芹菜素在Caco—2細(xì)胞的攝取研究

郭閃+田春鴻+賀元+張曉霞+田莉

摘要：目的 研究芹菜素在Caco-2細(xì)胞的攝取特性。方法 采用Caco-2單層細(xì)胞模型，研究芹菜素在不同時間、濃度、溫度、pH值、P-糖蛋白抑制劑條件下對細(xì)胞攝取的影響，采用HPLC測定芹菜素在細(xì)胞中的含量。結(jié)果 芹菜素在0.33～80 ?g/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.999 4）。芹菜素在Caco-2細(xì)胞的攝取呈現(xiàn)一定的時間、濃度和pH值依賴性，且P-糖蛋白抑制劑不能增加其攝取量。結(jié)論 該方法操作簡單、靈敏，P-糖蛋白未參與芹菜素的轉(zhuǎn)運(yùn)過程，芹菜素在Caco-2細(xì)胞的攝取主要是被動轉(zhuǎn)運(yùn)。

關(guān)鍵詞：芹菜素；Caco-2細(xì)胞；攝取；高效液相色譜法

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.02.017

中圖分類號：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）02-0074-05

Uptake Study on Apigenin in Caco-2 Cells

GUO Shan1， TIAN Chun-hong2， HE Yuan1， ZHANG Xiao-xia1， TIAN Li1，3

1. College of TCM， Xinjiang Medical University， Urumqi 830011， China；

2. Midong District Traditional Chinese Medicine Hospital of Urumqi， Urumqi 831400， China；

3. Xinjiang Key Laboratory of Famous Prescription and Science of Formula， Urumqi 830011， China

Abstract： Objective To study the uptake property of apigenin in Caco-2 cells. Methods Caco-2 cell monolayer model was used to research the effects of apigenin on cell uptake in different times， concentrations， temperatures， pH values， and P-gp inhibitors. HPLC was used to determine the content of apigenin in cells. Results The linearity of apigenin concentration curve was found in good linear range of 0.33–80 ?g/mL （r=0.999 4）. Uptake determination of apigenin in Caco-2 cells depended a certain of time， concentration and pH values， and P-gp inhibitors could not increase the apigenin uptake. Conclusion This method is simple and sensitive. P-gp is not involved in apigenin transport process， and uptake of apigenin in Caco-2 cells is mainly passive transported.

Keywords： apigenin； Caco-2 cells； uptake； HPLC

芹菜素是一種廣泛分布于水果、蔬菜、豆類、茶葉、中藥材中的黃酮類化合物，芹菜中含量最高。芹菜素的藥理活性較為廣泛，具有明確的抗腫瘤、抗氧化、降壓、抗炎、抗菌、抗病毒及心腦血管保護(hù)等藥理作用[1-2]，是一種具有研究潛力的活性成分。芹菜素在高親水性和非極性溶劑中的溶解性差，幾乎不溶于水，但可溶于熱乙醇、二甲基亞砜（DMSO）和稀氫氧化鉀溶液[3]。鑒于活性成分的藥效發(fā)揮與其吸收特性密切相關(guān)，而目前對芹菜素體內(nèi)吸收特性的研究較少，本試驗采用Caco-2單層細(xì)胞模型研究芹菜素的攝取特性，為含芹菜素的中藥及其制劑的劑型設(shè)計提供藥動學(xué)依據(jù)。

1 細(xì)胞、儀器與試藥

Caco-2細(xì)胞株購自武漢博士德生物工程有限公司，試驗所用細(xì)胞傳代數(shù)為20～40代。

1220LC高效液相色譜儀（美國Aglient公司），XS105型電子天平（德國梅特勒-托利多公司），TDL-40B型高速冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備總廠），CO-150型二氧化碳孵箱（美國NBS公司），MX6R型倒置顯微鏡（寧波舜宇儀器有限公司），SK-1型快速漩渦混合器（江蘇金壇醫(yī)療儀器廠），pHS-3型精密pH計（上海精科雷磁儀器廠），SpectraMax190酶標(biāo)儀（美國，Molecular Devices公司）。

芹菜素對照品（apigenin，批號150623，純度≥98%），上海谷研實業(yè)有限公司；DMEM培養(yǎng)基、非必需氨基酸、青霉素-鏈霉素雙抗液、胰蛋白酶、Hank's平衡鹽溶液（HBSS）、磷酸鹽緩沖液，美國Hyclone公司）；胎牛血清，美國Gibco公司；BCA蛋白分析試劑盒，美國Thermo公司；12孔培養(yǎng)板，美國Costar公司；增強(qiáng)型RIPA裂解液（批號AR0102-100），武漢博士德生物工程有限公司；維拉帕米（批號100223-200102）、環(huán)孢菌素A（批號130495-201303），中國食品藥品檢定研究院；二甲基亞砜（分析純），Sigma公司；甲醇、乙腈（色譜純），美國Fisher Scientific公司；超純水（自制）。endprint

2 方法與結(jié)果

2.1 Caco-2細(xì)胞中芹菜素測定方法的建立

2.1.1 色譜條件

COSMOSIL C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 ?m），流動相為乙腈-0.2%磷酸（40∶60），流速1 mL/min，檢測波長340 nm，進(jìn)樣量20 ?L，柱溫25 ℃。

2.1.2 專屬性試驗

在“2.1.1”項色譜條件下測定空白細(xì)胞混懸液、空白細(xì)胞混懸液+芹菜素對照品、芹菜素細(xì)胞攝取樣品，色譜圖見圖1。芹菜素細(xì)胞攝取樣品的保留時間為18.78 min，空白細(xì)胞混懸液+芹菜素對照品和芹菜素細(xì)胞攝取樣品的特征峰保留時間一致，空白細(xì)胞混懸液在保留時間內(nèi)無雜質(zhì)干擾，芹菜素色譜峰與相鄰色譜峰的分離度>1.5，理論塔板數(shù)>3000。

2.1.3 線性關(guān)系考察

精密稱取芹菜素對照品適量，以Hank's平衡鹽溶液-空白細(xì)胞裂解液-甲醇（2∶2∶96）混合液溶解稀釋為0.33、1.30、5.00、10.00、20.00、40.00、80.00 ?g/mL系列濃度的芹菜素對照品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)行分析，外標(biāo)法定量，以芹菜素峰面積（A）對濃度進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程A=1 000 000X-220 881（r=0.999 4），表明芹菜素在0.33～80.00 ?g/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.4 精密度試驗

按“2.1.3”項下方法分別配制芹菜素低、中、高濃度（5、25、50 ?g/mL）的質(zhì)量控制樣品，按“2.1.1”項下色譜條件測定峰面積。1 d內(nèi)重復(fù)測定6次，日內(nèi)精密度RSD為0.068%～0.521%；每日測定1次，連續(xù)測定6 d，日間精密度RSD為1.36%～4.22%。表明儀器精密度良好。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗

按“2.1.3”項下方法分別配制芹菜素低、中、高濃度（5、25、50 ?g/mL）的質(zhì)量控制樣品，按“2.1.1”項下色譜條件測定樣品在37、25 ℃條件下放置3 h及在4、-20 ℃條件下放置3 d的穩(wěn)定性，記錄峰面積。結(jié)果芹菜素RSD分別為0.09%～0.40%、0.055%～0.57%、1.91%～2.47%、1.14%～3.97%。表明樣品穩(wěn)定性良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗

按“2.1.3”項下方法分別配制芹菜素低、中、高濃度（5、25、50 ?g/mL）的質(zhì)量控制樣品各6份，按“2.1.1”項下色譜條件測定，結(jié)果RSD為1.57%～4.82%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.1.7 加樣回收率試驗

按“2.1.3”項下方法分別配制芹菜素低、中、高濃度（5、25、50 ?g/mL）的質(zhì)量控制樣品，按“2.1.1”項下色譜條件分別進(jìn)樣3次，記錄峰面積，計算回收率。結(jié)果回收率分別為91.87%、98.24%、104.46%，符合測定要求。

2.2 芹菜素對Caco-2細(xì)胞生長的影響

2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)于10%DMEM高糖培養(yǎng)液（含10%FBS、1%青霉素-鏈霉素、1%非必需氨基酸等）中，在37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80%～90%融合時，取對數(shù)生長期的Caco-2細(xì)胞，用胰酶消化后，用10%完全培養(yǎng)液混懸，調(diào)整細(xì)胞密度至適宜濃度（約5×105個/mL），置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2.2 形態(tài)學(xué)觀察

取指數(shù)生長期的Caco-2細(xì)胞，按“2.2.1”項下方法消化分散制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度，以5×104個/孔接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后更換新培養(yǎng)基，每孔加入200 ?L不同濃度的芹菜素溶液（芹菜素終濃度為0.5、5、15、25、50、100、200、400 ?g/mL），DMSO體積分?jǐn)?shù)<0.5%，每個濃度設(shè)置6個復(fù)孔，對照組加入新鮮10%DMEM高糖培養(yǎng)液代替芹菜素溶液，培養(yǎng)48 h后置于顯微鏡觀察對照組和實驗組的細(xì)胞大小、形態(tài)、生長密度、樹突形態(tài)及融合狀態(tài)等。結(jié)果對照組細(xì)胞生長良好，形態(tài)正常。加入不同濃度芹菜素溶液后，細(xì)胞數(shù)量和形態(tài)均出現(xiàn)了不同程度的變化：濃度<25 ?g/mL時，細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量均無明顯變化；濃度為50 ?g/mL時，細(xì)胞數(shù)目顯著減少，形態(tài)有較明顯變化；濃度為100 ?g/mL時，出現(xiàn)細(xì)胞分布稀疏，樹突明顯減少；濃度為400 ?g/mL時，細(xì)胞樹突減少或消失，不能相互融合形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。細(xì)胞形態(tài)見圖2。鑒于芹菜素質(zhì)量濃度對細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量存在影響，攝取試驗應(yīng)設(shè)定濃度在100 ?g/mL以下。

2.2.3 芹菜素對Caco-2細(xì)胞增殖率的影響

采用MTT法檢測細(xì)胞活性。細(xì)胞懸浮液處理同“2.2.2”項下操作，培養(yǎng)基作調(diào)零孔為空白組，不含藥物孔為陰性對照組，待測物為實驗組，均于孵育24、48、72、96 h每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 ?L，培養(yǎng)箱中孵育4 h，棄去培養(yǎng)液和MTT，向各孔中加入150 ?L DMSO，溶解殘留的MTT甲臜結(jié)晶，震蕩混勻后用酶標(biāo)儀在570 nm波長處測定各孔的吸光度（OD值），計算細(xì)胞增殖率，確定待測物對Caco-2細(xì)胞的安全濃度范圍。細(xì)胞增殖率（%）=（實驗孔OD值-空白孔OD值）÷（對照孔OD值-空白孔OD值）×100%[4]。不同濃度芹菜素對Caco-2細(xì)胞增殖率的影響見表1。可見，芹菜素濃度<200 ?g/mL，細(xì)胞增殖率均大于85%，因此，后續(xù)考察芹菜素濃度對攝取的影響設(shè)定濃度應(yīng)小于200 ?g/mL。

2.3 芹菜素在Caco-2細(xì)胞的攝取

2.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將Caco-2細(xì)胞按“2.2.1”項下方法培養(yǎng)后，用10%完全培養(yǎng)液混懸，調(diào)整細(xì)胞密度至6×104個/mL，接種于12孔板內(nèi)，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d，測定細(xì)胞跨膜電阻>300 Ω·cm2，可用于藥物攝取實驗[5]。endprint

2.3.2 樣品處理

將細(xì)胞培養(yǎng)板從培養(yǎng)箱內(nèi)取出，吸棄含藥培養(yǎng)液，用4 ℃ HBSS快速清洗3遍，加入胰蛋白酶消化后以完全培養(yǎng)基終止消化，收集細(xì)胞懸液，1000 r/min離心5 min，棄去上清液，加入4 ℃ HBSS 500 ?L重懸細(xì)胞，1000 r/min離心5 min，棄去上清液，加入500 ?L RIPA細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，吹打混勻，超聲處理（250 W，25 kHz）25次，20 s/次（冰上操作），12000 r/min離心5 min，所得上清液一部分以BCA法測定蛋白定量，另一部分加入3倍甲醇，渦旋1 min，12 000 r/min離心10 min，氮?dú)獯蹈?，?0 ?L甲醇復(fù)溶，渦旋1 min，12 000 r/min離心10 min，取上清液20 ?L，采用HPLC測定芹菜素含量，記錄峰面積。芹菜素的細(xì)胞內(nèi)攝取量以?g（藥物）/mg（蛋白）表示[6]。

2.3.3 影響因素考察

細(xì)胞培養(yǎng)14 d，吸去培養(yǎng)液，用HBSS清洗3次，每孔加入含藥的HBSS溶液1 mL，分別考察培養(yǎng)時間、濃度、溫度、pH值及P-糖蛋白（P-gp）抑制劑維拉帕米和環(huán)孢素A對芹菜素攝取的影響。

2.3.3.1 時間對Caco-2細(xì)胞攝取的影響

取20 ?g/mL芹菜素的HBSS供試液與Caco-2細(xì)胞在37 ℃培養(yǎng)箱中分別孵育0、10、30、60、90、120、180、210、270 min，計算攝取量，結(jié)果見圖3?？梢?，芹菜素在Caco-2細(xì)胞中的攝取量在0～180 min范圍內(nèi)隨著培養(yǎng)時間的增加而增加，其后攝取量下降。因此，后續(xù)實驗確定攝取時間為180 min。

2.3.3.2 濃度對Caco-2細(xì)胞攝取的影響

取不同濃度芹菜素的HBSS供試液與Caco-2細(xì)胞在37 ℃培養(yǎng)箱中孵育180 min，考察不同給藥濃度（2、3、6、12.5、25、50、100、150、200 ?g/mL）對Caco-2細(xì)胞攝取芹菜素的影響，結(jié)果見圖4。可見，藥物濃度在2.00～100.00 ?g/mL范圍，細(xì)胞攝取速率與藥物濃度具有一定的線性關(guān)系，符合一級動力學(xué)過程，可視為被動擴(kuò)散，確定細(xì)胞攝取濃度在100 ?g/mL以內(nèi)。

2.3.3.3 溫度對Caco-2細(xì)胞攝取的影響

取25 ?g/mL芹菜素的HBSS供試液與Caco-2細(xì)胞分別在4、25、37 ℃條件下中孵育180 min，考察不同溫度對Caco-2細(xì)胞攝取芹菜素的影響，結(jié)果見圖5?？梢?，在設(shè)定的考察溫度范圍內(nèi)，芹菜素的細(xì)胞攝取量與溫度近似呈線性增加。

2.3.3.4 pH值對Caco-2細(xì)胞攝取的影響

取25 ?g/mL芹菜素的HBSS供試液與Caco-2細(xì)胞分別置于37 ℃，pH 5.00、6.00、7.40、8.00條件下孵育180 min，考察不同pH值對細(xì)胞攝取的影響，結(jié)果見圖6。可見，在pH 5.00～7.40范圍內(nèi)，細(xì)胞攝取量持續(xù)增加，之后下降，在設(shè)定范圍內(nèi)以pH 7.4時藥物攝取量最大，后續(xù)實驗pH值設(shè)為7.4。

2.3.3.5 P-糖蛋白抑制劑對Caco-2細(xì)胞攝取的影響

取25 ?g/mL芹菜素的HBSS供試液，分別加入P-gp抑制劑維拉帕米和環(huán)孢素A，在pH 7.40、37 ℃環(huán)境中孵育180 min，考察P-gp抑制劑對Caco-2細(xì)胞攝取芹菜素的影響，結(jié)果見表2?？梢?，加入P-gp抑制劑維拉帕米和環(huán)孢素A后，Caco-2細(xì)胞對芹菜素攝取量降低（P<0.05）。

3 討論

新疆維藥材芹菜根是傘形科植物旱芹Apium graveolens L.的干燥根，收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·維吾爾藥分冊》[7]和《維吾爾藥材標(biāo)準(zhǔn)》[8]，具有明確的護(hù)肝、降壓及調(diào)脂作用[9-12]。芹菜素是芹菜根的主要藥效成分[13]，其體內(nèi)吸收特性研究可為其劑型設(shè)計提供藥動學(xué)依據(jù)。

Caco-2細(xì)胞來源于人的結(jié)腸癌細(xì)胞，具有小腸微絨毛結(jié)構(gòu)，可以表達(dá)多種藥物載體和酶，被廣泛用于藥物吸收機(jī)制的研究。本試驗采用Caco-2細(xì)胞模型研究芹菜素的攝取特性，以MTT法考察芹菜素對Caco-2細(xì)胞的毒性，表明芹菜素濃度對細(xì)胞形態(tài)、數(shù)量及增殖率存在影響，細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察表明攝取實驗設(shè)定濃度應(yīng)小于100 ?g/mL，增殖率測定結(jié)果表明攝取實驗設(shè)定濃度應(yīng)小于200 ?g/mL，可能由于芹菜素是難溶性藥物，漂洗不到位，死亡細(xì)胞釋放殘留的酶可能還原了MTT而造成實驗的誤差，而且細(xì)胞形態(tài)觀察是主觀判斷實驗結(jié)果，也會存在一定的誤差。因此，低濃度芹菜素對Caco-2細(xì)胞無毒性。

芹菜素的攝取量受時間、濃度、pH值、溫度的影響，并呈一定的劑量依賴性。在0～180 min其攝取量隨時間的增加而增加，180 min后呈下降趨勢；在2.00～100 ?g/mL范圍內(nèi)，其攝取量隨著給藥濃度的增大而增加，并呈一級動力學(xué)過程特征，超過100 ?g/mL則下降；當(dāng)pH<7.4時，其攝取量隨著pH值升高而增加，pH>7.4時攝取量下降，表明中性條件下攝取較好，酸性條件下不利于其攝取，芹菜素在小腸中的吸收可能較胃中好；在設(shè)定的考察溫度范圍內(nèi)，其攝取量隨著溫度的上升而增加，37 ℃條件下更有利于Caco-2細(xì)胞攝取芹菜素。

P-gp是Caco-2細(xì)胞中的主要外排蛋白之一，P-gp抑制劑可抑制其外排作用，增加底物濃度。本實驗以典型的P-gp抑制劑維拉帕米和環(huán)孢素A考察P-gp對芹菜素攝取的影響。當(dāng)加入維拉帕米和環(huán)孢素A后，芹菜素的細(xì)胞攝取量降低（P<0.05），表明P-gp未參與其吸收過程，即芹菜素不是P-gp的底物，其攝取量降低的機(jī)制需進(jìn)一步探討。

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