灰樹花多糖的分子修飾及其活性研究進(jìn)展

于 萍, 李 倩, 王 未, 鄭大恒, 張偉杰, 趙 婷, 張 敏, 茆廣華, 馮偉偉, 仰榴青

江蘇大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院, 江蘇 鎮(zhèn)江 212013

灰樹花(Grifolafrondosa)，又名栗子蘑、貝葉多孔菌、云蕈、舞茸等，隸屬多孔菌科(Polyporaceae)，樹花屬(Ramalina)[1,2]?；覙浠ㄈ赓|(zhì)脆嫩，是一種高蛋白低脂肪的食品，其子實(shí)體和菌絲體中均含有豐富的膳食纖維、蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖、脂類、維生素和鉀、磷、鐵、鋅、鈣、硒等多種營養(yǎng)成分[3,4]，具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化和抗腫瘤等多種生物活性，是珍貴的食藥兩用真菌之一，其中，灰樹花多糖是其主要的活性成分之一。

多糖的生物活性與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。對多糖進(jìn)行分子修飾是提高它原有生物活性或增加新活性的重要途徑之一，可擴(kuò)大多糖的應(yīng)用范圍[5,6]。研究表明，灰樹花多糖經(jīng)過分子修飾后，其空間結(jié)構(gòu)、分子量及取代基的種類、數(shù)目和位置均可能發(fā)生改變，其物理化學(xué)性質(zhì)和生物活性也隨之改變[7]。因此，本文就近年來灰樹花多糖分子修飾的主要方法、修飾后多糖的生物活性進(jìn)行綜述，以期為灰樹花多糖的深入研究和開發(fā)利用提供參考。

1 灰樹花多糖的分子修飾

目前，灰樹花多糖分子修飾的方法主要分為兩類，一類是降解修飾，即通過酶降解、化學(xué)降解和聯(lián)合降解等方式得到不同分子量范圍的多糖；另一類是接枝修飾，主要包括硫酸酯化、羧甲基化、富硒和富鋅等方式。

1.1 降解修飾

天然多糖一般為高分子化合物，分子量較大，可以達(dá)到幾十萬到幾百萬不等[8]，導(dǎo)致其粘度高、溶解度低，影響了機(jī)體對于多糖分子的吸收。分子降解可以把高分子量的多糖降解為適宜分子量的多糖片段，有利于提高其生物活性。

1.1.1酶降解 酶降解具有高效專一性，同時降解速度快、反應(yīng)條件溫和可控。Fan等[9]考察了纖維素酶、果膠酶和胰酶復(fù)合酶解提取灰樹花多糖的得率及含量，且比較了酶解前后灰樹花多糖的抗氧化活性，結(jié)果表明，采用纖維素酶∶果膠酶∶胰酶=2∶2∶1的復(fù)合酶解體系提取灰樹花多糖，得率和含量分別為21.2%和39.6%，均高于熱水浸提法(13.9%和21.3%)，抗氧化活性測定結(jié)果表明，復(fù)合酶解灰樹花多糖對自由基 (·OH、DPPH·、ABTS+)的清除率均高于酶解前灰樹花多糖。

1.1.2化學(xué)降解 化學(xué)降解通常利用硫酸、過碘酸或醋酸酐等進(jìn)行降解。楊娜等[10]利用甲酸/H2O2/Vc體系對灰樹花多糖進(jìn)行降解，并考察降解灰樹花多糖的抑瘤活性和抗氧化活性，結(jié)果表明降解后灰樹花多糖在瓊脂凝膠電泳譜圖上有較窄的譜帶，遷移率也大于未降解灰樹花多糖，表明得到了分子量分布范圍較窄的多糖片段(PGF-1和PGF-2)；活性測試結(jié)果表明降解后多糖組分均有抑制腫瘤活性,且PGF-2抑制腫瘤的作用和清除自由基能力較好。

1.1.3聯(lián)合降解 目前，灰樹花多糖的降解通常采用聯(lián)合降解的方式。劉紅梅等[11,12]利用微波-復(fù)合酶法降解灰樹花多糖并考察其免疫活性及抗腫瘤活性，降解條件為微波功率1 400 W，微波輻射30 min，木瓜蛋白酶∶纖維素酶∶果膠酶=2∶2∶1的比例復(fù)合酶解90 min,活性測試結(jié)果表明，降解后多糖有顯著的免疫活性且與多糖濃度正相關(guān)，且分子量為100 kDa的灰樹花多糖有較強(qiáng)的抗腫瘤活性。

1.2 接枝修飾

1.2.1硫酸酯化 硫酸根取代單糖分子上的羥基形成硫酸多糖，也稱多糖硫酸酯或硫酸酯化多糖。硫酸多糖包括從海洋多糖、肝素和植物多糖中提取的天然硫酸多糖，以及通過化學(xué)修飾等方法人工合成的硫酸多糖[13]。目前，灰樹花多糖硫酸酯化常用的方法主要有氯磺酸-甲酰胺法、氯磺酸-吡啶法和三氧化硫三甲胺鹽-DMF法[7]。

Nie等[14]利用堿提酸沉法從發(fā)酵的灰樹花菌絲體中獲得水溶性多糖，經(jīng)過氯磺酸-吡啶法硫酸修飾，得到水溶性硫酸酯化灰樹花多糖，測得其硫酸根取代度為1.74。韓建濤[15]通過單因素實(shí)驗(yàn)研究氯磺酸-吡啶法修飾灰樹花多糖的最佳條件為：吡啶與氯磺酸比例為15∶1，反應(yīng)溫度為80℃，反應(yīng)時間為3 h，此條件下該硫酸酯化灰樹花多糖的酯化度為1.45。高昊東[7]分別考察了氯磺酸-甲酰胺法、三氧化硫三甲胺鹽-DMF法和三氧化硫吡啶鹽-吡啶法對灰樹花水不溶性多糖GF4A硫酸酯化修飾的影響，并通過單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化工藝，結(jié)果表明三氧化硫三甲胺鹽-DMF法為最優(yōu)硫酸酯化方法，最佳反應(yīng)條件為：三氧化硫三甲胺鹽與灰樹花多糖比例為5∶1，反應(yīng)時間為6 h，反應(yīng)溫度為80℃，該條件下，硫酸酯化衍生物的得率為153.7%，硫酸根取代度為1.59，相對分子質(zhì)量為88 kDa。其中，GF4A以α-1,3-D-葡萄糖和α-1,3-D-甘露糖為主鏈，β-1,4-D-葡萄糖或α-1,4 -木糖為側(cè)鏈，其單糖摩爾比為葡萄糖∶甘露糖∶木糖=9∶2∶1。硫酸酯化修飾后C-6位羥基被完全酯化，C-4和C-2位羥基部分酯化。

1.2.2羧甲基化 除硫酸酯化外，羧甲基化也是一種重要的多糖修飾手段，可增加多糖的水溶性進(jìn)而提高了多糖的生物活性。目前，羧甲基化修飾的一般過程是將多糖分散在異丙醇中，邊攪拌邊加入固體NaOH，再加入氯乙酸進(jìn)行非均相取代，得到可溶性羧甲基化多糖[16]。王瑩[17]利用二次加堿法進(jìn)行羧甲基化反應(yīng)，即部分NaOH用于灰樹花多糖的預(yù)處理，使多糖充分堿化，另一部分NaOH加入到反應(yīng)體系中，從而提高氯乙酸的利用率，在該條件下羧甲基化灰樹花多糖得率為72%，羧甲基度為1.55，所得多糖分子量為114 kDa。

1.2.3富硒 硒是人體必需的微量元素之一，是體內(nèi)部分酶的重要組成部分，具有提高機(jī)體免疫力、抗腫瘤、抗衰老等活性[2]。硒多糖是硒在生物體內(nèi)主要的存在形式之一，兼有硒和多糖的雙重活性。李玲飛[18]研究了灰樹花菌絲體的富硒特性，結(jié)果表明低濃度硒可以提高灰樹花菌絲體中多糖的含量，在250 μg/g的硒培養(yǎng)基中，灰樹花仍能較好生長，說明其有較強(qiáng)的硒耐受性，且其富集硒含量與固體培養(yǎng)基中硒添加量成線性正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.9477，有較強(qiáng)的富硒能力。茆廣華等[19]通過袋料拌施方式和菌面噴施方式培養(yǎng)獲得了富硒灰樹花子實(shí)體，并考察了不同富硒方式對其生長及產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明，灰樹花子實(shí)體的最佳富硒方式為菌面噴施亞硒酸鈉5.785 mg/段，產(chǎn)量為28 g/段，硒含量是11.98 μg/g，同時對其生長無明顯抑制作用。其中，獲得的富硒灰樹花多糖以β-1,6-D-半乳糖、α-1,3-D-葡萄糖和β-1,6-D-甘露糖為主鏈。

1.2.4富鋅 鋅作為人體必需微量元素之一，是人體多種酶的組成成分，能促進(jìn)皮膚、骨骼和性器官的正常發(fā)育，被稱為“生命的元素”。研究表明，人體內(nèi)鋅缺乏會導(dǎo)致兒童生長遲緩、皮膚炎、傷口難愈合和胎兒畸形等癥狀[20]。Zhang等[21]選取不同濃度的硫酸鋅溶液加入到灰樹花菌絲體PDA液體培養(yǎng)基中，得到富鋅灰樹花菌絲體。通過比較培養(yǎng)基中菌絲體的產(chǎn)量和富鋅率，確定最佳富鋅濃度為50 μg/mL。該條件下，其產(chǎn)量為1.77 g/L，鋅含量為16.5 mg/g，富鋅率可達(dá)到35.2%。其中，鋅化前后灰樹花多糖的主要成分均為鼠李糖，但其含量較低。

2 分子修飾對灰樹花多糖活性的影響

灰樹花多糖主要由D-葡萄糖、D-甘露糖、D-木糖、L-鼠李糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖和D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖醛酸和D-甘露糖醛酸等組成，不同糖基相互組合、連接、修飾可以形成多種不同的構(gòu)象，各個糖基在2、3、4位或6位上可以通過α或β糖苷鍵連接一個殘基，從而使灰樹花多糖具有多樣性[22～25]。目前已發(fā)現(xiàn)灰樹花多糖的活性組分包括D組分[26]、X組分[27]、MD組分[28]和SX組分等(表1)[29]，D組分與MD組分具有相似的多糖結(jié)構(gòu)，均為含有β-1,3分支的β-1,6-葡聚糖，主要體現(xiàn)為抗腫瘤和調(diào)節(jié)免疫力等生理活性[30,31]。X組分為含有α-1,4分支的β-1,6-葡聚糖，能夠通過提高機(jī)體對胰島素的敏感程度調(diào)節(jié)血糖血脂水平[32]。多糖的一級結(jié)構(gòu)包括糖基的組成、排列順序、鏈接方式及糖鏈分支的位置、類型和長短等。多糖的生物活性不僅與多糖分子的一級結(jié)構(gòu)有關(guān)，高級結(jié)構(gòu)也對其生理活性產(chǎn)生影響。其中，高級結(jié)構(gòu)指以氫鍵結(jié)合的多糖主鏈的構(gòu)象、由于糖單元間的非共價作用導(dǎo)致的二級結(jié)構(gòu)空間構(gòu)象和多聚鏈間非共價鍵結(jié)合而成的聚集體等[17,33]。分子修飾可以改變多糖的結(jié)構(gòu)進(jìn)而影響其生物活性。有研究表明，灰樹花多糖經(jīng)分子修飾后，其抗腫瘤、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)等活性明顯增強(qiáng)[34]。

2.1 免疫調(diào)節(jié)作用

研究表明多糖類化合物是一種很好的免疫調(diào)節(jié)劑，能夠激活免疫受體，提高機(jī)體免疫力，同時具有毒副作用小、效果好等優(yōu)點(diǎn)[35]。郭克曉[36]考察了灰樹花多糖(GFD)以及硫酸酯化灰樹花多糖(S-GFD)的免疫調(diào)節(jié)作用。結(jié)果表明，灌胃給藥10 mg/kg·d時，S-GFD能顯著增加小鼠胸腺、脾臟重量，增強(qiáng)正常小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬率和吞噬指數(shù)，且作用顯著高于GFD，說明硫酸酯化灰樹花多糖的免疫調(diào)節(jié)作用強(qiáng)于未修飾灰樹花多糖。程代等[37]考察了水不溶性硫酸酯化灰樹花多糖S-GFP對RAW264.7細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果表明，在一定濃度和時間范圍內(nèi)，S-GFP能顯著提高RAW264.7的增殖能力并呈劑量依賴關(guān)系，其最佳作用時間為36 h，最佳劑量為40 μg/mL。Mao等[34]研究了富硒灰樹花多糖(Se-GP)在小鼠體內(nèi)的免疫活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型對照組相比，在Se-GP劑量為54 mg/kg、108 mg/kg和216 mg/kg時，Se-GP可以顯著增加小鼠胸腺指數(shù)和血清內(nèi)腫瘤壞死因子(TNF-α)和白細(xì)胞介素-2(IL-2)的水平，促進(jìn)巨噬細(xì)胞和NO的產(chǎn)生，表明該富硒灰樹花多糖具有免疫調(diào)節(jié)作用。

表1 灰樹花多糖中的活性組分及結(jié)構(gòu)Table 1 Active component and structure of polysaccharides from Grifola frondosa.

2.2 抗氧化活性

灰樹花多糖具有清除體內(nèi)自由基、增強(qiáng)機(jī)體抗氧化活性、延緩衰老的作用。研究表明，經(jīng)分子修飾后抗氧化活性明顯增強(qiáng)[38]。Fan等[9]考察了灰樹花粗多糖(GFP)和復(fù)合酶解灰樹花多糖(FGFP)的體外抗氧化活性。結(jié)果表明，多糖濃度為1 mg/mL時，F(xiàn)GFP對·OH、DPPH·的清除率分別為83.1%和69.7%，明顯高于GFP的清除率(43.6%和35.8%)，說明復(fù)合酶酶解后灰樹花多糖的自由基清除活性高于灰樹花多糖。Zhang等[21]考察了灰樹花胞內(nèi)多糖(GIPS)和胞內(nèi)鋅多糖(GIZPS)的體外抗氧化活性和小鼠體內(nèi)抗氧化活性。實(shí)驗(yàn)表明，多糖濃度為400 mg/L時，GIZPS對·OH和DPPH·的清除率分別達(dá)到了89.89%和57.73%，顯著高于GIPS對·OH和DPPH·的清除率(44.19%和28.40%)，說明GIZPS的自由基清除活性高于GIPS；同時二者都能夠有效提高小鼠總抗氧化能力與超氧化物歧化酶含量，降低體內(nèi)丙二醛含量，從而抵抗機(jī)體的活性氧損傷。

2.3 抗腫瘤作用

硫酸酯化灰樹花多糖的抗腫瘤活性主要表現(xiàn)為增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，或直接抑制腫瘤細(xì)胞生長。王瑩[17]利用S180腫瘤模型小鼠檢測硫酸化灰樹花多糖的抑瘤活性，結(jié)果表明，低、中、高3個劑量組的抑瘤率分別為39.80%、51.74% 和46.77%，均高于香菇多糖對照組抑瘤率33.33%。Wang等[39]研究硫酸酯化灰樹花多糖(S-GFP)對人體肝癌細(xì)胞 HepG2的抑制作用，結(jié)果表明S-GFP對HepG2的抑制作用與濃度呈依賴關(guān)系，濃度為61 μg/mL時作用48 h可達(dá)50%的抑制率。毛逸嶸等[40]探討了灰樹花多糖及其硫酸酯化衍生物對腫瘤細(xì)胞生長的影響，結(jié)果表明，硫酸酯化灰樹花多糖組分對腫瘤細(xì)胞的生長表現(xiàn)出較明顯的抑制作用，抑制率最高可達(dá)41.45%。楊娜[10]考察了分子降解后灰樹花多糖組分PGF-b1和PGF-b2對腫瘤細(xì)胞的抑制作用。結(jié)果表明，降解后灰樹花多糖對荷瘤動物體重均沒有明顯影響，且高劑量(50 mg/kg·d)的PGF-b2抑瘤效果最好。張媛媛等[41]考察了降解后灰樹花多糖組分(GFD-1，29.574 kDa)對HepG2細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果表明經(jīng)94 μg/mL GFD-1作用48 h后，HepG2細(xì)胞的凋亡率從1.89%增至39.27%，說明GFD-1可以誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡。茆廣華等[19]采用Heps小鼠模型考察了富硒灰樹花多糖(Se-GP)和未富硒灰樹花多糖(GP)的抗腫瘤活性，發(fā)現(xiàn)劑量為54 mg/kg時，Se-GP的抑瘤率可達(dá)到64.38%，Se-GP活性顯著高于GP。

2.4 調(diào)節(jié)血糖、血脂作用

灰樹花多糖還具有調(diào)節(jié)血糖、血脂的作用。Konno等[42]研究表明灰樹花多糖SX組分可以靶向胰島素信號，尤其是胰島素受體，激活受損胰島素信號通路，從而促進(jìn)葡萄糖的吸收，具有降血糖活性。楊慶偉等[43]研究發(fā)現(xiàn)灰樹花菌絲體多糖大多難溶于水，影響其生物活性,因此對灰樹花菌絲體多糖進(jìn)行硫酸酯化以提高其水溶性，同時研究其對小鼠血脂的影響，結(jié)果表明，硫酸化灰樹花多糖有明顯的調(diào)節(jié)血脂作用，在給藥劑量為50 mg/kg·d時，高血脂癥小鼠血脂水平明顯降低，接近正常水平。

2.5 化療藥物輔助劑

灰樹花多糖還能夠作為化療藥物的輔助劑。毛逸嶸等[40]用水提醇沉的方法得到灰樹花粗多糖GFP，經(jīng)0.1 g/L疊氮化鈉溶液洗脫得GFP-F、GFP-M和GFP-L組分，分別對其硫酸酯化得GFP-FS、GFP-MS和GFP-LS組分。將各組分與阿霉素聯(lián)用觀察其對腫瘤細(xì)胞抑制效果。結(jié)果表明，硫酸酯化各組分的抑瘤效果顯著高于未硫酸酯化的各組分，且GFP-MS組分聯(lián)用的效果最好，最高可達(dá)到64.51%。Louie等[44]研究灰樹花多糖D組分和α-干擾素對膀胱癌細(xì)胞的抑制試驗(yàn)，結(jié)果表明，D組分和干擾素單獨(dú)作用的抑制率最高分別為53%(700 μg/mL)和66%(50 000 IU/mL)，而D組分和干擾素聯(lián)合應(yīng)用的抑制率為75%(200 μg/mL和10 000 IU/mL)，說明D組分可以協(xié)同干擾素抑制膀胱癌細(xì)胞。茆廣華[19]考察了富硒灰樹花多糖對抗腫瘤藥物5-氟尿嘧啶(5-Fu)的減毒作用，結(jié)果表明，富硒灰樹花多糖能明顯抑制小鼠免疫器官指數(shù)和外周血白細(xì)胞數(shù)量的減少，同時對5-Fu所致的肝損傷有一定的修復(fù)作用。

2.6 抗凝血活性

研究表明，硫酸根對硫酸多糖的抗凝血活性起著關(guān)鍵作用[13]。高昊東[7]采用合成的硫酸酯化灰樹花多糖進(jìn)行了家兔抗凝血活性實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著硫酸酯化灰樹花多糖濃度的增加，家兔的凝血時間明顯延長。在濃度為50 μg/mL時，抗凝血活性最明顯，效果相當(dāng)于同劑量肝素的50倍。Wang等[45]通過考察硫酸化灰樹花多糖(S-GFP)對人微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HMEC)增殖的抑制作用，檢測其抗凝血作用。結(jié)果表明，S-GFP處理72 h后，HMEC細(xì)胞的增殖明顯降低，S-GFP濃度為100 μg/mL時，HMEC細(xì)胞的抑制率與時間呈依賴關(guān)系。

2.7 其他活性

除以上已報道的活性外，分子修飾后灰樹花多糖還具有抗病毒、抗輻射、保護(hù)肝臟、抑菌等作用。Komada等[46]通過研究表明D組分和抗菌藥物聯(lián)用可以減少抗菌藥物的用量，證明其有一定的抑菌作用。Gu等[47]研究了灰樹花多糖D組分與人體α-2b干擾素相結(jié)合對乙肝病毒的抑制作用，結(jié)果表明，灰樹花多糖D組分和人體α-2b干擾素單獨(dú)作用乙肝病毒的半抑制濃度分別為0.59 mg/mL和1 399 IU/mL，同0.45 mg/mL的D組分灰樹花多糖結(jié)合后的干擾素半抑制濃度為154 IU/mL，表明灰樹花多糖D組分可以協(xié)同α-2b干擾素抑制乙肝病毒。Nanba等[28]將肝臟特異性脂蛋白注射到小鼠體內(nèi)構(gòu)建肝炎小鼠，通過口服或注射X組分考察其對肝炎小鼠的影響。結(jié)果表明，灰樹花多糖組分可以激發(fā)T細(xì)胞活性，從而減輕肝炎病癥。熊琪等[48]研究了灰樹花多糖對大氣細(xì)顆粒物PM2.5染毒后的大鼠肺泡巨噬細(xì)胞(NR8383)損傷的拮抗作用。結(jié)果表明，與細(xì)顆粒物標(biāo)準(zhǔn)品SRM2786染毒組相比，灰樹花多糖與SRM2786(125 μg/mL)共存情況下NR8383的存活率明顯提高，說明灰樹花多糖可以改善由PM2.5引發(fā)的NR8383細(xì)胞損傷。

3 展望

灰樹花營養(yǎng)豐富，被譽(yù)為“真菌之王”，其多糖組分具有多種生物活性?；覙浠ǘ嗵墙?jīng)分子修飾后可以得到具有多種不同生物活性的多糖衍生物，因此，對灰樹花多糖進(jìn)行深入研究具有重要的理論和實(shí)際應(yīng)用價值。然而，雖然目前對于灰樹花多糖有一些研究，但仍存在以下問題：①灰樹花多糖分子修飾方法的研究還不夠系統(tǒng)全面；②修飾后灰樹花多糖結(jié)構(gòu)尚不清楚；③修飾后灰樹花多糖的活性作用機(jī)制尚不明確；④修飾后灰樹花多糖構(gòu)效關(guān)系的研究還不夠深入。隨著灰樹花多糖分子修飾及其活性機(jī)制的研究不斷深入，灰樹花多糖將作為一種安全有效的生物活性物質(zhì)被廣泛應(yīng)用在食品以及醫(yī)藥領(lǐng)域。

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