鈣網(wǎng)織蛋白在早期類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中的表達(dá)及其與自身抗體和炎性細(xì)胞因子的關(guān)系

丁紅梅 ，劉建華 ，賈曙光 ，趙雁艷 ，魏蔚 ，鄭芳

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種免疫介導(dǎo)的慢性炎性關(guān)節(jié)病，以滑膜組織增生、新生血管形成、多種細(xì)胞及細(xì)胞因子浸潤(rùn)為主要特征。RA的病因和發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜，目前仍不十分清楚。近年來(lái)研究顯示，鈣網(wǎng)織蛋白可能與RA的發(fā)病密切相關(guān)。鈣網(wǎng)織蛋白是一個(gè)多功能的蛋白質(zhì)分子，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜表面及胞外環(huán)境中均表達(dá)，并參與多種生物學(xué)活動(dòng)，如細(xì)胞的黏附和遷移、抗原呈遞、細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)以及抗腫瘤免疫應(yīng)答等過(guò)程［1-3］。鈣網(wǎng)織蛋白在RA患者體內(nèi)表達(dá)升高，且與滑膜炎和新生血管形成有關(guān)［4-6］。本研究在以往研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討鈣網(wǎng)織蛋白在早期RA患者中的表達(dá)特點(diǎn)及其與自身抗體和炎性細(xì)胞因子的關(guān)系，為臨床尋找新的血清學(xué)指標(biāo)提供依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2014年10月—2016年12月在唐山市第二醫(yī)院關(guān)節(jié)科和天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院感染免疫科就診的患者。血清標(biāo)本包括早期活動(dòng)性RA患者106例（活動(dòng)性RA組），穩(wěn)定期RA患者95例（穩(wěn)定期RA組，均來(lái)自早期活動(dòng)性RA患者），骨性關(guān)節(jié)炎（OA）患者85例（OA組）。所有入選的早期活動(dòng)性RA患者病程小于12個(gè)月，且均未經(jīng)緩解病情抗風(fēng)濕藥物（disease-modifying anti-rheumatic drugs，DMARDs）或生物制劑治療，診斷均符合2010年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)及歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟（ACR/EULAR）修訂的最新診斷標(biāo)準(zhǔn)［7］。穩(wěn)定期RA患者的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)參照ACR/EULAR 2011類風(fēng)濕指南［8］。所有OA患者均符合OA的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)。選取同期收集的來(lái)自唐山市第二醫(yī)院的80例性別、年齡匹配的健康體檢者作為健康對(duì)照組（HC組），各組基線資料見(jiàn)表1。本研究獲得河北省唐山市第二醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，且標(biāo)本采集均取得受試者的知情同意。

Tab.1 Clinical characteristics in four groups of patients表1 研究對(duì)象的基線臨床資料

1.2 主要試劑與儀器 人鈣網(wǎng)織蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海鑫樂(lè)生物科技有限公司，采用BioTek Synergy 2酶標(biāo)儀（美國(guó)Biotek公司）進(jìn)行檢測(cè)。人全血CRP采用Nephstar Plus蛋白分析儀（深圳市國(guó)賽生物技術(shù)有限公司）及其配套試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。類風(fēng)濕因子（RF）的檢測(cè)采用日立7600全自動(dòng)生化分析儀及其配套試劑?？弓h(huán)瓜氨酸肽抗體（anti-CCP）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上?？菩律锛夹g(shù)股份有限公司。人白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-6、腫瘤壞死因子（TNF）-α 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海晶抗生物工程有限公司。

1.3 方法 采集早期活動(dòng)性RA患者治療前和治療后處于穩(wěn)定期的靜脈血各2 mL，分離血清，分裝后-80℃保存。血清鈣網(wǎng)織蛋白、IL-1β、IL-6、TNF-α 及 anti-CCP均采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）進(jìn)行檢測(cè)，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作。anti-CCP陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)為≥25 RU/mL。ESR采用魏氏法檢測(cè)，正常參考值為男＜15 mm/1 h，女＜20 mm/1 h。CRP及RF采用免疫比濁法檢測(cè)，陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)為CRP≥10mg/L，RF＞20IU/mL。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2 組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用SNK-q檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組血清鈣網(wǎng)織蛋白水平比較 活動(dòng)性RA組、穩(wěn)定期RA組、OA組和HC組血清鈣網(wǎng)織蛋白含量分別為（5.84±2.62）μg/L、（4.26±1.42）μg/L、（3.92±1.10）μg/L、（3.86±0.91）μg/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=28.696，P＜0.001），活動(dòng)期 RA 組患者血清鈣網(wǎng)織蛋白含量明顯高于其他3組（P＜0.001），而后3組間血清鈣網(wǎng)織蛋白水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 血清鈣網(wǎng)織蛋白水平與RA自身抗體的關(guān)系 活動(dòng)性RA患者RF陽(yáng)性組血清鈣網(wǎng)織蛋白含量［（6.12±2.87）μg/L，n=81］高于 RF 陰性組［（4.92±1.22）μg/L，n=25，t=2.029，P=0.045］；anti-CCP 陽(yáng)性組鈣網(wǎng)織蛋白含量［（6.39±2.93）μg/L，n=72］高于anti-CCP 陰性組［（4.69±1.17）μg/L，n=34，t=3.256，P=0.002］。

2.3 血清鈣網(wǎng)織蛋白與炎性因子的相關(guān)性分析 經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)，4個(gè)因子并不是均服從正態(tài)分布，采用等級(jí)相關(guān)分析。早期活動(dòng)性RA患者血清鈣網(wǎng)織蛋白水平與血清炎性細(xì)胞因子IL-1β（rs=0.386，P=0.009）、IL-6（rs=0.405，P=0.006）及 TNF- α（rs=0.428，P=0.003）均呈正相關(guān)，見(jiàn)圖 1。

Fig.1 The correlations between calreticulin and IL-1β,IL-6 and TNF-α in patients with active RA圖1 活動(dòng)性RA患者血清鈣網(wǎng)織蛋白與IL-1β、IL-6及TNF-α的相關(guān)分析散點(diǎn)圖

3 討論

RA在全世界范圍內(nèi)具有較高的發(fā)病率，且呈上升的趨勢(shì)。早期診斷、早期治療控制疾病活動(dòng)是改善RA患者的預(yù)后及降低其致殘率的關(guān)鍵。血清學(xué)指標(biāo)是臨床上RA早期診斷及預(yù)后判斷的重要依據(jù)，但目前尚沒(méi)有理想的血清學(xué)指標(biāo)可用來(lái)早期診斷和準(zhǔn)確預(yù)測(cè)RA疾病進(jìn)展程度［9-11］。隨著臨床RA診療的個(gè)性化及多種生物標(biāo)志物的綜合應(yīng)用，尋找更特異、更敏感的血清學(xué)標(biāo)志物指導(dǎo)RA的早期個(gè)性化診療具有十分重要的臨床意義。

3.1 RA患者血清鈣網(wǎng)織蛋白表達(dá)水平 既往研究顯示，鈣網(wǎng)織蛋白在RA患者體內(nèi)表達(dá)升高，并且在RA發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮了重要作用［4-6］。本研究納入未經(jīng)DMARDs或生物制劑治療的初治RA患者及經(jīng)治療后達(dá)到穩(wěn)定期的RA患者進(jìn)行研究，分析早期RA患者體內(nèi)鈣網(wǎng)織蛋白的表達(dá)特點(diǎn)及治療前后鈣網(wǎng)織蛋白表達(dá)的差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，早期活動(dòng)性RA患者血清鈣網(wǎng)織蛋白表達(dá)水平明顯升高，該結(jié)果與以往的研究結(jié)果具有一致性［4-5］，提示鈣網(wǎng)織蛋白可能成為RA早期診斷的潛在血清學(xué)新指標(biāo)。而且筆者發(fā)現(xiàn)經(jīng)DMARDs或生物制劑治療達(dá)到穩(wěn)定期后，伴隨病情好轉(zhuǎn)的RA患者血清鈣網(wǎng)織蛋白水平明顯降低，該指標(biāo)可能是評(píng)估藥物治療效果的較敏感指標(biāo)。

3.2 鈣網(wǎng)織蛋白與RA自身抗體的關(guān)系 自身抗體是目前RA最重要的血清學(xué)標(biāo)志物。2010年RA新的分類標(biāo)準(zhǔn)中包括RF和anti-CCP這兩種自身抗體，新標(biāo)準(zhǔn)更有助于RA的早期診斷［7］。因此，本研究接下來(lái)探討血清鈣網(wǎng)織蛋白水平與RF和anti-CCP的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，早期活動(dòng)性RA患者RF陽(yáng)性和anti-CCP陽(yáng)性組血清鈣網(wǎng)織蛋白水平明顯高于RF陰性和anti-CCP陰性組。自身抗體不僅用于診斷，還與RA患者的預(yù)后密切相關(guān)。以往研究表明，anti-CCP陽(yáng)性的RA患者比anti-CCP陰性的患者疾病更具有侵襲性［12］。本研究顯示，鈣網(wǎng)織蛋白在陽(yáng)性RF及anti-CCP患者中表達(dá)升高，提示其不僅有助于RA的早期診斷，還可能與RA患者的預(yù)后密切相關(guān)。

3.3 鈣網(wǎng)織蛋白與炎性細(xì)胞因子的關(guān)系 為了進(jìn)一步探討鈣網(wǎng)織蛋白在RA早期診斷和預(yù)后評(píng)估中的作用，本研究分析了其與炎性細(xì)胞因子的相關(guān)性。目前研究證實(shí)多種細(xì)胞因子，如IL-1、IL-6、TNF-α、IL-17、IL-28、IL-23參與了RA發(fā)病的病理過(guò)程，并且與疾病的進(jìn)展密切相關(guān)［13］。本研究發(fā)現(xiàn)，早期活動(dòng)性RA患者血清鈣網(wǎng)織蛋白水平與細(xì)胞因子IL-1β、IL-6及TNF-α均呈正相關(guān)，該結(jié)果支持上述觀點(diǎn)，即鈣網(wǎng)織蛋白可能在RA早期診斷和預(yù)后評(píng)估中發(fā)揮了重要作用。由于本研究納入的樣本例數(shù)偏少，想證實(shí)這一點(diǎn)還需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)行深入研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)早期活動(dòng)性RA患者血清鈣網(wǎng)織蛋白水平明顯升高，且與自身抗體、促炎性細(xì)胞因子水平均相關(guān)，鈣網(wǎng)織蛋白可能是RA早期診斷及預(yù)后評(píng)估的潛在血清學(xué)新指標(biāo)。

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