過量表達黃烷酮3-羥化酶基因(AaF3H)提高青蒿中青蒿素的含量

張婷婷, 馬嘉偉, 王路堯, 唐克軒, 李 杉, 趙靜雅*

1.上海交通大學農(nóng)業(yè)與生物學院, 交大-復旦-諾丁漢植物生物技術研發(fā)中心, 上海 200240; 2.華南理工大學生物科學與工程學院, 廣州 510006

青蒿素是從青蒿(ArtemisiaannuaL.)中分離到的一種含過氧基團的倍半萜內(nèi)酯化合物[1]，在治療瘧疾時，它不僅療效好，而且毒性低，因此聯(lián)合國衛(wèi)生組織提出，將以青蒿素為基礎的聯(lián)合療法(artemisinin combination therapies，ACTs)作為醫(yī)治由瘧原蟲叮咬引起的瘧疾的最佳方法[2]。研究發(fā)現(xiàn)青蒿素只在青蒿分泌型腺毛中合成，而分泌型腺毛多數(shù)存在于青蒿的葉、花蕾中[3]。目前，青蒿素主要來源于植物提取，但是其含量僅為植物青蒿葉片干重的0.1%～1.00%[4,5]，導致青蒿素的價格昂貴，無法滿足市場需求。青蒿素的生物合成途徑現(xiàn)已基本闡明，利用過量表達青蒿素合成途徑關鍵酶基因的方法提升青蒿素的含量，以及利用轉錄因子調(diào)控青蒿素的合成已成為近幾年的研究熱點。

在高等植物中，黃酮類物質(zhì)作為最為重要的次生代謝產(chǎn)物，廣泛地參與到植物的生長發(fā)育、呼吸作用以及光合作用等過程中[6,7]。在苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase，PAL)和肉桂酸4-羥化酶(cinnamate 4-hydroxylase，C4H)等酶的作用下將苯丙氨酸(phenylalanine,Phe)轉化為香豆酰輔酶A(coumaroyl-CoA)。緊接著在查耳酮合成酶(chalcone synthase，CHS)和查耳酮異構酶(chalcone isomerase，CHI) 等一系列酶的作用下生成二氫黃酮醇類化合物如二氫山柰素，而二氫山柰素則是合成黃烷酮和花色素過程中必不可少的(圖1)[8,9]。AaPAL1是黃酮類化合物合成的關鍵酶基因，將其在青蒿中過量表達，得到的轉基因青蒿中青蒿素的含量顯著提升[10]。這說明，在青蒿中過量表達黃酮類化合物合成途徑中的關鍵酶基因可以顯著提高青蒿素的含量。黃烷酮3-羥化酶(F3H)，位于整個黃酮類化合物代謝途徑的核心位置，控制合成途徑的代謝方向(圖1)。它催化柚皮素生成二氫山柰酚(dihydro-kaempfero，DHK)，DHK作為重要中間產(chǎn)物，進一步合成花色素和異黃酮等次生代謝產(chǎn)物[11～13]。目前，青蒿中的AaF3H基因全長已被克隆[14]，但是該基因?qū)τ谇噍锼氐挠绊懭匀晃粗?/p>

圖1 類黃酮生物合成途徑Fig.1 Flavonoid biosynthetic pathway.注：DFR:二氫黃酮醇-4-還原酶；ANS：花青素合成酶；FLS：黃酮醇合成酶。

本研究從青蒿中克隆了AaF3H，全長為1 095 bp，編碼364個氨基酸。并進一步構建了AaF3H的過表達載體并穩(wěn)定轉化青蒿，通過HPLC測定野生型和轉基因青蒿中的青蒿素含量，以期證明在青蒿中過量表達AaF3H可以顯著地提高青蒿素的含量。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗材料 本實驗所用的青蒿種子儲存于交大-復旦-諾丁漢植物生物技術研發(fā)中心。青蒿的生長條件為：16 h光照、8 h黑暗，于25℃～27℃人工氣候室培養(yǎng)，適時澆灌，用于DNA和RNA提取。

1.1.2實驗試劑 KOD-plus酶(日本東洋紡績株式會社)、pJET1.2載體(美國Thermo 公司)、Taq酶(PremixTaq?Version 2.0，日本TaKaRa公司)、植物總RNA提取試劑盒(RNAprep pure Plant Kit，天根生化科技(北京)有限公司)、反轉錄試劑盒(PrimeScriptTMRT reagent kit，日本TaKaRa公司)、SYBR Ex Script RT-PCR kit定量試劑盒、Southern Blot試劑盒(美國GE 醫(yī)療集團)。

1.1.3實驗儀器 NanoDropTM2000、Peltier Thermal Cycler PTC200定量PCR儀器(美國Bio-Rad公司)。

1.2 AaF3H的載體構建

根據(jù)AaF3H的全長序列，使用Primer 5.0設計一對引物(AaF3H-F、AaF3H-R，序列見表1)，以青蒿cDNA為模板進行PCR，反應體系為：cDNA 2 μL，AaF3H-F 1 μL，AaF3H-R 1 μL，Mg2+2 μL，dNTP mix 5 μL，10×KOD-Plus buffer 5 μL，KOD-Plus 1 μL，補充ddH2O至50 μL。PCR反應程序(使用KOD-Plus酶)為：94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，68℃ 1 min，共35個循環(huán)；68℃ 10 min。將最終產(chǎn)物連接到pJET1.2載體中并測序。再以測序正確的pJET-AaF3H質(zhì)粒為模板，設計第二對引物(AaF3H-PHB-F、AaF3H-PHB-R，序列見表1)進行PCR擴增，在引物的上游添加酶切位點BamHⅠ，在引物的下游添加酶切位點XbaⅠ，反應體系(將引物更換為AaF3H-PHB-F、AaF3H-PHB-R)和程序與擴增AaF3H相同(使用KOD-Plus酶)。使用BamHⅠ和XbaⅠ雙酶切最終產(chǎn)物以及帶有黃色熒光蛋白(yellow fluorescent protein，YFP)的空表達載體pHB-YFP，回收后，使用T4 DNA連接酶連接并且轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞，獲得重組質(zhì)粒pHB-AaF3H-YFP，并轉化農(nóng)桿菌EHA105。

1.3 青蒿的轉化

先用75%的乙醇浸泡青蒿種子1 min，然后在10%的次氯酸鈉中浸泡10 min，不斷晃動直至種子充分接觸液體，再用無菌水反復沖洗數(shù)次。將處理過的種子平鋪于不帶抗性的MS固體培養(yǎng)基[15]上，放置于人工氣候室培養(yǎng)，待幼苗長到4～5 cm后，剪下無菌苗葉片在25℃下與帶有AaF3H基因的農(nóng)桿菌EHA105共培養(yǎng)2 d[16]。然后，將處理后得到的青蒿外植體置于發(fā)芽篩選培養(yǎng)基上，并在25℃、16 h光照/8 h黑暗的條件下培養(yǎng)2周，經(jīng)過2～3次繼代后，便可獲得帶潮霉素抗性的叢生芽。挑選長勢較好、帶潮霉素抗性的叢生芽剪下，轉入生根培養(yǎng)基，待其生根便可獲得具有潮霉素抗性的再生青蒿植株，上述培養(yǎng)基參考Zhang等[17]的配方。根部形成后(約12～15 d)，將生根植株轉移到生長室內(nèi)的土壤盆中，適時澆水。經(jīng)過2～3個月的生長，將它們移植到溫室進一步培育。

1.4 陽性轉基因青蒿驗證

用CTAB法[18]提取轉基因青蒿葉片的DNA，根據(jù)AaF3H的編碼區(qū)序列及載體上的YFP序列分別在AaF3H編碼區(qū)和YFP區(qū)域設計上下游引物(AaF3H-F和pHB-YFP-R，序列見表1)。使用Taq酶進行PCR擴增。反應體系為：2×PremixTaq10 μL，AaF3H-F 1 μL，pHB-YFP-R 1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 7 μL。PCR反應程序為：94℃ 10 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，共35個循環(huán)； 72℃ 10 min。隨后，進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 實時熒光定量PCR

選取生長5個月左右的野生型青蒿植株，分別提取根、莖、幼葉、老葉、幼芽、花蕾和花的RNA，反轉錄為cDNA。其中，幼葉是第1～2片葉 (從頂端分生組織開始計數(shù))，老葉是第10～16片葉。根據(jù)植物總RNA提取試劑盒的操作步驟提取總RNA。分別使用1%的瓊脂糖凝膠電泳和NanoDropTM2000檢測所提RNA的完整性、純度和濃度。根據(jù)反轉錄試劑盒的操作說明將提取的RNA反轉錄成cDNA。將cDNA用無菌水稀釋50倍后作模板，在冰上配制實時定量PCR反應體系(體系由試劑盒提供)。使用Primer 5.0設計引物(Aa-Actin-F、Aa-Actin-R、AaF3H-Rt-F、AaF3H-Rt-R，序列見表1)，根據(jù)Zhang等[17]的方法，進行實時熒光定量PCR分析，使用肌動蛋白AaActin作為參照基因。

實時熒光定量PCR程序如下： 95℃ 10 min；95℃ 20 s，55℃ 20 s，72℃ 20 s，共40個循環(huán)； 72℃ 10 min。反應結束即可獲得相應的擴增曲線和溶解曲線，以此為依據(jù)繪制標準曲線。本研究采用Ct比較法，并運用2-ΔΔCt法處理數(shù)據(jù)[19]，實驗重復3次。

提取生長20周左右的野生型和轉基因青蒿的第1片葉(從頂端分生組織計數(shù))的RNA，并將RNA反轉錄合成cDNA。使用Primer 5.0設計引物(Aa-Actin-F、Aa-Actin-R、AaF3H-Rt-F、AaF3H-Rt-R、AaADS-F、AaADS-R、AaCYP71AV1-F、AaCYP71AV1-R、AaDBR2-F、AaDBR2-R，序列見表1)進行實時熒光定量PCR分析，實驗重復3次，方法同上。

1.6 Southern Blot分析

使用CTAB法大量提取野生型青蒿葉片的DNA以驗證AaF3H在青蒿基因組中的拷貝數(shù)。將DNA(60 μg/樣品)在37℃下分別用EcoRⅠ、BamHⅠ和KpnⅠ酶切過夜，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，然后將產(chǎn)物轉移到尼龍膜上。設計一對引物(AaF3H-Southern-F1、AaF3H-Southern-R1，序列見表1)進行PCR擴增，反應體系為：cDNA 2 μL，AaF3H-Southern-F1 1 μL，AaF3H-Southern-R1 1 μL，Mg2+2 μL，dNTP mix 5 μL，10×KOD-Plus buffer 5 μL，KOD-Plus 1 μL，補充ddH2O至50 μL。PCR反應(使用KOD-Plus酶)程序為：94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，68℃ 1 min，共35個循環(huán)；68℃ 10 min。將其產(chǎn)物標記為雜交探針，并按照試劑盒說明書進行后續(xù)操作。

表1 實驗所用引物序列Table 1 Primers used in the experiment.

注：下劃線表示BamHⅠ和XbaⅠ的酶切位點。

為了分析轉基因植物，用CTAB法大量提取新鮮野生型和轉基因青蒿葉片的DNA，設計一對引物(AaF3H-Southern-F2、AaF3H-Southern-R2，序列見表1)進行PCR擴增，PCR反應體系(將引物更換為AaF3H-Southern-F2、AaF3H-Southern-R2)和程序與驗證拷貝數(shù)的PCR相同。將DNA(60 μg/樣品)用EcoRⅠ在37℃下酶切過夜后，按照試劑盒說明書進行后續(xù)操作。

1.7 HPLC測定青蒿素含量

使用在溫室培育20周的植物，選取適量的組合式葉子樣品(從頂端分生組織計數(shù)，1個分支上的幼葉、老葉平均分布)在45℃烘箱烘48 h，磨成粉末后通過HPLC測定青蒿素。具體操作如下：準確稱取0.1 g 青蒿干葉粉末，置于2 mL的離心管中，加入1 mL甲醇，將溶液輕輕混合并用超聲波處理器處理，處理條件為：55 Hz 30 min，12 000 r/min離心10 min，取上清液于新離心管中，再在沉淀中加入1 mL甲醇，重復上述步驟。通過0.22 μm濾膜過濾溶液后，將200 μL樣品導入HPLC，HPLC儀器的使用條件參照Zhang等[20]的方法，樣品重復3次。青蒿素出峰時間為4.5 min左右，進樣體積為20 μL，結果使用Empower(Waters’ chromatography data software)軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 AaF3H的克隆

使用Primer 5.0設計基因特異引物，從青蒿cDNA中擴增出AaF3H基因片段，全長為1 095 bp，編碼364個氨基酸。經(jīng)Southern Blot分析，結果表明AaF3H在青蒿基因組中只有1個拷貝(圖2)。

使用Vector NTI?Advance 11.5進行AaF3H與其他植物物種F3H的氨基酸序列的比對，結果表明，AaF3H和多個其他物種F3H的氨基酸序列的相似性超過50%。相似度分別為銀杏(Ginkgobiloba，AAU93347.1)60.5%，擬南芥(Arabidopsisthaliana，AEE78766.1)75.6%，番茄(Solanumlycopersicum，AEK99074.1)74.2%，棉花(Gossypiumhirsutum，ABM64799.1)74.9%，葡萄(Vitisvinifera，CAA53579.1)73.5%，蘋果(Malusdomestica，BAB92997.1)73.9%，西洋梨(Pyruscommunis，AGL81347.1)73.9%。其中，青蒿AaF3H與擬南芥F3H相似度最高。

利用Mega 5軟件，將青蒿AaF3H與其他物種F3H進行進化樹分析。如圖3所示，青蒿AaF3H在系統(tǒng)進化中與擬南芥AtF3H的親緣關系比較近，處于相同的進化分支。在擬南芥中，AtF3H可以影響花青素、黃酮醇等次生代謝產(chǎn)物的合成[21]。

圖2 青蒿AaF3H Southern blot分析Fig.2 Southern blot analysis of AaF3H in A. annua.注：M:DNA marker; 1,2,3分別代表野生型青蒿葉片DNA經(jīng)EcoRⅠ、BamHⅠ和KpnⅠ酶切過夜的產(chǎn)物。

圖3 AaF3H與其他物種F3Hs氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹分析Fig.3 Phylogenetic tree of the amino acid sequences of AaF3H and other F3Hs.注：CsF3H：茶樹(AAT68774.1)；GmF3H：大豆(ACA81459.1)；GhF3H：棉花(ABM64799.1)；VvF3H：葡萄(CAA53579.1)：SlF3H：番茄(AEK99074.1)；CaF3H：喜樹(ARO92271.1)；擬南芥：AtF3H(AEE78766.1)；PhF3H：矮牽牛(SCV44659.1)；AaF3H：青蒿；ZmF3H：玉米(NP_001130275.1)；MdF3H：蘋果(BAB92997.1)；PcF3H：西洋梨(AGL81347.1)；MsF3H：綠絨蒿(AGT50302.1)；HvF3H：大麥(ACH42080.1)。

2.2 AaF3H在青蒿不同組織中的表達分析

按1.5中的實驗方法，選擇培養(yǎng)合適的青蒿植株，取根、莖、幼葉、老葉、花和花蕾組織，提取獲得各組織的總RNA并反轉錄為cDNA。使用實時熒光定量PCR分析AaF3H基因在根、莖、幼葉、老葉、花蕾和花中的相對表達量。采用2-ΔΔCt法處理數(shù)據(jù)，結果表明AaF3H在青蒿所有的組織中都有表達，且在青蒿花中的表達量最高，其次是花蕾、老葉和幼葉，而在根中表達量最低(圖4)。

圖4 AaF3H在青蒿不同組織中的表達模式Fig.4 The expression pattern of AaF3H in different organizations of A. annua.

2.3 過量表達AaF3H的轉基因青蒿的鑒定

用帶有AaF3H基因的農(nóng)桿菌EHA105侵染青蒿的葉片，然后通過潮霉素篩選獲得再生植株。 在2～3個月的生長后，取轉基因青蒿葉片，提取DNA，通過PCR檢測轉基因植物，共獲得39個獨立的轉基因株系(圖5)。

2.4 轉基因青蒿中AaF3H的表達檢測

為了驗證過量表達AaF3H的轉基因青蒿中AaF3H轉錄水平的表達量，用野生型和轉基因青蒿葉片的總RNA進行實時熒光定量PCR分析。結果表明，與野生型相比，AaF3H基因在轉基因植株中的表達量增加了6.23～11.9倍，從中選擇4株表達量較高的轉基因青蒿(pHB-AaF3H-5、pHB-AaF3H-13、pHB-AaF3H-24、pHB-AaF3H-33)用于后續(xù)分析(圖6A)。用CTAB法提取野生型植株和4個轉基因青蒿植株的DNA進行Southern Blot分析。結果表明，AaF3H表達質(zhì)粒已經(jīng)整合到4個轉基因植株的基因組中(圖6B)。

圖5 pHB-AaF3H轉基因青蒿的PCR鑒定結果Fig.5 PCR detection results of pHB-AaF3H transgenic A. annua plants.注：M：Marker; +：陽性對照(質(zhì)粒); -：陰性對照(野生型)，1～39：轉基因青蒿。

圖6 青蒿植株中AaF3H的實時熒光定量PCR結果(A)和Southern blot分析(B)Fig.6 Real-time fluorescent quantitative PCR results of AaF3H (A) and Southern Blot analysis (B) of transgenic A. annua plants.注：M: Marker; CK:野生型植株； 5,13,24,33：分別表示轉基因青蒿株系5，13，24，33。*表示與野生型相比差異顯著(P<0.05)。

2.5 過量表達AaF3H對關鍵酶基因表達的影響

在青蒿素合成途徑中，異戊烯焦磷酸(isopentenyl pyrophosphate，IPP)和二甲基丙烯基焦磷酸(dimethylallyl pyrophosphate，DMAPP)分別由胞質(zhì)中的甲瓦龍酸(mevalonicacid，MVA)途徑和質(zhì)體中的非甲羥戊酸(2-C-甲基-D-赤蘚醇-4-磷酸，2-C-methyl-D-eythritol-4-phosphate，MEP)途徑生成，是青蒿素合成的重要中間產(chǎn)物，它們進一步合成法尼基焦磷酸(farnesyl pyrophosphate，F(xiàn)PP)。FPP經(jīng)過紫穗槐-4,11-二烯合成酶(ADS)、紫穗槐-4,11-二烯氧化酶(CYP71AV1)、乙醛脫氫酶(aldehyde dehydrogenase，ALDH1)、青蒿醛Δ11(13)雙鍵還原酶(DBR2)的催化而轉化成青蒿酸和二氫青蒿酸，最后生成青蒿素B和青蒿素。其中，AaADS、CYP71AV1、AaDBR2存在于青蒿素特有的生物合成途徑中，其表達量與青蒿素含量緊密相關[22]。

為了研究AaF3H過量表達是否影響了青蒿素的生物合成，采用實時熒光定量PCR方法檢測轉基因青蒿中青蒿素生物合成關鍵酶基因的表達。從圖7中可以看出，轉基因植株中AaADS、AaCYP71AV1、AaDBR2的相對表達水平最高分別為野生型的2.34倍、2.7倍、2.01倍。結果表明，過量表達AaF3H提高了青蒿素合成途徑中關鍵酶基因的表達。

2.6 過量表達AaF3H對青蒿素含量的影響

為了進一步驗證過量表達AaF3H對青蒿素的影響，選取在溫室培育20周左右的野生型和轉基因青蒿的葉片進行青蒿素含量的測定。HPLC分析結果顯示，轉基因青蒿植株中青蒿素的含量與野生型相比有顯著提高。其中，轉基因青蒿植株中青蒿素含量最高的是野生型的1.95倍(圖8)。這表明，在青蒿中過量表達AaF3H基因可以顯著提高植株中的青蒿素含量。

圖7 轉基因青蒿植株中關鍵酶基因的實時熒光定量PCR結果Fig.7 Real-time fluorescent quantitative PCR results of key enzymes genes in transgentic A. annua plants.注：A：AaADS在轉基因青蒿株系中的表達譜；B：AaCYP71AV1在轉基因青蒿株系中的表達譜；C：AaDBR2在轉基因青蒿株系中的表達譜。CK為野生型植株。*表示實驗組數(shù)據(jù)與CK相比差異顯著(P<0.05)。

圖8 轉基因植株中青蒿素的含量Fig.8 The artemisinin content in regenerated A. annua plants.注：CK為野生型植物(非轉基因植物),其他為轉基因植株。*和**表示實驗組數(shù)據(jù)與CK相比差異達到顯著(P<0.05)和極顯著水平(P<0.01)。

3 討論

青蒿素藥用價值高，但青蒿作為青蒿素的主要來源，因其青蒿素含量低導致青蒿素價格昂貴，而無法滿足市場需求。近年來，對于青蒿素合成的研究正逐步深入，利用轉基因技術來提高青蒿中青蒿素的含量已經(jīng)成為研究熱點。

研究表明，一些萜類化合物、苯丙烷和黃酮類化合物等次生代謝產(chǎn)物儲存在植物的腺毛中，保護植物免受昆蟲捕食和其他生物脅迫[23,24]。類黃酮生物合成途徑已基本被揭示，在各種植物中，已經(jīng)克隆了類黃酮生物合成的相關基因，如肉桂酸羥化酶基因(C4H)、黃烷酮3-羥化酶基因(F3H)、查耳酮異構酶基因(CHI)、苯丙氨酸氨裂解酶基因(PAL)和查耳酮合成酶基因(CHS)等。但只有少數(shù)基因在植物體內(nèi)的催化活性被鑒定并驗證[11]。研究表明，在番茄中，CHI可以影響萜類和黃酮類化合物在番茄葉片中的積累[13]。在青蒿中，抑制AaC4H的表達，轉基因青蒿中反式肉桂酸(trans-cinnamic acid，t-Ca)和水楊酸(salicylic acid，SA)含量升高，從而促進青蒿素的合成[25]。Xiong等[14]克隆了青蒿苯丙烷途徑中的1個關鍵酶基因AaF3H，該基因在花青素含量高的青蒿植株中比在花青素含量低的植株中表達量高。

本研究克隆的AaF3H，經(jīng)Southern Blot分析顯示，其在青蒿基因組中是單拷貝基因。通過構建AaF3H的過表達載體并穩(wěn)定轉化青蒿，獲得轉基因青蒿植株。實時熒光定量PCR的結果顯示，在轉基因青蒿中，AaF3H的表達量相比野生型顯著提高，同時，青蒿素合成途徑中的關鍵酶基因AaADS、AaCYP71AV1、AaDBR2的表達量在轉基因青蒿中都有所提高。轉基因青蒿植物中青蒿素含量最高的是野生型青蒿中青蒿素含量的1.95倍。從而，可以推測AaF3H在青蒿素的合成中有重要作用，盡管具體的調(diào)控機制仍然未知，但是本研究結果對于降低青蒿素生產(chǎn)的成本有重大的實踐意義。此外，本研究也為探究苯丙烷途徑與青蒿素合成途徑之間的關系提供了分子基礎。

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