CD147對阿爾茨海默病模型大鼠學習記憶能力的干預作用

霍會永 ，劉冰 ，曹凌 ，趙現(xiàn) ，曹妍 ，薛靖 ，王如科 ，李軍濤 △

阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是老年人群中常見的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變，臨床上以記憶力減退，語言功能障礙和認知能力降低為主要表現(xiàn)，部分患者甚至出現(xiàn)行為和人格改變，嚴重影響了患者生活質(zhì)量［1］。隨著我國逐漸步入老齡化社會，AD患者的發(fā)病人數(shù)也呈逐年增加之勢。有關(guān)AD的發(fā)病機制尚不十分清楚，其主要病理改變?yōu)榇竽X皮質(zhì)和海馬區(qū)老年斑形成［2］。β-淀粉樣蛋白（βamyloid protein，Aβ）是具有強自聚性的難溶蛋白，是構(gòu)成老年斑的主要成分，降低腦內(nèi)Aβ的蓄積能夠有效延緩病程進展［3］。γ-分泌酶是調(diào)節(jié)Aβ生成的限速酶，對體內(nèi)Aβ的平衡具有重要的調(diào)節(jié)作用［4］。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，細胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導因子（extracellular matrix metalloproteinase inducer，CD147）可通過調(diào)節(jié)γ-分泌酶的生物活性，調(diào)節(jié)Aβ的生成，從而參與AD的發(fā)生、發(fā)展［5-6］。本文通過對AD模型大鼠腦室注射CD147 cDNA，以觀察其對模型大鼠學習記憶能力的干預，以及對大鼠腦組織Aβ和γ-分泌酶表達的影響，從而為AD的臨床治療提供思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑 Sprague-Dawley二級健康雄性大鼠60只，月齡5～6個月，均購自中國科學院北京斯萊克實驗動物中心（SCXK京2011-0012）。大鼠適應性飼養(yǎng)2周后用于實驗。CD147 cDNA委托上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設計合成。TRIzol總RNA提取試劑購自美國Invitrogen公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒均購自美國ABI Applied Biosystems公司。兔抗大鼠一抗（抗Aβ、抗γ-分泌酶），辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗，DAB顯色試劑盒均購自美國Santa Cruz公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組、模型制備及給藥 采用隨機數(shù)字表法將60只大鼠分為假手術(shù)組、模型組及CD147組，每組20只。參照文獻［7］制備AD大鼠模型，取模型組和CD147組大鼠，10%水合氯醛（0.3 g/kg）腹腔注射麻醉，俯臥固定于鼠腦立體定位儀上。參照鼠腦立體定位儀圖譜，于前囟門后3.5 mm和中線右側(cè)2 mm處垂直進針，通過微量注射器于雙側(cè)海馬CA1區(qū)注入10μg的Aβ1～40，假手術(shù)組大鼠雙側(cè)海馬CA1區(qū)注入10μg生理鹽水，其余操作同模型組和CD147組。CD147組大鼠術(shù)后48 h，通過微量注射器于雙側(cè)腦室注射CD147 cDNA，模型組和假手術(shù)組大鼠于同一部位注射等量生理鹽水。術(shù)畢，牙科泥封住顱骨孔，抗生素預防感染。

1.2.2 大鼠學習記憶能力測試 采用Morris水迷宮實驗進行學習記憶能力測試。水迷宮為一圓形水池，直徑1.8 m，高0.55 m。距池壁0.35 m處放一圓形平臺，直徑0.1 m，高0.29 m。所有大鼠訓練5 d，每天上午訓練2次，下午訓練2次，相鄰兩次訓練間隔1 min。訓練時將大鼠面向池壁放入水中，觀察其爬上圓形平臺所需時間（即逃避潛伏期）。如果2 min內(nèi)仍未找到圓形平臺，則將其引導至圓形平臺，潛伏期記為2 min。訓練5 d后，撤除圓形平臺，在訓練時的同一入水點，大鼠面向池壁入水，觀察其在2 min內(nèi)跨過原圓形平臺所在位置的次數(shù)。

1.2.3 Western blot檢測蛋白表達 Morris水迷宮實驗結(jié)束后，3組大鼠各取15只，腹腔麻醉后處死，取出包含海馬組織的腦組織，置入玻璃勻漿器碾碎，冰浴下加裂解液。裂解30 min，轉(zhuǎn)移至離心管，4℃下10 000 r/min離心5 min，取上清蛋白液。BCA法測定蛋白濃度，-20℃保存?zhèn)溆谩?00μg蛋白上樣，經(jīng)8%的SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)至PVDF膜。TBST漂洗，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，兔抗大鼠一抗（抗Aβ、抗γ-分泌酶）工作液，4℃孵育過夜。TBST漂洗，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗工作液，37℃孵育1 h。TBST漂洗，暗室內(nèi)ECL顯色、曝光。Image J軟件分析條帶光密度（OD）值，目的蛋白相對表達量=目的蛋白光密度值/內(nèi)參βactin光密度值。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件進行分析，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠逃避潛伏期時間比較 各組大鼠逃避潛伏期時間隨著訓練時間的增加均縮短。從第3天開始，模型組大鼠逃避潛伏期時間較假手術(shù)組延長，而CD147組較模型組減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

Tab.1 The comparison of escape latencies between three groups表1 各組大鼠逃避潛伏期時間比較（n=20，s，±s）

Tab.1 The comparison of escape latencies between three groups表1 各組大鼠逃避潛伏期時間比較（n=20，s，±s）

＊＊P＜0.01；a與假手術(shù)組比較，b與模型組比較，P＜0.05；表2、3 同

2.2 各組大鼠空間探尋能力比較 模型組大鼠經(jīng)過平臺次數(shù)和經(jīng)平臺停留時間較假手術(shù)組減少，而CD147組較模型組均增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。

2.3 各組腦組織Aβ和γ-分泌酶表達比較 模型組大鼠腦組織Aβ和γ-分泌酶表達較假手術(shù)組增加（P＜0.05），而CD147組較模型組減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表3、圖 1。

Tab.2 The comparison of spatial searching abilities between three groups表2 各組大鼠空間探尋能力比較（±s）

Tab.2 The comparison of spatial searching abilities between three groups表2 各組大鼠空間探尋能力比較（±s）

Tab.3 ComparisonofexpressionsofAβandγ-secretasein brain tissues of rats between three groups表3 各組大鼠腦組織Aβ和γ-分泌酶表達比較 （±s）

Tab.3 ComparisonofexpressionsofAβandγ-secretasein brain tissues of rats between three groups表3 各組大鼠腦組織Aβ和γ-分泌酶表達比較 （±s）

Fig.1 Comparison of expressions of Aβ and γ-secretase in brain tissues of rats between three groups圖1 各組大鼠腦組織Aβ和γ-分泌酶表達比較

3 討論

學習記憶能力下降是AD患者早期認知功能損害的主要臨床特征。本研究通過海馬區(qū)注射Aβ1～40，制備 AD 模型大鼠，Morris水迷宮實驗結(jié)果顯示，AD模型大鼠逃避潛伏期時間較假手術(shù)組顯著延長，經(jīng)過平臺次數(shù)和經(jīng)平臺停留時間較假手術(shù)組明顯減少，表明AD模型大鼠出現(xiàn)明顯的學習記憶能力減退。通過對AD模型大鼠雙側(cè)腦室注射CD147 cDNA，觀察其對AD模型大鼠學習記憶能力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CD147組大鼠逃避潛伏期時間較模型組大鼠顯著減少，經(jīng)過平臺次數(shù)和經(jīng)平臺停留時間較模型組大鼠顯著增加，表明外源性CD147 cDNA能夠顯著提高AD模型大鼠記憶學習能力，減輕Aβ1～40所致的學習記憶障礙。

有關(guān)AD的病因迄今尚不明確，一般認為AD是由于遺傳、免疫、環(huán)境等多種因素所致的復雜性病變。研究指出，Aβ在大腦皮質(zhì)和海馬區(qū)沉積是引起AD發(fā)病的關(guān)鍵因素［8］。Aβ由39～43個氨基酸殘基形成，其C-末端存在12個疏水氨基酸殘基，N-末端存在28個氨基酸殘基位于細胞膜外，所以具有很強的自聚性，易在腦組織形成難溶性的淀粉樣纖維沉積物［9］。Aruoma 等［10］研究顯示，腦組織 Aβ 沉積可引起淀粉樣血管炎，直接引起腦組織血供、氧供障礙。譚展望等［11］認為Aβ可促進Bax表達而抑制Bcl-2表達，從而誘導神經(jīng)元細胞凋亡。Arora等［12］研究顯示，Aβ可損害膽堿能神經(jīng)，而后者與人類學習和記憶功能緊密相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠腦組織Aβ表達較假手術(shù)組顯著增加，這也證實了Aβ可能參與了AD的發(fā)生、發(fā)展；而CD147組大鼠腦組織Aβ表達較AD模型大鼠顯著降低，說明外源性CD147 cDNA可顯著減少腦組織Aβ表達，減輕Aβ沉積所引起的大鼠記憶學習障礙。

γ-分泌酶主要參與體內(nèi)多個重要跨膜蛋白的切割，可切割C99而生成Aβ，是調(diào)節(jié)Aβ生成的限速酶［13］。所以γ-分泌酶的生物活性對Aβ的生成和AD的發(fā)病均至關(guān)重要。CD147是一種跨膜糖蛋白，在多種組織和細胞中均有表達，與腫瘤的發(fā)生、視網(wǎng)膜功能和多種神經(jīng)退行性疾病等密切相關(guān)。有研究認為CD147參與了對γ-分泌酶生物活性的調(diào)控。Zhou等［14］干擾 HeLa細胞 CD147表達，發(fā)現(xiàn)細胞γ-分泌酶表達顯著增加，而Aβ的生成亦明顯增加。張錦巍等［15］過表達小鼠胚胎成纖維細胞CD147，發(fā)現(xiàn)細胞γ-分泌酶表達下降，同時Aβ的生成明顯減少。智孔亮等［16］通過CD147 cDNA轉(zhuǎn)染人神經(jīng)母細胞瘤細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)γ-分泌酶和Aβ的表達均明顯減少。本研究結(jié)果顯示，CD147組大鼠腦組織γ-分泌酶表達較AD模型大鼠顯著降低，這也證實了在AD模型大鼠腦組織中存在同樣的表達調(diào)控，即CD147對γ-分泌酶的活性起著負調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，外源性CD147能夠顯著改善AD模型大鼠學習記憶能力，其具體機制可能與調(diào)節(jié)γ-分泌酶活性和下調(diào)Aβ的表達有關(guān)。

［1］田金洲，時晶，苗迎春，等.阿爾茨海默病的流行病學特點及其對公共衛(wèi)生觀念的影響［J］.湖北中醫(yī)學院學報，2009，11（1）：3-7.Tian JZ，Shi J，Miao YC，et al.Epidemiological characteristics of Alzheimer’s disease and its effect on public health［J］.J Hubei College TCM，2009，11（1）：3-7.

［2］何穎，王超，王德才.阿爾茨海默病的非治療藥物及新靶點研究進展［J］.中國醫(yī)藥導報，2014，11（6）：162-166.He Y，Wang C，Wang DC.Research progress for non-treatment drug and new targets in Alzheimer disease［J］.Chin Med Herald，2014，11（6）：162-166.

［3］胡海燕.β-淀粉樣蛋白在阿爾茨海默病中的作用及中藥多靶點對抗研究進展［J］.中華中醫(yī)藥學刊，2012，30（3）：488-492.Hu HY.Against research progress of beta amyloid protein in the role of Alzheimer disease and traditional Chinese medicine therapy by multiple targets［J］.Chin Arch Tradit Chin Med，2012，30（3）：488-492.

［4］Roher AE，Maarouf CL，Kokjohn TA，et al.Neuropathological and biochemical assessments of an Alzheimer’s disease patient treated with the γ -secretase inhibitor semagacestat［J］.Am J Neurodegener Dis，2014，3（3）：115-133.

［5］Nahalkova J，Volkmann I，Aoki M，et al.CD147，a γ-secretase associated protein is upregulated in Alzheimer’s disease brain and its cellular trafficking is affected by presenilin-2［J］.Neurochem Int，2010，56（1）：67-76.doi：10.1016/j.neuint.2009.09.003.

［6］智孔亮，辛娜，曹志紅,等.細胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導因子與阿爾茨海默病β-淀粉樣蛋白的相關(guān)性研究［J］.臨床和實驗醫(yī)學雜志，2016，15（4）：342-345.Zhi KL，Xin N，Cao ZH，et al.The relationship between CD147 and β-amyloid protein of Alzheimer’s disease［J］.J Clin Exp Med，2016，15（4）：342-345.doi：10.3969/j.issn.1671-4695.2016.04.014.

［7］Liu X，Zuo H，Wang D，et al.Improvement of spatial memory disorder and hippocampal damage by exposure to electromagnetic fields in an Alzheimer’s disease rat model［J］.PLoS One，2015，10（5）：e0126963.doi：10.1371/journal.pone.0126963.

［8］張琳琳，宋宛珊，王凱，等.阿爾茨海默病發(fā)病機制及藥物治療研究進展［J］.世界中醫(yī)藥，2017，12（5）：1200-1203.Zhang LL，Song WS，Wang K，et al.Progress in mechanism of pathogenesis and medical treatment of Alzheimer’s disease［J］.World Chin Med，2017，12（5）：1200-1203.doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2017.05.058.

［9］徐金靜，方力群，趙春慧，等.β淀粉樣蛋白對阿爾茨海默病轉(zhuǎn)基因果蠅認知功能的影響［J］.國際神經(jīng)病學神經(jīng)外科雜志，2013，30（2）：101-104.Xu JJ，F(xiàn)ang LQ，Zhao CH，et al.Effect of β-amyloid proteins on cognitive functions in transgenic drosophila with Alzheimer’s disease［J］.J Int Neurol Neurosurg，2013，30（2）：101-104.

［10］Aruoma OI，Jen SS，Watts HR，et al.Acute and chronic effects of intravitreally injected beta-amyloid on the neurotransmitter system in the retina［J］.Toxicology，2009，256（1/2）：92-100.doi：10.1016/j.tox.2008.11.007.

［11］譚展望，胡海燕，陳翔，等.清心開竅方皂苷對AD大鼠大腦皮層及海馬區(qū) Bax、Bcl-2、Aβ 及 βAPP 表達的影響［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2012，32（9）：1258-1263.Tan ZW，Hu HY，Chen X，et al.Effect of Qingxin Kaiqiao Recipe Saponin on the expressions of Bax，Bcl-2，Aβ，and βAPP in the cortex and hippocampus of Alzheimer’s disease rats［J］.CJITWM，2012，32（9）：1258-1263.

［12］Arora K，Alfulaij N，Higa JK，et al.Impact of sustained exposure to β-amyloid on calcium homeostasis and neuronal integrity in model nerve cell system expressing α4β2 nicotinic acetylcholine receptors［J］.J Biol Chem，2013，288（16）：11175-11190.doi：10.1074/jbc.M113.453746.

［13］鄧青山，馬全紅，徐如祥.人β-分泌酶與阿爾茨海默病［J］.中華神經(jīng)創(chuàng)傷外科電子雜志，2015，1（4）：45-48.Deng QS，Ma QH，Xu RX.Human beta-secretase and Alzheimer’s disease［J］.Chin J Neurotrauma Surg（Electronic Edition），2015，1（4）：45-48.doi：10.3877/cma.j.issn.2095-9141.2015.04.011.

［14］Zhou S，Zhou H，Walian PJ,et al.CD147 is a regulatory subunit of the γ-secretase complex in Alzheimer’s disease amyloid β-peptide production［J］.Proc Natl Acad Sci，2005，102（21）：7499-7504.doi：10.1073/pnas.0502768102.

［15］張錦巍，井麗娟，孫亞平，等.CD147超表達對γ-分泌酶影響的臨床研究［J］.重慶醫(yī)學，2012，41（36）：3801-3806.Zhang JW，Jing LJ，Sun YP，et al.Effect of over expressed CD147 on γ -secretase［J］.Chongqing Med，2012，42（36）：3801-3806.doi：10.3969/j.issn.1671-8348.2012.36.001.

［16］智孔亮，辛娜，曹志紅，等.細胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導因子與阿爾茨海默病γ-分泌酶的相關(guān)性研究［J］.國際神經(jīng)病學神經(jīng)外科學雜志，2015，42（3）：244-247.Zhi KL，Xin N，Cao ZH，et al.Relationship between extracellular matrix metalloproteinase inducer and γ-secretase in Alzheimer’s disease［J］.J Int Neurol Neurosurg，2015，42（3）：244-247.doi：10.16636/j.cnki.jinn.2015.03.024.