自組裝多肽水凝膠的制備及其在細(xì)胞培養(yǎng)上的應(yīng)用

楊淇森

摘 要：在生命科學(xué)的研究中，多肽自組裝是一個(gè)相對前沿的領(lǐng)域，而基于多肽的水凝膠又是一種新型的生物材料，具有易于設(shè)計(jì)合成、制備簡單、生物相容性好的特點(diǎn)。本文從多肽分子自身組裝及外源分子輔助多肽自組裝兩個(gè)方面系統(tǒng)地總結(jié)了自組裝多肽水凝膠的制備方法，并對當(dāng)前多肽水凝膠的應(yīng)用熱點(diǎn)做出了評述，以期對多肽水凝膠未來的研究提供參考。

關(guān)鍵詞：自組裝多肽水凝膠；細(xì)胞培養(yǎng)；制備方法

中圖分類號：R318 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

0 引言

隨著科技的迅速發(fā)展，生活水平的提高，人們對于新型材料的需求日益迫切，現(xiàn)有的材料無法滿足生產(chǎn)實(shí)踐，于是人們把目光投向了生物材料，尤其是水凝膠。水凝膠是一種以水為分散介質(zhì)的凝膠，具有三維的空間結(jié)構(gòu)。多肽基水凝膠指的是以多肽大分子為主要構(gòu)件元件的形成的凝膠，在檢測、醫(yī)療、和食品等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用。多肽水凝膠的形成方式包括兩種，一種是通過化學(xué)交聯(lián)，其產(chǎn)物被稱為化學(xué)凝膠。這種結(jié)合方式形成的水凝膠強(qiáng)度大，但是對反應(yīng)條件要求高，同時(shí)產(chǎn)物難以具有響應(yīng)性。

另一種則是通過非共價(jià)相互作用如氫鍵、范德華力、靜電作用等物理作用力進(jìn)行結(jié)合，即大分子自組裝，其產(chǎn)物通常被稱為物理凝膠。這種結(jié)合方式反應(yīng)條件簡單，無需復(fù)雜的設(shè)備，組裝體系對于外界環(huán)境改變較為敏感，可以有效感知外界溫度、光、pH等條件，還具有一定的生物相容性。本文系統(tǒng)地總結(jié)了自組裝多肽水凝膠的制備方法，并對當(dāng)前多肽水凝膠的應(yīng)用熱點(diǎn)做出了評述，以期對多肽水凝膠未來的研究提供參考。

1 自組裝多肽水凝膠的制備方法

1.1 多肽分子自身組裝形成水凝膠

通過對多肽分子的構(gòu)成氨基酸序列進(jìn)行理性設(shè)計(jì)，可以使得多肽分子之間通過氫鍵、范德華力、疏水作用力等等自發(fā)組裝，當(dāng)濃度達(dá)到一定程度時(shí)，便可形成多肽水凝膠。比如2012年，康艷晶等人通過氨水揮發(fā)調(diào)整溶液pH值的方法，將多肽鏈pal-RLRRLRARARA自組裝形成了pH響應(yīng)性的智能水凝膠。在常溫下，由于中性及酸性條件下的精氨酸帶正電，上述多肽鏈由于靜電斥力無法形成凝膠，當(dāng)溶液呈堿性時(shí)多肽鏈間的斥力減小，從而形成凝膠；除此之外，2012年周慶翰等人，利用天然蠶絲纖維優(yōu)良的力學(xué)性能及良好的生物相容性設(shè)計(jì)了多肽序列RAG-16 （Ac-RADAGAGARADAGAGA-NH2），并利用精氨酸和天冬氨酸之間的靜電相互作用及鏈間疏水作用自組裝制備了RAG-16水凝膠。其儲能模量高達(dá)2723.9Pa，并且擁有良好的生物相容性。

1.2 外源分子輔助多肽自組裝制備水凝膠

由于大部分多肽鏈本身并不具備直接自組裝成凝膠的性能，在這種情況下，我們可以通過向體系中引入一些能夠起到橋連作用的分子，誘導(dǎo)水凝膠的形成。通常采用的橋連劑包括蛋白質(zhì)、金屬離子、小分子表面活性劑等等。

南開大學(xué)的Xiaoli Zhang 等人設(shè)計(jì)了可自組裝成纖維束的多肽鏈Nap-GEFYGGGWRESAI，但此種纖維束無法進(jìn)一步自發(fā)形成水凝膠。于是，他們在實(shí)驗(yàn)中引入了一種四聚體粘合蛋白ULD-TIP-1，這種蛋白將本來結(jié)合較為松散的多肽鏈組裝成的纖維束結(jié)合地更加緊密，相互連接形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。

2015年，蘇州大學(xué)的張芳研究了表面活性劑N-月桂酰肌氨酸鈉對誘導(dǎo)絲素蛋白形成水凝膠的影響，該分子可以包裹在蛋白質(zhì)分子的表面，由于多肽表面的電荷被屏蔽，分子間的斥力減弱，其分子無規(guī)卷曲向β折疊結(jié)構(gòu)發(fā)生改變從而形成水凝膠，這種水凝膠生物相容性良好，有一定的抗菌性能，在醫(yī)學(xué)上有著廣闊的應(yīng)用空間。

2011年Christopher M. Micklitsch 等人合成了多肽序列ZnBHP：IKVKIKVKVDPPTKIKVKIK， 多肽鏈的末端包括一個(gè)非天然氨基酸，該氨基酸具有兩個(gè)羧基殘基，可以與Zn2+絡(luò)合。在缺乏金屬離子的溶液環(huán)境下，多肽以非折疊狀態(tài)溶于緩沖溶液中，在富含Zn2+的溶液中，Zn2+與多肽鏈末端的非天然氨基酸結(jié)合，中和了多肽鏈自帶的負(fù)電荷，使肽鏈整體呈電中性，誘導(dǎo)多肽鏈折疊并在疏水相互作用的促使下，進(jìn)一步自組裝成富含β折疊片狀結(jié)構(gòu)的水凝膠。

類似的工作還有，Lin Chen等人設(shè)計(jì)了萘功能化的二肽，這種二肽具有一端親水一端疏水的結(jié)構(gòu)，在一定濃度下先組裝成膠束，隨著濃度的升高，再自組裝成蠕蟲狀結(jié)構(gòu)。此時(shí)，向溶液中加入鹽離子，在一定的pH條件下，鹽離子可與蠕蟲狀結(jié)構(gòu)上下兩條鏈中的羧基結(jié)合，從而誘導(dǎo)水凝膠的形成。

2 自組裝多肽水凝膠在細(xì)胞培養(yǎng)上的應(yīng)用

通過自組裝的方法制備出來的多肽水凝膠較之其他材料有著許多的優(yōu)勢。一般來說，多肽鏈的結(jié)構(gòu)組成易于根據(jù)具體需求來設(shè)計(jì)且合成方便，易于大規(guī)模制備；同時(shí)，多肽水凝膠常常具備一定的響應(yīng)性，比如隨著周圍環(huán)境如pH、溫度的變化而變化；再者，多肽水凝膠的基本組成單元是氨基酸，所以其生物相容性高，并且降解后無毒，因此該類水凝膠常用在細(xì)胞培養(yǎng)上，給細(xì)胞提供類似于體內(nèi)的三維生長環(huán)境。

目前有多種可形成凝膠的多肽商品化，的比較典型的是RADA16，如Todd C. Holmes使用重新設(shè)計(jì)的RAD16 I、II自組裝成水凝膠，并將小鼠的神經(jīng)細(xì)胞種植在其上，經(jīng)過一段時(shí)間的培養(yǎng)，小鼠神經(jīng)細(xì)胞狀態(tài)良好并且形成了突觸，接著將該體系注入小鼠體內(nèi)，結(jié)果表明小鼠未出現(xiàn)免疫排斥及炎癥反應(yīng)。

張峰等人將成骨細(xì)胞MC3T3-E1在RADA16水凝膠上培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)MC3T3-E1細(xì)胞能夠在凝膠上很好地黏附、伸展和增殖，有較高水平的ALP、OC表達(dá)及礦化基質(zhì)沉積，成骨基因RUNX2、AKP-2、OSX正常表達(dá)且其表達(dá)量隨著時(shí)間的推移不斷升高。

在此基礎(chǔ)上，趙剛等人將能夠阻斷細(xì)胞壁上腫瘤壞死因子信號通路的寡肽NBD與RADA16共混，制備出自組裝水凝膠，對比了NBD與RADA16共混水凝膠與單純RADA16水凝膠對小鼠前成骨細(xì)胞MC3T3-E1增值及分化的影響，發(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞在NBD與RADA16共混凝膠中成長情況比在單純RADA16中良好。除了培養(yǎng)成骨細(xì)胞，劉子佳等人還用RADA16-I培養(yǎng)了乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231，發(fā)現(xiàn)其生長狀態(tài)良好，呈現(xiàn)紡錘狀，證明RADA16-I支持腫瘤細(xì)胞三維培養(yǎng)。endprint

3 展望

本文介紹了多種自組裝多肽水凝膠的制備方法，這些方法方便高效 、同時(shí)可賦予水凝膠材料一些新的性能，極大地拓展了水凝膠的應(yīng)用范圍，在實(shí)踐中有著廣泛的應(yīng)用空間。本文還重點(diǎn)介紹了多肽水凝膠在細(xì)胞培養(yǎng)方面的應(yīng)用，由于其生物相容性好且能為細(xì)胞生長提供三維的環(huán)境，可以促進(jìn)細(xì)胞的生長及分化。正是基于自組裝多肽水凝膠的諸多優(yōu)勢，未來該水凝膠還可能在新物種培育、生物制品檢驗(yàn)、生物醫(yī)學(xué)等方面有著更加深入的應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)

[1] Antara Dasgupta， Julfikar Hassan Mondal， Peptide hydrogels， RSC Adv.， 2013， 3， 9117–9149.

[2]康艷晶，周希蕊，羅施中.pH響應(yīng)性雙親性多肽水凝膠pal-RLRRLRARARA的合成及表征[J].中國科技論文，2012（7）：437-441.

[3]周慶翰，林娟.天然氨基酸生物材料的自組裝與細(xì)胞相容性研究[J].生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志，2012（29）：898-902.

[4]Xiaoli Zhang，Xinlei Chu，Ling wang，Huaimin Wang，Gaolin Liang，Jinxiu Zhang，Jiafu Long， Zhimou Yang. Rational Design of Tetrameric Protein to Enhance Interactions between Self-Assembled Fibers Gives Molecular Hydrogels. Angew. Chem. 2012，124， 4464-4468.

[5]張芳，張珊珊，朱天，等. N-月桂酰肌氨酸鈉/絲素蛋白水凝膠的研究[J].絲綢，2014（51）：1-5.

[6]Christopher M. Micklitsch， Patrick J. Knerr， Monica C. Branco， RadhikaNagarkar，Darrin J. Pochan， and Joel P. Schneider.Zinc-Triggered Hydrogelation of a Self-Assembling b-HairpinPeptide. Angew. Chem. 2011，123，1615-1617.

[7] Lin Chen，a Guillaume Pont，b Kyle Morris，c Gudrun Lotze，d Adam Squires，d Louise C. Serpellcand Dave J. Adams. Salt-induced hydrogelation of functionalised-dipeptides at high pH.Chem. Commun.， 2011，47，12071-12073.

[8] Steven R Caliari，Jason A Burdick. A practical guide to hydrogels for cellculture. Nature Methods， 2016，13，405-414.

[9] Todd C. Holmes， Sonsoles de Lacalle， Xing Su， Guosong Liu， Alexander Rich， Shuguang Zhang. Extensive neurite outgrowth and active synapseformation on self-assembling peptide scaffolds. PNAS， 2000， 97，6728-6733.

[10]張鋒，任靈飛，應(yīng)永芳，等.成骨細(xì)胞在精-丙-天-丙 16 自組裝多肽水凝膠表面培養(yǎng)的研究[J].醫(yī)學(xué)研究雜志，2012（41）：72-75.

[11]趙剛，李京玲，王丹，等.新型自組裝水凝膠NBD/RADA16可促進(jìn)前成骨細(xì)胞的分化[J].中國組織工程研究，2014（18）：3329-3333.

[12]劉子佳，米坤，王貴俠，等.自組裝納米短肽RADA16-Ⅰ水凝膠在腫瘤細(xì)胞三維培養(yǎng)中的應(yīng)用[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2009（13）：1468-1471.endprint