美托洛爾對腹主動脈縮窄大鼠心肌CalpainⅠ、CaN信號通路的影響

姚健 ，朱健華 ，盛紅專 △

心肌肥厚作為心臟對多種刺激的適應性反應，早期可減輕室壁壓，維持心功能；但長期的心肌肥厚可導致心肌缺血、心律失常、心衰甚至猝死，逆轉(zhuǎn)心肌肥厚可改善預后。研究顯示，β受體阻滯劑可預防或逆轉(zhuǎn)心肌肥厚［1-2］。鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶（calcineurin，CaN）是迄今發(fā)現(xiàn)的唯一受鈣/鈣調(diào)素活化的蛋白磷酸酶，其通過介導底物——核轉(zhuǎn)錄因子3的去磷酸化實現(xiàn)核轉(zhuǎn)移，從而在多種原因所致的心肌肥厚中發(fā)揮重要作用，抑制CaN信號通路可預防和逆轉(zhuǎn)心肌肥厚［3］。鈣蛋白酶Ⅰ（CalpainⅠ）是一種Ca2+依賴性的半胱氨酸蛋白激酶，活化的CalpainⅠ在體外可剪切上百種蛋白。Burkard等［4］利用培養(yǎng)心肌細胞的方法已證實，血管緊張素Ⅱ可誘導CalpainⅠ活化后CaN羧基端的蛋白水解活化，推測存在CalpainⅠ作為上游信號因子調(diào)控CaN活性的信號通路。本實驗采用腹主動脈縮窄致壓力超負荷的大鼠心肌肥厚模型，以β受體阻滯劑美托洛爾干預，觀察大鼠心肌肥厚程度及心肌中CalpainⅠ和CaN的變化，探討CalpainⅠ、CaN信號通路在美托洛爾預防壓力超負荷所致心肌肥厚中的作用。

1 材料與方法

1.1 大鼠心肌肥厚模型的制備與分組 清潔級健康、雄性SD 大鼠 30只，7～8周齡，體質(zhì)量（200±20）g，購自上海西普爾必凱實驗動物有限公司。參考文獻［5］將大鼠麻醉后制備腹主動脈縮窄的壓力超負荷模型。大鼠隨機均分為假手術(shù)組（不縮窄腹主動脈，其余步驟同手術(shù)組）、手術(shù)組（單純行腹主動脈縮窄術(shù)）、美托洛爾組（在腹主動脈縮窄基礎(chǔ)上予美托洛爾每天灌胃），每組10只。美托洛爾組在手術(shù)當日始予美托洛爾（由阿斯利康公司提供）30 mg/（kg·d）灌胃，假手術(shù)組和手術(shù)組喂以等量生理鹽水，共4周。其中手術(shù)組和美托洛爾組在術(shù)后1周內(nèi)各死亡1只。

1.2 大鼠血壓、心肌標本采集與質(zhì)量測定 術(shù)后4周，各組大鼠稱體質(zhì)量（body weight，BW）后以2%戊巴比妥鈉2 mL/kg腹腔注射麻醉后分離左側(cè)頸總動脈，插入內(nèi)充有肝素及生理鹽水的導管，記錄動脈血壓［收縮壓（SBP）/舒張壓（DBP）］，隨后處死大鼠，取出心臟，用冰生理鹽水沖去余血，濾紙吸干水分，電子天平稱取左心室質(zhì)量（left ventricular weight，LVW），以左心室質(zhì)量/體質(zhì)量（LVW/BW，單位：mg/g）作為判斷大鼠心肌肥厚程度的指標［5］。

1.3 逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）法檢測CaN mRNA表達 取大鼠左室心肌組織50～100 mg，用TRIzol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后進行PCR擴增。PCR反應條件、引物序列等參考本研究組前期研究［6］進行，并對PCR產(chǎn)物行直接測序證實準確性。

1.4 Western blot法檢測CaN和CalpainⅠ蛋白質(zhì)表達 取大鼠左室心肌組織100 mg，提取心肌胞漿蛋白，BCA法測定蛋白濃度，參照文獻［6］以GAPDH為內(nèi)參進行目的蛋白CaN和CalpainⅠ蛋白表達量測定，結(jié)果以目的蛋白CaN或CalpainⅠ與GAPDH蛋白條帶的光密度比值表示。

1.5 CaN活性測定 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（Calcineurin Cellular Activity Assay Kit，Colorimetric Merck公司）檢測。在酶標儀A620處讀取吸光度（A）值，用試劑盒中的CaN標準品制備關(guān)于CaN活性與吸光度的標準曲線，根據(jù)各個樣本測定的A值和標準曲線計算CaN酶活性［6］。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間均數(shù)比較用單因素方差分析，組間多重比較用q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠心肌肥厚程度及血壓的變化 腹主動脈縮窄術(shù)后4周，手術(shù)組大鼠SBP、DBP、LVW/BW均較假手術(shù)組增高（P＜0.05）；美托洛爾組大鼠SBP、DBP雖較手術(shù)組略下降，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），且仍高于假手術(shù)組（P＜0.05）。與手術(shù)組相比，美托洛爾組大鼠LVW/BW下降（P＜0.05），與假手術(shù)組差異無統(tǒng)計學意義，見表1。

Tab.1 The changes of cardiac hypertrophy and blood pressure in three groups of rats表1 各組大鼠左心室心肌肥厚程度與血壓變化（±s）

Tab.1 The changes of cardiac hypertrophy and blood pressure in three groups of rats表1 各組大鼠左心室心肌肥厚程度與血壓變化（±s）

＊P＜0.05；a與假手術(shù)組比較，b與手術(shù)組比較，P＜0.05；表2同；1 mmHg=0.133 kPa

2.2 CaN mRNA、蛋白表達和活性變化 手術(shù)組心肌CaN mRNA、CaN蛋白及活性較假手術(shù)組均升高（P＜0.05）。美托洛爾組3個指標較手術(shù)組下降（P＜0.05），但與假手術(shù)組差異均無統(tǒng)計學意義，見表2、圖 2。

Tab.2 The changes of protein expression and activity of CaN mRNA in three groups表2 各組大鼠心肌中CaN mRNA、蛋白表達和活性變化（±s）

Tab.2 The changes of protein expression and activity of CaN mRNA in three groups表2 各組大鼠心肌中CaN mRNA、蛋白表達和活性變化（±s）

2.3 CalpainⅠ蛋白表達的變化 假手術(shù)組、手術(shù)組及美托洛爾組心肌CalpainⅠ蛋白表達量分別為0.233±0.018、0.613±0.086 和 0.326±0.102（F=10.286，P＜0.05），其中手術(shù)組為假手術(shù)組 2.63倍（P＜0.05）；美托洛爾組較手術(shù)組下降（P＜0.05），見圖2。

Fig.1 The changes of CaN protein expression in three groups of rat heart tissues圖1 大鼠心肌CaN蛋白表達變化

Fig.2 The changes of protein expression of CalpainⅠin three groups of rat heart tissues圖2 大鼠心肌CalpainⅠ蛋白表達的變化

3 討論

心肌肥厚早期可維持心功能，但長期的心肌肥厚可導致心臟多種并發(fā)癥發(fā)生，β受體阻滯劑可預防或逆轉(zhuǎn)心肌肥厚。本研究結(jié)果顯示，腹主動脈縮窄術(shù)后4周，手術(shù)組大鼠SBP、DBP及LVW/BW較假手術(shù)組顯著升高，提示模型制備成功，大鼠發(fā)生了血壓升高、心肌肥厚。CaN是一種受鈣和鈣調(diào)素活化的蛋白磷酸酶，當胞內(nèi)鈣離子濃度升高時，CaN與鈣、鈣調(diào)素結(jié)合，CaN自主抑制區(qū)發(fā)生變構(gòu)、移位，對催化區(qū)的抑制消失，CaN活化；活化的CaN可導致底物——核轉(zhuǎn)錄因子3的去磷酸化并核轉(zhuǎn)移，從而介導多種胚心基因表達、心肌肥厚。本實驗中手術(shù)組在發(fā)生心肌肥厚同時，心肌中CaN活性高于假手術(shù)組，同時還存在CaN mRNA和蛋白表達水平較假手術(shù)組升高，提示CaN參與了壓力負荷增加所致的大鼠心肌肥厚過程；且CaN在此過程不僅存在活性水平改變，還存在基因和蛋白水平的調(diào)節(jié)［6］。CalpainⅠ作為一種Ca2+依賴性的半胱氨酸蛋白激酶，通過對多種底物酶的剪切活化，從而在心肌細胞凋亡、心肌肥厚中發(fā)揮作用［7］。本實驗發(fā)現(xiàn)，手術(shù)組肥厚心肌中CalpainⅠ蛋白表達水平顯著高于假手術(shù)組；美托洛爾組大鼠LVW/BW較手術(shù)組顯著下降的同時，CalpainⅠ蛋白表達下降，提示CalpainⅠ也參與了腹主動脈縮窄、壓力負荷增高所致的大鼠心肌肥厚過程。

本實驗中美托洛爾組大鼠LVW/BW低于手術(shù)組，提示美托洛爾可預防腹主動脈縮窄、壓力超負荷所致心肌肥厚。與手術(shù)組相比，美托洛爾在預防心肌肥厚的同時，不僅存在心肌CaN mRNA、蛋白質(zhì)表達下調(diào)和CaN活性下降，還存在CalpainⅠ蛋白質(zhì)表達下調(diào)，提示美托洛爾通過調(diào)控CalpainⅠ、CaN信號通路預防壓力超負荷心肌肥厚的發(fā)生。

在培養(yǎng)的心肌細胞中發(fā)現(xiàn)，血管緊張素Ⅱ的刺激可誘導CalpainⅠ活化后CaN含自主抑制區(qū)的羧基端蛋白水解，致CaN的持續(xù)活化［4］。另有對人類心臟的研究發(fā)現(xiàn)，兩種類型的Calpain（CalpainⅠ和CalpainⅡ）均可以導致CaN含自主抑制區(qū)的羧基端降解，致CaN持續(xù)活化，提示在心臟中存在Calpain致CaN水解活化的信號通路［8］；且該通路參與了心臟瓣膜病合并糖尿病患者心律失?！款澋陌l(fā)生過程［9］；Calpain內(nèi)源性抑制劑 Calpastatin過表達可通過降低Calpain和CaN活性，達到預防氧化應激所致的線粒體損傷和人神經(jīng)母細胞死亡的作用［10］。

本研究中，手術(shù)組肥厚心肌中CalpainⅠ表達上調(diào)的同時存在CaN活性增加，美托洛爾組大鼠在心肌肥厚受抑的同時存在CalpainⅠ表達下調(diào)，并CaN活性下降，提示美托洛爾可通過抑制CalpainⅠ調(diào)控的CaN信號通路預防腹主動脈縮窄大鼠的心肌肥厚。

［1］Xing F，Chen J，Zhao B，et al.Real role of β-blockers in regression of left ventricular mass in hypertension patients:Bayesian network meta-analysis［J］.Medicine（Baltimore），2017，96（10）：e6290.doi：10.1097/MD.0000000000006290.

［2］Rizzi E，Guimaraes DA，Ceron CS，et al.β1-Adrenergic blockers exert antioxidant effects，reduce matrix metalloproteinase activity，and improve renovascular hypertension-induced cardiac hypertrophy［J］.Free Radic Biol Med，2014，73：308-317.doi：10.1016/j.freeradbiomed.2014.05.024.

［3］Dierck F，Kuhn C，Rohr C，et al.The novel cardiac z-disc protein CEFIP regulates cardiomyocyte hypertrophy by modulating calcineurin signaling［J］.J Biol Chem，2017，292（37）：15180-15191.doi：10.1074/jbc.M117.786764.

［4］Burkard N，Becher J，Heindl C，et al.Targeted proteolysis sustains calcineurin activation［J］.Circulation，2005，111（18）：1045-1053.doi：10.1161/01.CIR.0000156458.80515.F7.

［5］姚健，盛紅專，陸曉晨，等.美托洛爾對腹主動脈縮窄大鼠心肌雙特異性酪氨酸磷酸化調(diào)節(jié)激酶1A-可變剪接因子-鈣/鈣調(diào)素依賴蛋白激酶Ⅱδ信號通路的影響［J］.中華心血管病雜志，2013，41（12）：1029-1033.Yao J，Sheng HZ，Lu XC，et al.Metoprolol attenuates pressure overload-induced myocardial hypertrophy through modulating Dryk1A-ASF-CaMKIIδ signaling pathways［J］.Chin J Cardiol，2013，41（12）：1029-1033.doi：10.3760/cma.j.issn.0253-3758.2013.12.009.

［6］陸盡亞，朱健華，秦小同，等.纈沙坦對腎血管性高血壓大鼠心肌鈣蛋白酶I、鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶和鈣/鈣調(diào)素依賴蛋白激酶IIδ的影響［J］.中華心血管病雜志，2012，40（6）：511-515.Lu JY，Zhu JH，Qin XT，et al.Role of valsartan on myocardial Calpain I，calcineurin and Ca/calmodulin-dependent protein kinase IIδ expression of renovascular hypertensive rats［J］.Chin J Cardiol，2012，40（6）：511-515.doi：10.3760/cma.j.issn.0253-3758.2012.06.012.

［7］Ye T，Wang Q，Zhang Y，et al.Over-expression of calpastatin inhibits calpain activation and attenuates post-infarction myocardial remodeling［J］.PLoS One，2015，10（3）：e0120178.doi：10.1371/journal.pone.0120178.

［8］Wang JC，Zhao Y，Li XD，et al.Proteolysis by endogenous calpain I leads to the activation of calcineurin in human heart［J］.Clin Lab，2012，58（11/12）：1145-1152.doi：10.1371/journal.pone.0120178.

［9］Zhao Y，Cui GM，Zhou NN，et al.Calpain-calcineurin-nuclear factor signaling and the development of atrial fibrillation in patients with valvular heart disease and diabetes［J］.J Diabetes Res，2016，2016：4639654.doi：10.1155/2016/4639654.

［10］Tangmansakulchai K，Abubakar Z，Kitiyanant N，et al.Calpastatin overexpression reduces oxidative stress-induced mitochondrial impairment and cell death in human neuroblastoma SH-SY5Y cells by decreasing calpain and calcineurin activation，induction of mitochondrial fission and destruction of mitochondrial fusion［J］.Mitochondrion，2016，30：151-161.doi：10.1016/j.mito.2016.07.009.