸顯色法[7]，以三七總皂苷為對(duì)照品，建立相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)曲線。取適量提取浸膏，50%乙醇超聲溶解，定容100 mL容量瓶中，移取上清液0.6 mL進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 提取方法對(duì)比試驗(yàn)

采用常規(guī)提取法（浸提法、索氏連續(xù)提取法）、超聲波輔助法[6]、閃式提取法及酶促法[7，8]等，略有改動(dòng)。山豆根去雜破碎，過(guò)20～30目篩備用，其試驗(yàn)方法如表1所示。依據(jù)表1參數(shù)組織試驗(yàn)，試驗(yàn)重復(fù)3次，得率取平均值，結(jié)果見(jiàn)表2。

1.5 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲功率、提取時(shí)間、料液比（g∶mL，下同）、超聲溫度為試驗(yàn)因素，以總黃酮、皂苷得率為指標(biāo)，采用L16（45）正交試驗(yàn)，各因素和水平見(jiàn)表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 活性成分標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.1 總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線 依據(jù)“1.3.1”方法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，蘆丁對(duì)照品在0.11～0.66 mg/mL，線性關(guān)系良好，其回歸方程為Y=0.590 9x+0.012 4，R2=0.999 2。endprint

2.1.2 總皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線 依據(jù)“1.3.2”方法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，皂苷在10.01～80.08 μg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，其回歸方程為Y=0.006 3x+0.012 9，R2=0.999 2。

2.2 提取方法對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果

由表3可知，傳統(tǒng)的提取法從提取時(shí)間、效率等方面，與超聲波輔助法、酶促輔助法等存在差異，浸提法總黃酮得率是酶法+超聲波法的45%左右。閃式提取法由于具有快速同時(shí)溫度低等優(yōu)勢(shì)[2]，相對(duì)提取率也較高，但是由于工程化不易實(shí)現(xiàn)等原因，本研究采用超聲波法作為提取方法進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。

2.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

依據(jù)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，其試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。為了更好地評(píng)價(jià)工藝，參考文獻(xiàn)[9，10]對(duì)總皂苷及總黃酮得率進(jìn)行加權(quán)處理，以得率的算數(shù)平均值比值為系數(shù)，經(jīng)計(jì)算多糖系數(shù)為1，總黃酮為1.54，其總指標(biāo)計(jì)算公式如下：

總指標(biāo)=1.54×S（皂苷）+F（黃酮）

由表4可知，各因素對(duì)提取影響的順序?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)>料液比>超聲時(shí)間>超聲功率>超聲溫度，最佳工藝條件為4號(hào)A1B4C4D4E4，乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，料液比1∶20，超聲時(shí)間40 min，超聲功率在500 W，超聲溫度80 ℃，其加權(quán)收率為4.898 4。依據(jù)K值最佳組合為A1B4C2D3E4不在正交設(shè)計(jì)表范圍內(nèi)，所以需要進(jìn)一步驗(yàn)證，以期獲得最佳工藝。將A1B4C2D3E4組合依據(jù)前方法提取，獲得皂苷得率為1.12%，總黃酮為2.08%，其結(jié)果低于組合A1B4C4D4E4，所以最佳工藝為A1B4C4D4E4。此外，隨著工藝中試放大，傳質(zhì)、傳熱、傳動(dòng)會(huì)出現(xiàn)變化。為了研究工藝參數(shù)的穩(wěn)定性，進(jìn)行工藝放大驗(yàn)證試驗(yàn)。

2.6 工藝放大驗(yàn)證試驗(yàn)

選取4號(hào)工藝參數(shù)，試驗(yàn)放大10倍，重復(fù)3次，結(jié)果取算數(shù)平均值，驗(yàn)證工藝穩(wěn)定性，其結(jié)果如表5所示。穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表明，總黃酮得率平均值為2.479%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差0.93%，皂苷為1.196%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差1.98%，此偏差與偏離算術(shù)平均值的程度均在2.0%以內(nèi)，考慮試驗(yàn)誤差，表明該提取工藝參數(shù)較為穩(wěn)定。

3 結(jié)論

對(duì)山豆根總黃酮、總皂苷提取方法進(jìn)行研究，較低體積分?jǐn)?shù)乙醇對(duì)于總皂苷、總黃酮有好的浸提率。同時(shí)，超聲波法顯示出良好的可控及操作性，正交試驗(yàn)優(yōu)化和加權(quán)分析表明，其影響因素順序?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)>料液比>微波時(shí)間>微波功率>微波溫度，工藝放大10倍后，總黃酮得率可達(dá)2.48%，皂苷1.22%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均在2%以內(nèi)，所以此工藝具有一定穩(wěn)定性。

參考文獻(xiàn)：

[1] 王君明，崔 瑛.山豆根化學(xué)成分、藥理作用及毒性研究進(jìn)展[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17（4）：229-232.

[2] 李厚聰，袁德培，劉 圓，等.山豆根屬植物化學(xué)成分與生物活性研究進(jìn)展[J].中草藥，2014，45（23）：3486-3491.

[3] HE C M，CHENG Z H，CHEN D F. Qualitative and quantitative analysis of flavonoids in Sophora tonkinensis by LC/MS and HPLC[J].Chinese Journal of Natural Medicines，2013，11（6）：690-698.

[4] 戴五好，錢利武，楊士友，等.苦參、山豆根生物堿及其總堿的抑菌活性研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18（3）：177-180.

[5] 賴紅芳，黃秀香，陸俊宇.超聲波輔助提取山豆根中的黃酮和多糖工藝優(yōu)化[J].食品與機(jī)械，2014，30（1）：196-198.

[6] 柴軍紅，何婷婷，金志民，等.花楸葉活性成分提取工藝的優(yōu)化[J].食品研究與開(kāi)發(fā)，2014，35（3）：23-27.

[7] 劉子禎，姜 蕊，劉偉銳，等.紅棗葉中三萜皂苷的提取工藝和含量測(cè)定研究[J].食品研究與開(kāi)發(fā)，2016，37（1）：57-59.

[8] 王 瑾，楊義雄，林 海，等.閃式提取無(wú)患子中長(zhǎng)春藤皂苷元的最優(yōu)工藝[J].福建中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，22（1）：50-52.

[9] 郭東艷，張麗娟，師延瓊，等.基于譜效相關(guān)的多指標(biāo)綜合加權(quán)評(píng)分法優(yōu)選生地黃的提取工藝[J].中成藥，2011，32（12）：2183-2185.

[10] 金 芳，姚仲青，蔣 琴，等.多指標(biāo)加權(quán)綜合評(píng)分法考察功血顆粒劑提取工藝[J].中草藥，2000，31（10）：746-747.endprint