氣相色譜-質譜聯(lián)用測定食用香精香料中15種萜烯醇酯

佟亞楠，李寶志，劉文春，李鳳琴，李鋒，孫明

（1.吉林煙草工業(yè)有限責任公司品質控制部，吉林長春130031；2.吉林煙草工業(yè)有限責任公司技術中心，吉林長春130031）

食用香料和香精通常因其具有天然瓜果等的香和味而被廣泛應用于現(xiàn)代食品工業(yè)，以提高食品品質[1]。食用香料和香精是經(jīng)常使用的一大類食品添加劑，目前國家食品工業(yè)可以使用的食品香料、香精有上千種之多。按照標準規(guī)定的用量使用香料和香精一般不會危害人體健康[2]，但過量使用則會帶來嚴重危害。此外，近年來研究發(fā)現(xiàn)，一些香料中含有黃樟素等有害成分[3-4]，這些有害成分的存在給食品的安全性埋下了隱患。目前食品行業(yè)對產(chǎn)品中所含添加劑進行標注時往往僅簡單標注“食用香精”，而不標注具體成分和含量，這不僅不能客觀地約束生產(chǎn)企業(yè)不規(guī)范使用食用香精、香料，且給質量監(jiān)控造成了困擾[5]。

研究表明，萜烯類化合物及其衍生物是香精、香料的重要成分[6-7]，例如香葉醇和橙花醇，是無環(huán)單萜烯醇類化合物，具有溫和而甜的玫瑰花香，留香較長，是玫瑰系香精的主劑，且具有抗菌和驅蟲等功效，廣泛應用于食用香精、日化香精、煙草、藥物等領域[8]。香葉醇、橙花醇是非常有價值的天然產(chǎn)物，其酯類化合物是相關香料的重要成分，具有香檸檬、薰衣草樣持久香氣，使人心曠神怡、清新舒暢，是制備高級香精不可缺少的香料，在日化、食品等工業(yè)中具有十分重要的地位[9-11]，被廣泛用于配制食品香精、香水香精、化妝品香精、皂用香精等。除香葉醇和橙花醇外，香料和香精中常見的萜烯類化合物及其衍生物還有異丁酸橙花酯、異丁酸香葉酯、2-甲基丁酸橙花酯、異戊酸橙花酯、2-甲基丁酸香葉酯、異戊酸香葉酯、反-2-己烯酸香葉酯、糠酸橙花酯、糠酸香葉酯、苯甲酸橙花酯、苯甲酸香葉酯、肉桂酸橙花酯、肉桂酸香葉酯、肉豆蔻酸橙花酯、肉豆蔻酸香葉酯等。

隨著食品、日化等領域對萜烯醇酯的使用量的增加，有必要分析食用香精香料樣品中萜烯醇酯的含量，以確保產(chǎn)品的安全性。但因食用香精香料中的成分比較復雜，目前國內(nèi)外尚未建立香料香精中萜烯醇酯的檢測標準，也缺乏分析方法和檢測數(shù)據(jù)[12]。因此，建立香料香精中15種常見萜烯醇酯類化合物的檢測方法具有重要理論意義和現(xiàn)實意義。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Clarus 600氣相色譜質譜聯(lián)用儀：美國PerkinElmer公司；Milli-Q integral 10超純水儀：美國Millipore公司；AB204-S型電子分析天平：瑞士Mettler Toledo公司；HY-5型回旋式振蕩器：江蘇榮華儀器制造有限公司。

標準品（異丁酸橙花酯、異丁酸香葉酯、2-甲基丁酸橙花酯、異戊酸橙花酯、2-甲基丁酸香葉酯、異戊酸香葉酯、反-2-己烯酸香葉酯、糠酸橙花酯、糠酸香葉酯、苯甲酸橙花酯、苯甲酸香葉酯、肉桂酸橙花酯、肉桂酸香葉酯、肉豆蔻酸橙花酯和肉豆蔻酸香葉酯）：純度≥97%，美國Sigma-Aldrich公司；二氯甲烷、乙醇：色譜純，德國Merck公司。

1.2 標準溶液的配制

內(nèi)標溶液：精密稱取內(nèi)標物3-苯丙酸乙酯500.0 mg，用乙醇溶解并定容至100 mL的容量瓶中，得到濃度為5 mg/mL的內(nèi)標溶液。

15種萜烯醇酯混合標準溶液Ⅰ：分別稱取0.1 g（精確至0.1 mg）15種萜烯醇酯標準品，用乙醇溶解并定容至50 mL的容量瓶中，配制濃度為2 mg/mL的混合標準溶液Ⅰ，置冰箱于4℃下保存，有效期3個月。

15種萜烯醇酯混合標準溶液Ⅱ：準確移取10 mL混合標準溶液Ⅰ，置于100 mL容量瓶中，以乙醇稀釋并定容至刻度，配制濃度為200 μg/mL的混合標準溶液Ⅱ，置冰箱于4℃下保存，有效期3個月。

標準工作溶液的配制：準確移取 0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mL混合標準溶液Ⅱ，置于10 mL容量瓶中，加入50 μL內(nèi)標溶液，用乙醇稀釋并定容至刻度，制得標準工作溶液，其濃度分別為：2、4、10、20、40 μg/mL。

1.3 樣品處理

準確稱取0.3 g（精確至0.1 mg）食用香精、香料樣品于50 mL具塞三角瓶中，分別加入50 μL內(nèi)標溶液和10 mL乙醇，用漩渦混合器混合均勻，再用超聲萃取30 min，加入適量無水硫酸鈉充分脫水，靜置，取上層清液，經(jīng)0.22 μm尼龍膜過濾后，得到待測樣品溶液，其中內(nèi)標物在提取液中的濃度為25 μg/mL。

1.4 氣相色譜-質譜儀器分析條件

設定GC-MS分析條件，分別對標準工作溶液、樣品溶液和空白溶液進行檢測分析，具體分析條件為色譜柱：Elite-35MS毛細管色譜柱，固定相：35%苯基/65%甲基聚硅氧烷，規(guī)格：60 m×0.25 mm×0.25 μm；進樣口溫度：280℃；進樣量：0.5 μL，不分流進樣；載氣：氦氣（純度≥99.999%），恒流模式，流速：1.0 mL/min；升溫程序：初始溫度60℃，以 5℃/min升溫至260℃，保持10 min。質譜分析條件：電離方式：電子轟擊源（EI）；電離能量：70 eV；傳輸線溫度：260 ℃；離子源溫度：200℃；溶劑延遲：8 min，選擇離子掃描模式（SIM）分段掃描，以特征離子進行定量分析；15種萜烯醇酯定量和定性選擇離子見表1。

表1 15種萜烯醇酯類化合物定量和定性選擇離子Table 1 Retention times，quantitative ions and qualitative ions of the fifteen terpene carboxylates

續(xù)表1 15種萜烯醇酯類化合物定量和定性選擇離子Continue table 1 Retention times，quantitative ions and qualitative ions of the fifteen terpene carboxylates

2 結果與討論

2.1 氣相色譜條件的優(yōu)化

色譜柱的填料、規(guī)格很大程度上影響檢測的效果。增加柱長可使理論塔板數(shù)增大，但同時使峰寬加大，分析時間延長。因此，填充柱的柱長要選擇適當。一般情況下，柱長選擇以使組分能完全分離，分離度達到所期望的值為準。比較了Elite-35MS、Elite-17MS和HP-INNOWAX色譜柱對香精、香料中萜烯醇酯類化合物的分離效果。結果發(fā)現(xiàn)，以色譜柱Elite-35MS檢測標準工作溶液效果最好，其填料為35%苯基/65%甲基聚硅氧烷，中等極性色譜柱，規(guī)格：60 m×0.25 mm×0.25 μm。色譜圖如圖1所示。結果顯示，以該方法檢測標準工作溶液，萜烯醇酯類化合物峰形和分離效果較好。

圖1 Elite-35MS檢測15種萜烯醇酯類化合物混合標準溶液的總離子流圖Fig.1 Elite-35MS/TIC of the fifteen terpene carboxylates mixed standard solution

以色譜柱Elite-17MS檢測標準工作溶液效果，Elite-17MS色譜柱的填料為50%苯基/50%甲基聚硅氧烷，中等極性色譜柱，規(guī)格：30 m×0.25 mm×0.25 μm。色譜圖如圖2所示。結果顯示，以該方法檢測標準工作溶液，萜烯醇酯類化合物不能很好的分離，出現(xiàn)目標化合物峰的重疊。

圖2 Elite-17MS檢測15種萜烯醇酯類化合物混合標準溶液的總離子流圖Fig.2 Elite-17MS/TIC of the fifteen terpene carboxylates mixed standard solution

以色譜柱HP-INNOWAX檢測標準工作溶液效果，HP-INNOWAX色譜柱的填料：鍵合/交聯(lián)聚乙醇，強極性柱，規(guī)格：30 m×0.25 mm×0.25 μm。色譜圖如圖3所示。結果顯示，以該方法檢測標準工作溶液，萜烯醇酯類化合物不能很好的分離，出現(xiàn)目標化合物峰的重疊，并且，基線出現(xiàn)飄移。

圖3 HP-INNOWAX檢測15種萜烯醇酯類化合物混合標準溶液的總離子流圖Fig.3 HP-INNOWAX/TIC of the fifteen terpene carboxylates mixed standard solution

結果表明，Elite-35MS毛細管色譜柱的峰型和分離效果最好。且本方法試驗表明，色譜柱的長度影響樣品的分離度，柱子越長分離度越高，信噪比越高。

2.2 方法的線性方程及檢出限

標準工作曲線繪制及結果計算：分別取標準工作溶液進行分析，以標準工作溶液中15種萜烯醇酯類化合物和3-苯丙酸乙酯的色譜峰面積比對其相應濃度比進行回歸分析，得到標準曲線；取最低濃度工作標準溶液，做10次平行試驗，計算標準偏差，3倍標準偏差為檢出限，10倍標準偏差為定量限，結果如表2所示。

表2 15種萜烯醇酯類化合物的標準曲線、相關系數(shù)、檢測限和定量限Table 2 Regression equations，correlation coefficients，limits of detection（LODs）and limits of quantification（LOQs）of the fifteen terpene carboxylates

2.3 方法的精密度和加標回收率進行檢測

方法的準確度、精密度分別用回收率和相對標準偏差衡量。對同一樣品在相同條件下，取樣6次，并根據(jù)測定結果的平均值計算15種萜烯醇酯類化合物的相對標準偏差（RSD%）；對食用香精、香料樣品中，分別添加低、中、高3種水平的標準溶液，標準加入量分別為10、100、500 mg/kg進行加標回收率試驗，計算含量的方法為：將相同條件下測得的樣品溶液中15種萜烯醇酯類化合物和3-苯丙酸乙酯的色譜峰面積比，代入所繪制的標準曲線，求得樣品中萜烯醇酯類化合物的含量，結果詳見表3。

從表3可知，15種萜烯醇酯的平均加標回收率在83.4%～113.8%范圍內(nèi)，相對標準偏差（RSD）在2.31%～4.11%之間，表明本方法準確性高，重復性好，適合定量分析。

表3 15種萜烯醇酯類化合物的回收率與相對標準偏差Table 3 Recoveries and relative standard deviations（RSD）of the fifteen terpene carboxylates

2.4 實際樣品的測定及與標準方法的比較

應用所建立的方法，選取5個食用香精香料樣品（樣品類型包括表香、精油和浸膏等），測定樣品中萜烯醇酯類化合物的含量。不同食用香精香料中萜烯醇酯類化合物的含量見表4。

表4 不同食用香精香料中萜烯醇酯類化合物的含量Table 4 Contents of the fifteen terpene carboxylates in flavor samples mg/kg

結果說明，本試驗提供的方法能夠快速，準確對食用香精香料中萜烯醇酯類化合物進行定量、定性分析。

3 結論

本文提供一種萜烯醇酯類化合物的氣相色譜-質譜聯(lián)用檢測方法，比較了Elite-35MS、Elite-17MS和HP-INNOWAX色譜柱，選擇了峰形和分離效果最好的Elite-35MS柱為分離柱，所采用的色譜條件使15種目標化合物及內(nèi)標色譜峰都分離度較好，并且均具有較好的線性相關性，檢出限在1.95 mg/kg～4.01 mg/kg之間，平均加標回收率在83.4%～113.8%之間，相對標準偏差（RSD）均小于5.0%。本方法的回收率高，重復性好，適合于食用香精香料中萜烯醇酯的定性確認、定量分析。

[1]關多元,孫文亮,黃正興.食品分析[J].分析試驗室,2000,19(6):99-108

[2]廖惠云,曹毅,莊亞東,等.氣相色譜-質譜聯(lián)用內(nèi)標法測定食用香精中的芝麻酚[J].分析測試學報,2013,32(6):721-725

[3]李長于,李祖光,周示玉,等.氣相色譜-串聯(lián)質譜法測定香精香料中的香豆素和黃樟素[J].質譜學報,2011,32(5):265-270

[4]De Jaqer L S,Perfetti G A,Diachenko G W.Determination of coumarin,vanillin,and ethyi vanillin in vanilla extract products:liquid chromatography mass spectrometry method development and validation studies[J].Journal of chromatography A,2007,1145:83-88

[5]崔慶新,王方.氣相色譜-質譜聯(lián)用法在食品分析中的應用[J].聊城大學學報,2009,22(3):48-52

[6]李寶志,黃飛,佟亞楠,等.香葉酯衍生物的合成、表征及其熱裂解研究[J].廣州化工,2014,42(15):92-95

[7]王露,高智明,劉玉梅,等.酒花中萜烯醇類化合物的研究進展[J].中國釀造,2013,32(11):1-6

[8]Hans Leijs,Broekhans,Leon Van Pelt,et al.Quantitative Analysis of the 26 Allergens for Cosmetic Labeling in Fragrance Raw Materials and Perfume Oils[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2005,53:5487-5491

[9]楊君,蔣健,王軍淋,等.超聲輔助液液萃取-氣相色譜-質譜指紋圖譜應用于煙用香精香料的檢測[J].理化檢驗,2012,48(5):559-562

[10]王超,王星,季美琴.氣相色譜-質譜法分析化妝品中16種香精香料[J].分析試驗室,2006,25(11):118-122

[11]蔣舉興,夏啟東,段焰青,等.卷煙香精香料中23種加香物質的氣相色譜質譜法檢測[J].食品工業(yè),2013,34(9):221-223

[12]傅若農(nóng).近兩年國內(nèi)氣相色譜的進展[J].分析試驗室,2011,30(5):88-122