黃淮區(qū)粳稻抗稻瘟病基因Pi-ta、Pi-b、Pi54、Pikm的分子檢測(cè)

陳 峰, 徐建第, 姜明松, 梁水美, 張全芳, 王文良, 李廣賢, 楊連群,, 朱文銀*, 周學(xué)標(biāo)*

1.山東省水稻研究所, 濟(jì)南 250100； 2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心, 濟(jì)南 250100； 3.山東省種子管理總站, 濟(jì)南 250100

稻瘟病亦稱稻熱病，是由子囊菌(Magnoporthegrisea(Hebert)Barr)引起的世界性病害[1]。利用抗稻瘟病基因培育抗稻瘟病品種是防治稻瘟病最為經(jīng)濟(jì)高效的方法。發(fā)掘利用抗稻瘟病基因，利用分子輔助選擇培育抗稻瘟病的水稻品種，是防治稻瘟病的基本策略之一[2]。利用抗稻瘟病基因位點(diǎn)的功能分子標(biāo)記鑒定選育品種的稻瘟病抗性基因的分布對(duì)利用分子標(biāo)記輔助選擇培育抗稻瘟病水稻品種具有重要意義。

20世紀(jì)60年代中期，日本率先開展了水稻品種抗稻瘟病基因分析的研究工作，鑒定了最初的8個(gè)抗性位點(diǎn)上的14個(gè)基因，并建立了一套抗稻瘟病基因分析的鑒別體系[3]。隨后，國際水稻研究所和中國等產(chǎn)稻國也逐漸開展了水稻稻瘟病抗性遺傳的系統(tǒng)性研究。截至2015年3月，已至少報(bào)道了69個(gè)抗稻瘟病位點(diǎn),共84個(gè)主效基因[4]。這些基因成簇地分布于除第3染色體外的所有染色體上(2個(gè)隱性，其他顯性)。其中Pb1、Pi-a、Pi-b、Pi-ta、Piz-t、Pi1、Pi2、Pi9、Pi21等24個(gè)基因已被成功克隆[4]，為抗稻瘟病分子標(biāo)記輔助育種奠定了基礎(chǔ)。Pi-ta基因位于水稻第12染色體靠近著絲點(diǎn)附近的區(qū)域，定位于BAC克隆BAC142E8上。Pi-ta基因包含2個(gè)外顯子和1個(gè)1 463bp 的內(nèi)含子，編碼1個(gè)長度為928個(gè)氨基酸的細(xì)胞質(zhì)膜受體蛋白。該蛋白含NBS結(jié)構(gòu)域和富亮氨酸結(jié)構(gòu)域(LRD)，Pi-ta位點(diǎn)上的抗感兩基因的編碼產(chǎn)物僅有1個(gè)氨基酸的差異，即第918位氨基酸由抗病產(chǎn)物的丙氨酸變異為感病產(chǎn)物的絲氨酸，其抗病機(jī)制是Pi-ta基因的編碼產(chǎn)物能與稻瘟病菌的無毒基因AVR-Pita表達(dá)產(chǎn)物相互作用引發(fā)抗病反應(yīng)[5]。Pi-ta在粳稻中表現(xiàn)出持久穩(wěn)定的稻瘟病抗性，被廣泛用于稻瘟病抗性育種[6]。Pi-b來源于水稻品種BL1，位于水稻第2染色體長臂近末端，與RFLP標(biāo)記RZ123、C379、C2782B 等連鎖。Pi-b基因?qū)儆凇癗BS-LRR”類抗病基因，Pi-b編碼1個(gè)由1 251個(gè)氨基酸組成的蛋白產(chǎn)物，該產(chǎn)物包含1個(gè)核苷酸結(jié)合位點(diǎn)(nucleotide binding site, NBS)和17個(gè)富亮氨酸重復(fù)序列(leucine-rich repeats, LRRs)，其中，氨基端的NBS 區(qū)存在激酶1a、2a和3a 結(jié)構(gòu)域單位，LRRs 中部有8個(gè)成簇的半胱氨酸殘基[7]。利用抗稻瘟病基因Pi-b自身序列及其等位的感病基因序列建立的分子標(biāo)記，可有效地用于分子標(biāo)記輔助選擇[8]。

Pi54(最初命名為Pi-kh)定位于水稻第11染色體上，是Pi-k基因座上的一個(gè)重要基因，對(duì)稻瘟病菌具有廣譜抗性[9]。Sharma等[10]克隆了Pi54基因，在抗病品種Tetep中，Pi54 僅包含1個(gè)外顯子，編碼1個(gè)由330氨基酸組成的NBS-LRR類抗病蛋白。Pikm是稻瘟病抗性位點(diǎn)Pik上的一個(gè)主效抗病等位基因。Pikm定位于水稻第11 染色體長臂近末端區(qū)域，并被精細(xì)定位在BAC克隆OSJNBa0036K13的84 kb區(qū)間內(nèi)[11]。Pikm是由兩個(gè)緊密連鎖的具有獨(dú)立功能NBS-LRR類基因(Pikm1-TS和Pikm2-TS)組成，Pikm1-TS和Pikm2-TS的編碼產(chǎn)物均是NBS-LRR 類抗病蛋白，長度分別為1 143個(gè)氨基酸和1 021個(gè)氨基酸[12]。張羽等[13]利用Pikm的分子標(biāo)記對(duì)陜西省部分水稻材料進(jìn)行了檢測(cè)，明確了Pikm抗性基因在陜西水稻育種中的利用情況，并對(duì)抗性基因型類別與抗性關(guān)系進(jìn)行了初步探討。范方軍等[14]對(duì)2012年江蘇省遲熟中粳稻預(yù)試64份品系進(jìn)行了基因檢測(cè)，解析了稻瘟病抗病基因Pi-b、Pi-ta、Pikm和Pi54在江蘇省粳稻稻瘟病抗性育種中的作用。

稻瘟病是山東稻區(qū)的主要病害，但稻瘟病抗性基因在山東水稻品種的分布及利用研究較少[15,16]。本研究利用稻瘟病抗病基因Pi-ta、Pi-b、Pi54和Pikm的基因功能標(biāo)記，對(duì)2016年山東省區(qū)試品系及連云港聯(lián)合體區(qū)試材料進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)合稻瘟病抗性接種鑒定，對(duì)抗病基因與品種的稻瘟病抗性的關(guān)系進(jìn)行了初步分析，以期為山東及黃淮區(qū)抗稻瘟病育種研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試品種48份，包括2016年山東省水稻區(qū)試品種32份，其中中晚熟組區(qū)試品種21份，編號(hào)W1601～W1611、W1622～W1631；機(jī)插秧組區(qū)試品種11份，編號(hào)J1601～J1611；連云港科企水稻育種聯(lián)合體區(qū)試品種16份，編號(hào)GA-1～GA-8、GB-2～GB-9。以麗江新團(tuán)黑谷為感病對(duì)照。

1.2 稻瘟病基因功能標(biāo)記檢測(cè)

DNA提取及PCR檢測(cè)參考范方軍等[14]的方法。根據(jù)等位基因特異PCR原理，針對(duì)Pi-ta、Pi-b、Pi54和Pikm抗感等位基因序列差異設(shè)計(jì)引物(表1)。利用Pi-ta引物檢測(cè)到1 042 bp片段，同時(shí)Npi-ta引物擴(kuò)增不出目的片段，這樣的材料含有Pi-ta基因[17]；利用Pi-b引物檢測(cè)到365 bp片段，同時(shí)Npi-b引物擴(kuò)增不出目的片段，這樣的材料含有Pi-b基因，而Pi-b不能擴(kuò)增出目的片段，但是Npi-b引物可擴(kuò)增803 bp片段，攜帶有等位感病基因[18]；抗病基因Pi54功能標(biāo)記為共顯性標(biāo)記，擴(kuò)增片段216 bp(抗)/359 bp(感)[19]?？共』騊ikm由2對(duì)引物擴(kuò)增，Pikm1引物擴(kuò)增片段大小為174 bp(抗)/213 bp (感)，Pikm2引物擴(kuò)增片段大小為290 bp(抗)/332 bp(感)，2對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增出抗病目的片段，表明存在抗病基因Pikm[12]。

表1 用于PCR檢測(cè)的引物序列及擴(kuò)增片段長度Table 1 Sequences and amplified fragment size of primers used for PCR.

1.3 稻瘟病抗性鑒定

稻瘟病抗性鑒定由天津市植物保護(hù)研究所進(jìn)行。稻瘟病菌為2015年在水稻典型病株上分離的強(qiáng)致病性菌株，共計(jì)7個(gè)生理小種，包括天津市優(yōu)勢(shì)穩(wěn)定生理小種ZB17、ZC3、ZG1，以及江蘇省4個(gè)生理小種ZB21、ZC5、ZD5、ZF1。然后通過高粱粒擴(kuò)大培養(yǎng)，獲得含有大量分生孢子的病原菌接種體。采用人工接種和自然誘發(fā)相結(jié)合的方法進(jìn)行鑒定。4月13日將鑒定材料用菌蟲清藥液浸種處理48 h，撈出用清水沖洗兩遍，表面涼干播種。4月15日播種，撒播，苗瘟在苗床鑒定，葉瘟和穗頸瘟插秧后鑒定。調(diào)查和評(píng)價(jià)方法參照國家水稻區(qū)試方案和《水稻抗主要病蟲害評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)》執(zhí)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 稻瘟病抗性基因檢測(cè)結(jié)果

利用水稻稻瘟病基因Pi-ta、Pi-b、Pi54 和Pikm的功能標(biāo)記檢測(cè)2016 年山東省33份區(qū)試材料及連云港育種聯(lián)合體16份材料(圖1，表2)。結(jié)果表明魯資稻7號(hào)、袁策19號(hào)、魯資稻8號(hào)等15個(gè)品種含有抗稻瘟病基因Pi-ta；YS-6-6、潤農(nóng)9號(hào)、晶稻180等25個(gè)品種含有抗稻瘟病基因Pi-b；YS-6-6、晶稻180、圣稻053等26個(gè)品種含有Pi54基因；YS-6-6、圣稻053、濟(jì)稻1號(hào)等22個(gè)品種含有Pikm基因。其中魯資稻7號(hào)含有Pi-ta、Pi-b、Pi54 和Pikm4個(gè)抗性基因，YS-6-6、濟(jì)稻1號(hào)、D400等13個(gè)品種含有3個(gè)抗性基因。晶稻180、大糧303、圣稻053等20個(gè)品種攜帶2個(gè)抗性基因。臨稻10號(hào)、豐稻2號(hào)、天和糯303、TD-301、徐稻3號(hào)、臨稻21、圣稻052、隆粳21不含有Pi-ta、Pi-b、Pi54 和Pikm的抗病等位基因。

圖1 引物Pita、Npita、Pib、Npib、Pi54、Pikm1、Pikm2在不同品種中的擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The result of PCR using functional marker of Pita, Npita, Pib, Npib, Pi54, Pikm1 and Pikm2 in different varieties.注:M:DL2000；1～24：臨稻10號(hào)、YS-6-6、潤農(nóng)9號(hào)、晶稻180、圣稻053、濟(jì)稻1號(hào)、豐稻2號(hào)、大糧303、魯資稻7號(hào)、D400、臨13-10、天和糯303、TD-301、圣糯1號(hào)、H11-15、濟(jì)稻4號(hào)、墾育88、圣012、袁策19號(hào)、圣稻504、魯資稻8號(hào)、圣稻14、晶稻160、圣稻177。

編號(hào)品種名抗性基因分子標(biāo)記檢測(cè)Pi-taPi-bPi54Pikm稻瘟病抗性綜合評(píng)價(jià)綜合指數(shù)損失率最高級(jí)抗性等級(jí)W1601臨稻10號(hào)SSSS5．15MSW1602YS-6-6SRRR5．47MSW1603潤農(nóng)9號(hào)SRSS7．69HSW1604晶稻180SRRS6．37SW1605圣稻053SSRR4．33MSW1606濟(jì)稻1號(hào)SRRR2．83MRW1607豐稻2號(hào)SSSS5．17MSW1608大糧303SSRR4．53MSW1609魯資稻7號(hào)RRRR53MSW1610D400SRRR4．53MSW1611臨13-105SRRS7．39SW1622天和糯303SSSS5．57MSW1623TD-301SSSS5．47MSW1624圣糯1號(hào)SRSS5．59MSW1625H11-15SRRS7．67HSW1626濟(jì)稻4號(hào)SRRR4．43MSW1627墾育88SRRR4．53MSW1628圣012SSRR4．33MSW1629袁策19號(hào)RSSR4．43MSW1630圣稻504SSRS7．37SW1631魯資稻8號(hào)RRSR6．17SJ1601圣稻14SRRR5．57MSJ1602晶稻160SSRS6．37SJ1603圣稻177SSRR4．35MSJ1604D0610RRSS7．19SJ1605潤農(nóng)14SRRR7．47SJ1606圣稻072SRRR3．11MRJ1607臨13-110SRSR4．13MSJ1608濟(jì)T040SSRR4．43MSJ1609潤農(nóng)11RRSS5．15MSJ1610圣稻1647RRSR4．13MSJ1611大糧302RRSS5．43MSGA-1徐稻3號(hào)SSSS4．35MSGA-2連粳14JD24RRRR43MRGA-3泗2333RSSS43MRGA-4徐41368SSSR4．53MSGA-5淮258RRRS6．37SGA-6鹽稻1075RSSS6．15SGA-7揚(yáng)粳128RRSS7．59S

注：抗性基因分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果中：S：感病基因型；R：抗病基因型；稻瘟病抗性綜合評(píng)價(jià)結(jié)果中：S：感??；R：抗病；HS:高感；MS：中感；MR：中抗。

2.2 供試品種稻瘟病抗性鑒定

如表2所示，48份品種中，濟(jì)稻1號(hào)、圣稻072、連粳14JD24、泗2333 4個(gè)品種表現(xiàn)中抗(MR)；臨稻10、YS-6-6、圣稻053、徐稻3號(hào)等26個(gè)品種表現(xiàn)中感(MS)；晶稻180、臨13-105、圣稻504等15個(gè)品種表現(xiàn)感病(S)；H11-15、潤農(nóng)9號(hào)、晶稻160 3個(gè)品種表現(xiàn)高感(HS)。

2.3 供試水稻品種稻瘟病抗性與抗病基因的相關(guān)性分析

利用抗稻瘟病基因Pi-ta、Pi-b、Pi54和Pikm的功能標(biāo)記檢測(cè)試驗(yàn)材料。結(jié)果表明，48個(gè)品種可分為16種基因型(表3)。臨稻10號(hào)、豐稻2號(hào)、天和糯303等8個(gè)品種不含有這4個(gè)抗性等位基因，其中臨稻10號(hào)、豐稻2號(hào)、天和糯303等7個(gè)品種表現(xiàn)為中感，圣稻052表現(xiàn)為感病。泗2333、鹽稻1075只攜帶抗性基因Pi-ta，抗病鑒定分別為中抗和感?。皇ヅ?號(hào)、潤農(nóng)9號(hào)只攜帶抗病基因Pi-b，分別表現(xiàn)為中感和高感；3個(gè)品種只攜帶抗病基因Pi54，2個(gè)表現(xiàn)為感病，1個(gè)表現(xiàn)為高感；徐41368只檢測(cè)到抗病基因Pikm，表現(xiàn)為感??；含有2 個(gè)抗病基因Pi-ta和Pi-b的材料有4個(gè)，2份表現(xiàn)為中感，2份表現(xiàn)為感??；鄭稻20、新稻89含有Pi-ta和Pi54 2個(gè)抗病基因，表現(xiàn)為中感；袁策19含有Pi-ta和Pikm，表現(xiàn)為中感；含有Pi-b和Pi54的材料有4份，3份表現(xiàn)為感病，1份表現(xiàn)為高感；含有Pi-b和Pikm的材料有2個(gè)，1份表現(xiàn)為中感，1份表現(xiàn)為感?。缓蠵i54和Pikm的材料有5個(gè)，表現(xiàn)為中感；淮258含有抗病基因Pi-ta、Pi-b和Pi54，表現(xiàn)為感??；含有抗病基因Pi-ta、Pi-b和Pikm的材料有3個(gè)，1份表現(xiàn)為中抗，1份表現(xiàn)為中感，1份表現(xiàn)為感病；含有Pi-ta、Pi54和Pikm的材料有1個(gè)，表現(xiàn)為感??；含有抗病基因Pi-b、Pi54和Pikm的材料有8個(gè)，2份表現(xiàn)為中抗，5份表現(xiàn)為中感，1份表現(xiàn)為感?。霍斮Y稻7號(hào)、連粳14ZD24含有Pi-ta、Pi-b、Pi54和Pikm4個(gè)抗性基因，表現(xiàn)為中感。

相關(guān)性分析表明(表4)，抗稻瘟病基因Pikm與穗頸瘟發(fā)病率、穗頸瘟損失率、稻瘟病綜合指數(shù)、損失率最高級(jí)存在顯著相關(guān)性(相關(guān)系數(shù)分別為0.6164、0.4401、0.5156、0.4775、0.4563，P<0.01)。本研究中，其他3個(gè)基因與稻瘟病抗性表型間的相關(guān)性不顯著。

表3 供試材料抗病基因的分布及抗病性表現(xiàn)Table 3 The genotype combination and their resistance for blast of test materials.

注：MR:中抗；MS:中感；S:感?。籋S:高感。

表4 供試材料抗病基因的分布與稻瘟病抗性的相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis between the genes and disease reactions of plant materials in this study.

注：*表示相關(guān)性達(dá)顯著水平(P<0.05)。

3 討論

隨著水稻抗稻瘟病基因的定位、克隆及分子標(biāo)記的發(fā)展，對(duì)基于抗稻瘟病基因堿基序列的標(biāo)記進(jìn)行篩選，大大提高了抗病基因鑒定及育種選擇的效率，分子標(biāo)記輔助育種已成為抗病育種的一種簡(jiǎn)單快捷的途徑。改良水稻品種的抗性，育種家首先要清楚品種攜帶的抗病基因，并進(jìn)行抗性品種的合理布局。何重等[20]進(jìn)行了江蘇部分粳稻品種和品系中稻瘟病抗性基因Pi-ta和Pi-b的基因型分析，明確了Pi-ta和Pi-b在江蘇省部分粳稻中的分布。時(shí)克等[21]利用Pi-ta和Pi-b基因的特異性分子標(biāo)記，結(jié)合稻瘟病菌接種鑒定，檢測(cè)和分析了我國58份水稻主栽品種(雜交稻親本)的Pi-ta和Pi-b抗性基因型。范方軍等[14]對(duì)江蘇水稻品種進(jìn)行了稻瘟病基因的分子標(biāo)記檢測(cè)，結(jié)果表明Pi-b、Pi-ta、Pikm和Pi54是江蘇省粳稻育種中重要的抗病基因，其中抗稻瘟病基因Pi-ta與穗頸瘟抗性存在顯著相關(guān)性。王軍等[22]利用分子標(biāo)記輔助選擇進(jìn)行了水稻抗病基因Pi-ta、Pi-b和Stv-bi的聚合，提高了抗病育種效率。本文研究結(jié)果表明，Pi-ta、Pi-b、Pi54、Pikm在山東及黃淮區(qū)新選育品種中分布頻率較高，其中Pi-b、Pi54、Pikm的分布頻率超過或接近50%(限于本文供試品種)，Pi-ta分布頻度相對(duì)較低，這4個(gè)抗性基因已在山東及黃淮區(qū)抗稻瘟病育種中得到廣泛應(yīng)用，其中Pikm與稻瘟病抗性存在顯著相關(guān)。

本文只研究了Pi-ta、Pi-b、Pi54、Pikm在部分山東及黃淮區(qū)新選育品種中的分布情況，例如臨稻10號(hào)、豐稻2號(hào)、天和糯303、臨稻21、徐稻3號(hào)等8個(gè)品種不含以上4個(gè)抗性等位基因，對(duì)稻瘟病也存在一定抗性，表明可能含有其他稻瘟病抗性基因(如Pi5、Piz-t、Pi2等)，對(duì)于其他抗稻瘟病基因的分布利用情況有待進(jìn)一步研究[23～25]。

由于稻瘟菌的毒性易發(fā)生變異和新小種的產(chǎn)生，通常抗病品種在推廣3～5 年后就喪失了抗性。因此發(fā)掘廣譜抗性基因，提高水稻對(duì)稻瘟菌的持久廣譜抗性，一直以來都是水稻抗稻瘟病育種工作的重點(diǎn)。稻瘟病的防治應(yīng)該充分利用遺傳多樣性方法，在不同地區(qū)間和年度間種植不同類型的抗瘟品種，使抗性基因合理布局和輪換使用，以避免品種抗性和抗性基因的喪失，延長抗性品種的使用年限。近年來我國育種家在水稻抗稻瘟病育種領(lǐng)域取得了較大進(jìn)展，Deng等[26]成功克隆了持久廣譜抗稻瘟病基因Pigm，并揭示了水稻廣譜抗病與產(chǎn)量平衡的表觀調(diào)控新機(jī)制。Li等[27]通過大數(shù)據(jù)分析與遺傳、生化、病理等實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)手段相結(jié)合，挖掘了對(duì)稻瘟病的新型廣譜高抗的水稻遺傳資源，闡明了新型廣譜持久抗病的分子機(jī)理，為稻瘟病廣譜抗病育種提供了理論和應(yīng)用基礎(chǔ)。后續(xù)研究應(yīng)繼續(xù)加強(qiáng)廣譜抗稻瘟病基因資源的發(fā)掘與利用。

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