湯繼順 ,狄 冉 ,劉秋月 ,王翔宇 ,胡文萍 ,儲(chǔ)明星 (.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所,農(nóng)業(yè)部動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 0093;2.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,合肥 23003)
產(chǎn)羔數(shù)是影響綿羊生產(chǎn)效率的主要因素之一,但產(chǎn)羔數(shù)是一個(gè)低遺傳力的性狀,不僅受遺傳基因的控制,還受性別和年齡等的制約,難以用常規(guī)的育種技術(shù)來(lái)選擇。Gabina[1]報(bào)道,將繁殖性狀合并為一個(gè)選擇指數(shù),根據(jù)母綿羊各自的生產(chǎn)性能對(duì)母羊進(jìn)行選擇時(shí),產(chǎn)羔數(shù)是其中最重要的一個(gè)性狀,其對(duì)遺傳進(jìn)展的經(jīng)濟(jì)效益貢獻(xiàn)為74%~96%,找到與產(chǎn)羔數(shù)相關(guān)的主效基因或有效分子遺傳標(biāo)記是現(xiàn)代綿羊分子育種的關(guān)鍵。影響產(chǎn)羔性能的因素很多,主要有外界因素(飼料營(yíng)養(yǎng)、配種方式和公羊效應(yīng)等)和遺傳因素等,其中遺傳因素是內(nèi)在因素,決定著排卵數(shù)的多少和受胎率的高低等,而受胎率也與精卵融合效率密切關(guān)聯(lián)。精卵融合的過程涉及到精子和卵子細(xì)胞膜表面的一系列分子參與其中[2-4]。研究發(fā)現(xiàn),精子表面存在精卵結(jié)合蛋白Izumo1[5-6],在哺乳動(dòng)物卵子質(zhì)膜上除了必需受體蛋白葉酸受體4(Juno)與Izumo1相互作用外,白細(xì)胞分化抗原簇9(cluster of differentiation antigen 9,CD9)在哺乳動(dòng)物的精卵質(zhì)膜融合過程中也起著關(guān)鍵作用[7-8]。CD9蛋白屬于跨膜4超家族(transmembrane 4 superfamily,TM4SF)成員,是一種跨膜糖蛋白,大多分布在細(xì)胞膜,少數(shù)分布在細(xì)胞的板狀偽足、絲狀偽足和細(xì)胞囊泡中[9]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn),精卵融合效率對(duì)哺乳動(dòng)物的受胎率有著重要影響,因此CD9等基因得到重視并逐漸展開了深入研究[10-12]。
全基因組重測(cè)序是目前動(dòng)植物疾病、生產(chǎn)以及經(jīng)濟(jì)性狀等功能基因挖掘最主要的方法之一[13-15]。對(duì)多個(gè)群體進(jìn)行選擇信號(hào)檢測(cè)常用的方法是群體分化指數(shù)(Fst)法,F(xiàn)st是檢測(cè)群體間遺傳分化的重要指標(biāo)之一,通過對(duì)全基因組范圍內(nèi)的單個(gè)位點(diǎn)Fst(0<Fst<1,1表示該區(qū)域種群完全分化)估值就能對(duì)每個(gè)位點(diǎn)分析其分化程度,最終實(shí)現(xiàn)選擇信號(hào)檢測(cè)[16]。因此,針對(duì)產(chǎn)羔數(shù)性狀不同的綿羊品種(多羔和單羔),利用本課題組前期重測(cè)序結(jié)果并使用Fst方法對(duì)多羔組和單羔組分化程度進(jìn)行分析并鑒定選擇信號(hào),從而篩選出與綿羊產(chǎn)羔數(shù)相關(guān)的候選基因CD9基因g.208082881C>A位點(diǎn)。
本研究以繁殖力存在差異的綿羊品種為試驗(yàn)對(duì)象,結(jié)合多重PCR技術(shù)、Mass ARRAY IPLEX單堿基延伸技術(shù)和基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時(shí)間質(zhì)譜分析質(zhì)譜技術(shù)(matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight,MALDI-TOF)進(jìn)行分型檢測(cè)[17-18],快速檢測(cè)綿羊CD9基因g.208082881C>A位點(diǎn)多態(tài)性并分析其與產(chǎn)羔數(shù)性狀的關(guān)系,以期為綿羊高繁殖力性狀的標(biāo)記輔助早期選擇提供參考依據(jù)。
血液樣品來(lái)源:小尾寒羊、蘇尼特羊、灘羊、草原藏羊、薩??搜蚝投挪囱?個(gè)綿羊品種,總共760只,其中小尾寒羊?yàn)槎喔崞贩N,其他都是單羔品種。各試驗(yàn)綿羊群體均健康狀況良好,飼養(yǎng)條件相對(duì)一致,同時(shí)記錄小尾寒羊頭3胎產(chǎn)羔記錄。每只綿羊頸靜脈采血10 mL,采用檸檬酸葡萄糖抗凝,-20℃保存。其中小尾寒羊血液樣本380份采自山東省鄆城縣,蘇尼特羊血液樣本100份采自天津市畜牧獸醫(yī)研究所種羊場(chǎng),灘羊血液樣本80份采自寧夏鹽池縣,草原藏羊血液樣本131份采自西藏當(dāng)雄縣,薩??搜蜓簶颖?9份和杜泊羊血液樣品30份均采自北京市順義區(qū)北京奧鑫牧業(yè)有限公司。
基因分型鑒定委托北京君諾德生物技術(shù)有限公司完成。主要儀器和試劑:基因擴(kuò)增為ABI GeneAmp9700 384 Dual,質(zhì)譜點(diǎn)樣為MassARRA-Y Nanodispenser RS 1000,質(zhì)譜分析為MassARRAY Compact System,試劑為Complete Genotyping Reagent Kit for Mass ARRAYCompact 384。
1.3.1 DNA提取和純度質(zhì)控 DNA提取根據(jù)天根生化科技(北京)有限公司血液基因組EasyPureTMBlood Genomic DNA Kit試劑盒說(shuō)明步驟進(jìn)行,提取的DNA樣品濃度采用微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)(Nano Drop2000)DNA OD值,并通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)DNA質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)。分型樣品選擇:6個(gè)綿羊品種DNA,每個(gè)樣品需要量 20 μL,DNA 最終濃度 10~30 ng/μL。
1.3.2 引物設(shè)計(jì)及引物質(zhì)控 根據(jù)SNP位點(diǎn)序列信息,采用Sequenom公司的引物設(shè)計(jì)軟件Assay design 3.1設(shè)計(jì)PCR反應(yīng)和單堿基擴(kuò)增引物并合成(見表1)。通過MALDI-TOF進(jìn)行質(zhì)檢,將引物稀釋到質(zhì)譜反應(yīng)所需濃度。具體操作:吸取2 μL延伸引物加到40 μL ddH2O中,進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。配置PCR引物儲(chǔ)備液,終濃度100 μmol/L;配置單堿基引物儲(chǔ)備液,終濃度500 μmol/L。
表1 PCR反應(yīng)和單堿基擴(kuò)增引物
1.3.3 PCR反應(yīng) 5 μL的PCR反應(yīng)體系中含有ddH2O 1.8 μL,10×PCR Buffer 0.5 μL,MgCl2(25 mM)0.4 μL,dNTP(25 mM)0.1 μL,Hotstar Taq(5 U/μL)0.2 μL,PCR Primer mix 1 μL,待檢測(cè) DNA 樣品 1 μL。
PCR 擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性 2 min;95℃變性 30 s,56℃退火 30 s,72℃延伸 1 min,共 45 個(gè)循環(huán);最后 72℃延伸5 min,25℃保存。
1.3.4 PCR產(chǎn)物純化 利用SAP酶去除PCR產(chǎn)物中剩余的dNTP,以保證單堿基延伸的準(zhǔn)確性。
SAP酶消化反應(yīng):配制SAP酶Mix,2 μL反應(yīng)體系中含有 ddH2O 1.53 μL,SAP Buffer 0.17 μL,SAP Enzyme 0.3 μL。在 PCR 儀中進(jìn)行 SAP 酶消化:37℃ 40 min,85℃5 min,25℃保存。
1.3.5 單堿基延伸 配制Mix,2 μL反應(yīng)體系中含有ddH2O0.619μL,iPLEXBuffer0.2μL,Terminatormix0.2μL,Extend primer mix 0.94 μL,iPLEX Enzyme 0.041 μL。
反應(yīng)體系:94℃預(yù)變性 30 s;94℃ 5 s,52℃ 5 s,80℃5 s,40 個(gè)循環(huán);52℃ 5 s,80℃ 5 s,5 個(gè)循環(huán);最后 72℃延伸 3 min,25℃保存。
1.3.6 樹脂純化 將Clean Resin樹脂平鋪到6 mg的樹脂板中,加16 μL ddH2O到延伸產(chǎn)物的對(duì)應(yīng)孔內(nèi),將干燥后的樹脂倒入延伸產(chǎn)物板中,封膜,低速(2 000 r/min)垂直旋轉(zhuǎn)30 min,使樹脂與反應(yīng)物充分接觸,離心使樹脂沉入孔底部。將脫鹽處理后的樣品點(diǎn)在樣品靶上,自然結(jié)晶。
樣品樹脂純化后,啟動(dòng)Mass ARRAY Nano dispenser RS1000點(diǎn)樣儀,將樹脂純化后的延伸產(chǎn)物移至384孔SpectroCHIP(Sequenom)芯片上,并用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜進(jìn)行分析,檢測(cè)結(jié)果用TYPER 4.0軟件完成分型,并輸出結(jié)果。
使用Microsoft Excel 2016軟件統(tǒng)計(jì)綿羊CD9基因g.208082881C>A位點(diǎn)的基因型頻率、等位基因頻率、多態(tài)信息含量(polymorphism information content,PIC)、雜合度(heterozygosity,He)和有效等位基因數(shù)(effective number of allele,Ne),并進(jìn)行 Hardy-Weinberg 平衡檢測(cè)。使用SPSS 22.0軟件程序中一般線性模型中單因素方差分析的最小顯著差異(least significant difference,LSD)法對(duì)小尾寒羊基因型與產(chǎn)羔表型數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。
由圖1A得知,采用濃度為1.5%瓊脂糖凝膠,電泳電壓5 v/cm,時(shí)間20 min,電泳檢測(cè)膠發(fā)現(xiàn),DNA條帶單一、清晰、無(wú)雜質(zhì),沒有彌散、拖尾現(xiàn)象。
圖1 DNA提取純度檢測(cè)和引物質(zhì)控
由圖1B得知,設(shè)計(jì)的延伸引物進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)后,所得峰圖分子量與理論值一致,無(wú)雜峰。
通過基因分型發(fā)現(xiàn),CD9基因g.208082881C>A位點(diǎn)在單、多羔綿羊品種中均存在兩種基因型,分別是AA和CA。具體信息見圖2和表2。
由表2可知,綿羊CD9基因g.208082881C>A位點(diǎn)等位基因頻率在單、多羔綿羊品種間差異達(dá)到極顯著水平(P<0.01),且無(wú)論在單羔還是多羔品種中,A基因均是優(yōu)勢(shì)等位基因。
由表3可知,綿羊CD9基因g.208082881C>A位點(diǎn)在小尾寒羊、蘇尼特羊、灘羊、草原藏羊、薩福克羊綿羊品種中均為中度多態(tài)(0.25<PIC<0.5),在杜泊羊中表現(xiàn)為低度多態(tài)(PIC<0.25)??ǚ竭m合性檢驗(yàn)結(jié)果表明,CD9基因g.208082881C>A位點(diǎn)在杜泊羊群體中處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P >0.05),而在其余綿羊品種中均處于Hardy-Weinberg不平衡狀態(tài)(P<0.05)。
由表4可知,CD9基因g.208082881C>A位點(diǎn)2種基因型與小尾寒羊頭3胎產(chǎn)羔數(shù)之間并無(wú)顯著關(guān)聯(lián)(P>0.05),但從第2胎和第3胎產(chǎn)羔數(shù)分析,AA型產(chǎn)羔數(shù)高于CA型。
圖2 CD9基因g.208082881C>A位點(diǎn)分型結(jié)果
表2 CD9基因g.208082881C>A位點(diǎn)在單羔、多羔綿羊品種中的基因型頻率和等位基因頻率
表3 CD9基因g.208082881C>A位點(diǎn)在不同綿羊品種中的群體遺傳學(xué)分析
表4 CD9基因g.208082881C>A位點(diǎn)2種基因型小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)
CD9是存在于包括卵母細(xì)胞等多種細(xì)胞的細(xì)胞膜中的一種糖蛋白,相對(duì)分子質(zhì)量為24 kD,編碼226個(gè)氨基酸的肽鏈,含典型TM4SF蛋白特征序列——CCG基序[19-20]。綿羊的CD9基因定位于第3號(hào)染色體上,包含7個(gè)外顯子。在哺乳動(dòng)物精卵融合過程中CD9直接參與精子和卵子的膜融合過程,并在其中起到關(guān)鍵性的作用[9,21-22]。Bianchi等[23]利用小鼠研究發(fā)現(xiàn),CD9可能調(diào)控Juno結(jié)構(gòu),從而能促進(jìn)Juno與Izumo1結(jié)合。此外,CD9還參與細(xì)胞支持、黏附、運(yùn)動(dòng)、增殖以及腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移等[24-26]。
CD9基因在造血細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、腦細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、生殖器官和卵母細(xì)胞表面都有分布,并可與多種分子等形成蛋白質(zhì)復(fù)合體參與功能表達(dá)[27-28]。周思暢等[25]研究發(fā)現(xiàn),小鼠未成熟的卵母細(xì)胞膜上有強(qiáng)的CD9基因表達(dá),在完全成熟的卵母細(xì)胞膜上CD9基因表達(dá)最強(qiáng)。隨著綿羊卵泡的形成,在初級(jí)卵泡期就能檢測(cè)到CD9熒光信號(hào),成熟的卵母細(xì)胞CD9mRNA表達(dá)量顯著增加[11]。此外,Li等[29]研究表明,豬卵母細(xì)胞成熟期CD9顯著增多,從而提示其與卵細(xì)胞受精能力有關(guān)。
目前,哺乳動(dòng)物CD9的研究熱點(diǎn)主要集中在受精過程中胞外受體識(shí)別、胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路以及與其他細(xì)胞因子的關(guān)系等方面。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí),CD9基因敲除(CD9-/-)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確認(rèn)了CD9蛋白在精卵融合過程中的關(guān)鍵地位。2011年Fanaei等發(fā)現(xiàn),雌性小鼠(CD9-/-)的卵子不能與精子融合而導(dǎo)致受精失敗[30]。采用免疫共沉淀證明,CD9蛋白在卵質(zhì)膜上與整合素α6β1形成物理聯(lián)結(jié),可引起整合素介導(dǎo)的膜脂筏(lipid raft)微域結(jié)構(gòu)信號(hào)傳導(dǎo)反應(yīng),如細(xì)胞內(nèi)pH值、細(xì)胞質(zhì)鈣水平、磷脂代謝、氨基酸(酪氨酸、絲氨酸和蘇氨酸)磷酸化的改變以及基因表達(dá),從而促進(jìn)精卵融合[31]。
在群體遺傳結(jié)構(gòu)分析中多態(tài)信息含量(PIC)是衡量基因變異位點(diǎn)程度高低的指標(biāo)。PIC>0.50表示該位點(diǎn)高度多態(tài)性;PIC在0.25~0.50之間為中度多態(tài)性;PIC<0.25為低度多態(tài)性[32]。有效等位基因數(shù)(Ne)反映等位基因之間的相互影響,Ne越接近等位基因的絕對(duì)數(shù),表明人工選擇壓力就越大。雜合度(He)是反映某位點(diǎn)上遺傳變異量大小的指標(biāo)。若PIC高,有效等位基因數(shù)目Ne多,He大,表明該群體在該位點(diǎn)的遺傳變異程度高[33]。
本研究選擇的CD9基因g.208082881C>A位點(diǎn)通過群體遺傳學(xué)分析發(fā)現(xiàn),在小尾寒羊、蘇尼特羊、灘羊、草原藏羊和薩??搜蚓d羊品種中,PIC在0.25~0.50之間,為中度多態(tài),表明該位點(diǎn)在這些綿羊群體中存在較強(qiáng)的選擇潛力。在杜泊羊品種中處于低度多態(tài)(0.21),表明該位點(diǎn)在杜泊羊中的遺傳多樣性則相對(duì)貧乏。小尾寒羊、蘇尼特羊、灘羊、薩??搜蚝筒菰匮虻腍e和Ne分別在0.38~0.49和1.60~1.95間,說(shuō)明這幾個(gè)綿羊品種遺傳變異程度高。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),CD9基因g.208082881C>A位點(diǎn)在小尾寒羊、蘇尼特羊、灘羊、草原藏羊和薩??搜蚓d羊品種中均處于Hardy-Weinberg不平衡狀態(tài),可能是因?yàn)樽匀贿x擇或人工選擇對(duì)該位點(diǎn)分布影響較大,或與試驗(yàn)選擇的羊品種數(shù)量較少有關(guān)。通過基因分型發(fā)現(xiàn),該位點(diǎn)在單羔、多羔綿羊品種中都只存在AA和CA型。與產(chǎn)羔數(shù)關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示,AA和CA型與小尾寒羊的頭3胎的產(chǎn)羔數(shù)并無(wú)顯著關(guān)聯(lián)(P>0.05),但從第2胎開始AA型產(chǎn)羔數(shù)高于CA型,推測(cè)該位點(diǎn)突變?cè)谝欢ǔ潭壬咸岣吡诵∥埠虻漠a(chǎn)羔能力。
本研究表明,綿羊CD9基因g.208082881C>A位點(diǎn)在小尾寒羊、蘇尼特羊、灘羊、草原藏羊和薩??搜蚓d羊品種中存在較強(qiáng)的選擇潛力。AA和CA型小尾寒羊頭3胎產(chǎn)羔數(shù)并無(wú)顯著差異(P>0.05),但從第2胎開始AA型產(chǎn)羔數(shù)高于CA型。
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