綿羊CD9基因g.208082881C＞A位點多態(tài)性與產(chǎn)羔數(shù)的關聯(lián)分析

湯繼順 ，狄 冉 ，劉秋月 ，王翔宇 ，胡文萍 ，儲明星 （.中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，北京 0093；2.安徽省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，合肥 23003）

產(chǎn)羔數(shù)是影響綿羊生產(chǎn)效率的主要因素之一，但產(chǎn)羔數(shù)是一個低遺傳力的性狀，不僅受遺傳基因的控制，還受性別和年齡等的制約，難以用常規(guī)的育種技術來選擇。Gabina［1］報道，將繁殖性狀合并為一個選擇指數(shù)，根據(jù)母綿羊各自的生產(chǎn)性能對母羊進行選擇時，產(chǎn)羔數(shù)是其中最重要的一個性狀，其對遺傳進展的經(jīng)濟效益貢獻為74%～96%，找到與產(chǎn)羔數(shù)相關的主效基因或有效分子遺傳標記是現(xiàn)代綿羊分子育種的關鍵。影響產(chǎn)羔性能的因素很多，主要有外界因素（飼料營養(yǎng)、配種方式和公羊效應等）和遺傳因素等，其中遺傳因素是內(nèi)在因素，決定著排卵數(shù)的多少和受胎率的高低等，而受胎率也與精卵融合效率密切關聯(lián)。精卵融合的過程涉及到精子和卵子細胞膜表面的一系列分子參與其中［2-4］。研究發(fā)現(xiàn)，精子表面存在精卵結合蛋白Izumo1［5-6］，在哺乳動物卵子質(zhì)膜上除了必需受體蛋白葉酸受體4（Juno）與Izumo1相互作用外，白細胞分化抗原簇9（cluster of differentiation antigen 9，CD9）在哺乳動物的精卵質(zhì)膜融合過程中也起著關鍵作用［7-8］。CD9蛋白屬于跨膜4超家族（transmembrane 4 superfamily，TM4SF）成員，是一種跨膜糖蛋白，大多分布在細胞膜，少數(shù)分布在細胞的板狀偽足、絲狀偽足和細胞囊泡中［9］。近年來發(fā)現(xiàn)，精卵融合效率對哺乳動物的受胎率有著重要影響，因此CD9等基因得到重視并逐漸展開了深入研究［10-12］。

全基因組重測序是目前動植物疾病、生產(chǎn)以及經(jīng)濟性狀等功能基因挖掘最主要的方法之一［13-15］。對多個群體進行選擇信號檢測常用的方法是群體分化指數(shù)（Fst）法，F(xiàn)st是檢測群體間遺傳分化的重要指標之一，通過對全基因組范圍內(nèi)的單個位點Fst（0＜Fst＜1，1表示該區(qū)域種群完全分化）估值就能對每個位點分析其分化程度，最終實現(xiàn)選擇信號檢測［16］。因此，針對產(chǎn)羔數(shù)性狀不同的綿羊品種（多羔和單羔），利用本課題組前期重測序結果并使用Fst方法對多羔組和單羔組分化程度進行分析并鑒定選擇信號，從而篩選出與綿羊產(chǎn)羔數(shù)相關的候選基因CD9基因g.208082881C＞A位點。

本研究以繁殖力存在差異的綿羊品種為試驗對象，結合多重PCR技術、Mass ARRAY IPLEX單堿基延伸技術和基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時間質(zhì)譜分析質(zhì)譜技術（matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight，MALDI-TOF）進行分型檢測［17-18］，快速檢測綿羊CD9基因g.208082881C＞A位點多態(tài)性并分析其與產(chǎn)羔數(shù)性狀的關系，以期為綿羊高繁殖力性狀的標記輔助早期選擇提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

血液樣品來源：小尾寒羊、蘇尼特羊、灘羊、草原藏羊、薩?？搜蚝投挪囱?個綿羊品種，總共760只，其中小尾寒羊為多羔品種，其他都是單羔品種。各試驗綿羊群體均健康狀況良好，飼養(yǎng)條件相對一致，同時記錄小尾寒羊頭3胎產(chǎn)羔記錄。每只綿羊頸靜脈采血10 mL，采用檸檬酸葡萄糖抗凝，-20℃保存。其中小尾寒羊血液樣本380份采自山東省鄆城縣，蘇尼特羊血液樣本100份采自天津市畜牧獸醫(yī)研究所種羊場，灘羊血液樣本80份采自寧夏鹽池縣，草原藏羊血液樣本131份采自西藏當雄縣，薩?？搜蜓簶颖?9份和杜泊羊血液樣品30份均采自北京市順義區(qū)北京奧鑫牧業(yè)有限公司。

1.2 主要儀器與試劑

基因分型鑒定委托北京君諾德生物技術有限公司完成。主要儀器和試劑：基因擴增為ABI GeneAmp9700 384 Dual，質(zhì)譜點樣為MassARRA-Y Nanodispenser RS 1000，質(zhì)譜分析為MassARRAY Compact System，試劑為Complete Genotyping Reagent Kit for Mass ARRAYCompact 384。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取和純度質(zhì)控 DNA提取根據(jù)天根生化科技（北京）有限公司血液基因組EasyPureTMBlood Genomic DNA Kit試劑盒說明步驟進行，提取的DNA樣品濃度采用微量紫外分光光度計檢測（Nano Drop2000）DNA OD值，并通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳對DNA質(zhì)量進行檢測。分型樣品選擇：6個綿羊品種DNA，每個樣品需要量 20 μL，DNA 最終濃度 10～30 ng/μL。

1.3.2 引物設計及引物質(zhì)控 根據(jù)SNP位點序列信息，采用Sequenom公司的引物設計軟件Assay design 3.1設計PCR反應和單堿基擴增引物并合成（見表1）。通過MALDI-TOF進行質(zhì)檢，將引物稀釋到質(zhì)譜反應所需濃度。具體操作：吸取2 μL延伸引物加到40 μL ddH2O中，進行質(zhì)譜檢測。配置PCR引物儲備液，終濃度100 μmol/L；配置單堿基引物儲備液，終濃度500 μmol/L。

表1 PCR反應和單堿基擴增引物

1.3.3 PCR反應 5 μL的PCR反應體系中含有ddH2O 1.8 μL，10×PCR Buffer 0.5 μL，MgCl2（25 mM）0.4 μL，dNTP（25 mM）0.1 μL，Hotstar Taq（5 U/μL）0.2 μL，PCR Primer mix 1 μL，待檢測 DNA 樣品 1 μL。

PCR 擴增條件：95℃預變性 2 min；95℃變性 30 s，56℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，共 45 個循環(huán)；最后 72℃延伸5 min，25℃保存。

1.3.4 PCR產(chǎn)物純化 利用SAP酶去除PCR產(chǎn)物中剩余的dNTP，以保證單堿基延伸的準確性。

SAP酶消化反應：配制SAP酶Mix，2 μL反應體系中含有 ddH2O 1.53 μL，SAP Buffer 0.17 μL，SAP Enzyme 0.3 μL。在 PCR 儀中進行 SAP 酶消化：37℃ 40 min，85℃5 min，25℃保存。

1.3.5 單堿基延伸 配制Mix，2 μL反應體系中含有ddH2O0.619μL，iPLEXBuffer0.2μL，Terminatormix0.2μL，Extend primer mix 0.94 μL，iPLEX Enzyme 0.041 μL。

反應體系：94℃預變性 30 s；94℃ 5 s，52℃ 5 s，80℃5 s，40 個循環(huán)；52℃ 5 s，80℃ 5 s，5 個循環(huán)；最后 72℃延伸 3 min，25℃保存。

1.3.6 樹脂純化 將Clean Resin樹脂平鋪到6 mg的樹脂板中，加16 μL ddH2O到延伸產(chǎn)物的對應孔內(nèi)，將干燥后的樹脂倒入延伸產(chǎn)物板中，封膜，低速（2 000 r/min）垂直旋轉30 min，使樹脂與反應物充分接觸，離心使樹脂沉入孔底部。將脫鹽處理后的樣品點在樣品靶上，自然結晶。

1.4 基因分型

樣品樹脂純化后，啟動Mass ARRAY Nano dispenser RS1000點樣儀，將樹脂純化后的延伸產(chǎn)物移至384孔SpectroCHIP（Sequenom）芯片上，并用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜進行分析，檢測結果用TYPER 4.0軟件完成分型，并輸出結果。

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft Excel 2016軟件統(tǒng)計綿羊CD9基因g.208082881C＞A位點的基因型頻率、等位基因頻率、多態(tài)信息含量（polymorphism information content，PIC）、雜合度（heterozygosity，He）和有效等位基因數(shù)（effective number of allele，Ne），并進行 Hardy-Weinberg 平衡檢測。使用SPSS 22.0軟件程序中一般線性模型中單因素方差分析的最小顯著差異（least significant difference，LSD）法對小尾寒羊基因型與產(chǎn)羔表型數(shù)據(jù)進行關聯(lián)分析。

2 結果與分析

2.1 DNA提取純度質(zhì)控和引物質(zhì)控

由圖1A得知，采用濃度為1.5%瓊脂糖凝膠，電泳電壓5 v/cm，時間20 min，電泳檢測膠發(fā)現(xiàn)，DNA條帶單一、清晰、無雜質(zhì)，沒有彌散、拖尾現(xiàn)象。

圖1 DNA提取純度檢測和引物質(zhì)控

由圖1B得知，設計的延伸引物進行質(zhì)譜檢測后，所得峰圖分子量與理論值一致，無雜峰。

2.2 CD9基因多態(tài)性分析

通過基因分型發(fā)現(xiàn)，CD9基因g.208082881C＞A位點在單、多羔綿羊品種中均存在兩種基因型，分別是AA和CA。具體信息見圖2和表2。

由表2可知，綿羊CD9基因g.208082881C＞A位點等位基因頻率在單、多羔綿羊品種間差異達到極顯著水平（P＜0.01），且無論在單羔還是多羔品種中，A基因均是優(yōu)勢等位基因。

2.3 CD9基因g.208082881C＞A位點在不同綿羊品種中的群體遺傳學分析

由表3可知，綿羊CD9基因g.208082881C＞A位點在小尾寒羊、蘇尼特羊、灘羊、草原藏羊、薩?？搜蚓d羊品種中均為中度多態(tài)（0.25＜PIC＜0.5），在杜泊羊中表現(xiàn)為低度多態(tài)（PIC＜0.25）?？ǚ竭m合性檢驗結果表明，CD9基因g.208082881C＞A位點在杜泊羊群體中處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P ＞0.05），而在其余綿羊品種中均處于Hardy-Weinberg不平衡狀態(tài)（P＜0.05）。

2.4 CD9基因g.208082881C＞A位點與小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)的關系

由表4可知，CD9基因g.208082881C＞A位點2種基因型與小尾寒羊頭3胎產(chǎn)羔數(shù)之間并無顯著關聯(lián)（P＞0.05），但從第2胎和第3胎產(chǎn)羔數(shù)分析，AA型產(chǎn)羔數(shù)高于CA型。

圖2 CD9基因g.208082881C＞A位點分型結果

表2 CD9基因g.208082881C＞A位點在單羔、多羔綿羊品種中的基因型頻率和等位基因頻率

表3 CD9基因g.208082881C＞A位點在不同綿羊品種中的群體遺傳學分析

表4 CD9基因g.208082881C＞A位點2種基因型小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)

3 討論

3.1 CD9基因功能及對哺乳動物精卵融合的影響

CD9是存在于包括卵母細胞等多種細胞的細胞膜中的一種糖蛋白，相對分子質(zhì)量為24 kD，編碼226個氨基酸的肽鏈，含典型TM4SF蛋白特征序列——CCG基序［19-20］。綿羊的CD9基因定位于第3號染色體上，包含7個外顯子。在哺乳動物精卵融合過程中CD9直接參與精子和卵子的膜融合過程，并在其中起到關鍵性的作用［9，21-22］。Bianchi等［23］利用小鼠研究發(fā)現(xiàn)，CD9可能調(diào)控Juno結構，從而能促進Juno與Izumo1結合。此外，CD9還參與細胞支持、黏附、運動、增殖以及腫瘤細胞的轉移等［24-26］。

CD9基因在造血細胞、骨髓細胞、腦細胞、肌肉細胞、生殖器官和卵母細胞表面都有分布，并可與多種分子等形成蛋白質(zhì)復合體參與功能表達［27-28］。周思暢等［25］研究發(fā)現(xiàn)，小鼠未成熟的卵母細胞膜上有強的CD9基因表達，在完全成熟的卵母細胞膜上CD9基因表達最強。隨著綿羊卵泡的形成，在初級卵泡期就能檢測到CD9熒光信號，成熟的卵母細胞CD9mRNA表達量顯著增加［11］。此外，Li等［29］研究表明，豬卵母細胞成熟期CD9顯著增多，從而提示其與卵細胞受精能力有關。

目前，哺乳動物CD9的研究熱點主要集中在受精過程中胞外受體識別、胞內(nèi)信號傳導通路以及與其他細胞因子的關系等方面。體外實驗證實，CD9基因敲除（CD9-/-）實驗進一步確認了CD9蛋白在精卵融合過程中的關鍵地位。2011年Fanaei等發(fā)現(xiàn)，雌性小鼠（CD9-/-）的卵子不能與精子融合而導致受精失敗［30］。采用免疫共沉淀證明，CD9蛋白在卵質(zhì)膜上與整合素α6β1形成物理聯(lián)結，可引起整合素介導的膜脂筏（lipid raft）微域結構信號傳導反應，如細胞內(nèi)pH值、細胞質(zhì)鈣水平、磷脂代謝、氨基酸（酪氨酸、絲氨酸和蘇氨酸）磷酸化的改變以及基因表達，從而促進精卵融合［31］。

3.2 CD9基因g.208082881C＞A位點多態(tài)性與產(chǎn)羔數(shù)的關系

在群體遺傳結構分析中多態(tài)信息含量（PIC）是衡量基因變異位點程度高低的指標。PIC＞0.50表示該位點高度多態(tài)性；PIC在0.25～0.50之間為中度多態(tài)性；PIC＜0.25為低度多態(tài)性［32］。有效等位基因數(shù)（Ne）反映等位基因之間的相互影響，Ne越接近等位基因的絕對數(shù)，表明人工選擇壓力就越大。雜合度（He）是反映某位點上遺傳變異量大小的指標。若PIC高，有效等位基因數(shù)目Ne多，He大，表明該群體在該位點的遺傳變異程度高［33］。

本研究選擇的CD9基因g.208082881C＞A位點通過群體遺傳學分析發(fā)現(xiàn)，在小尾寒羊、蘇尼特羊、灘羊、草原藏羊和薩?？搜蚓d羊品種中，PIC在0.25～0.50之間，為中度多態(tài)，表明該位點在這些綿羊群體中存在較強的選擇潛力。在杜泊羊品種中處于低度多態(tài)（0.21），表明該位點在杜泊羊中的遺傳多樣性則相對貧乏。小尾寒羊、蘇尼特羊、灘羊、薩?？搜蚝筒菰匮虻腍e和Ne分別在0.38～0.49和1.60～1.95間，說明這幾個綿羊品種遺傳變異程度高。進一步分析發(fā)現(xiàn)，CD9基因g.208082881C＞A位點在小尾寒羊、蘇尼特羊、灘羊、草原藏羊和薩?？搜蚓d羊品種中均處于Hardy-Weinberg不平衡狀態(tài)，可能是因為自然選擇或人工選擇對該位點分布影響較大，或與試驗選擇的羊品種數(shù)量較少有關。通過基因分型發(fā)現(xiàn)，該位點在單羔、多羔綿羊品種中都只存在AA和CA型。與產(chǎn)羔數(shù)關聯(lián)分析結果顯示，AA和CA型與小尾寒羊的頭3胎的產(chǎn)羔數(shù)并無顯著關聯(lián)（P＞0.05），但從第2胎開始AA型產(chǎn)羔數(shù)高于CA型，推測該位點突變在一定程度上提高了小尾寒羊的產(chǎn)羔能力。

4 結論

本研究表明，綿羊CD9基因g.208082881C＞A位點在小尾寒羊、蘇尼特羊、灘羊、草原藏羊和薩?？搜蚓d羊品種中存在較強的選擇潛力。AA和CA型小尾寒羊頭3胎產(chǎn)羔數(shù)并無顯著差異（P＞0.05），但從第2胎開始AA型產(chǎn)羔數(shù)高于CA型。

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