氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測定食用香精香料中15種萜烯醇酯

佟亞楠，李寶志，劉文春，李鳳琴，李鋒，孫明

（1.吉林煙草工業(yè)有限責(zé)任公司品質(zhì)控制部，吉林長春130031；2.吉林煙草工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，吉林長春130031）

食用香料和香精通常因其具有天然瓜果等的香和味而被廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代食品工業(yè)，以提高食品品質(zhì)[1]。食用香料和香精是經(jīng)常使用的一大類食品添加劑，目前國家食品工業(yè)可以使用的食品香料、香精有上千種之多。按照標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的用量使用香料和香精一般不會危害人體健康[2]，但過量使用則會帶來嚴(yán)重危害。此外，近年來研究發(fā)現(xiàn)，一些香料中含有黃樟素等有害成分[3-4]，這些有害成分的存在給食品的安全性埋下了隱患。目前食品行業(yè)對產(chǎn)品中所含添加劑進(jìn)行標(biāo)注時(shí)往往僅簡單標(biāo)注“食用香精”，而不標(biāo)注具體成分和含量，這不僅不能客觀地約束生產(chǎn)企業(yè)不規(guī)范使用食用香精、香料，且給質(zhì)量監(jiān)控造成了困擾[5]。

研究表明，萜烯類化合物及其衍生物是香精、香料的重要成分[6-7]，例如香葉醇和橙花醇，是無環(huán)單萜烯醇類化合物，具有溫和而甜的玫瑰花香，留香較長，是玫瑰系香精的主劑，且具有抗菌和驅(qū)蟲等功效，廣泛應(yīng)用于食用香精、日化香精、煙草、藥物等領(lǐng)域[8]。香葉醇、橙花醇是非常有價(jià)值的天然產(chǎn)物，其酯類化合物是相關(guān)香料的重要成分，具有香檸檬、薰衣草樣持久香氣，使人心曠神怡、清新舒暢，是制備高級香精不可缺少的香料，在日化、食品等工業(yè)中具有十分重要的地位[9-11]，被廣泛用于配制食品香精、香水香精、化妝品香精、皂用香精等。除香葉醇和橙花醇外，香料和香精中常見的萜烯類化合物及其衍生物還有異丁酸橙花酯、異丁酸香葉酯、2-甲基丁酸橙花酯、異戊酸橙花酯、2-甲基丁酸香葉酯、異戊酸香葉酯、反-2-己烯酸香葉酯、糠酸橙花酯、糠酸香葉酯、苯甲酸橙花酯、苯甲酸香葉酯、肉桂酸橙花酯、肉桂酸香葉酯、肉豆蔻酸橙花酯、肉豆蔻酸香葉酯等。

隨著食品、日化等領(lǐng)域?qū)葡┐减サ氖褂昧康脑黾?，有必要分析食用香精香料樣品中萜烯醇酯的含量，以確保產(chǎn)品的安全性。但因食用香精香料中的成分比較復(fù)雜，目前國內(nèi)外尚未建立香料香精中萜烯醇酯的檢測標(biāo)準(zhǔn)，也缺乏分析方法和檢測數(shù)據(jù)[12]。因此，建立香料香精中15種常見萜烯醇酯類化合物的檢測方法具有重要理論意義和現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Clarus 600氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國PerkinElmer公司；Milli-Q integral 10超純水儀：美國Millipore公司；AB204-S型電子分析天平：瑞士Mettler Toledo公司；HY-5型回旋式振蕩器：江蘇榮華儀器制造有限公司。

標(biāo)準(zhǔn)品（異丁酸橙花酯、異丁酸香葉酯、2-甲基丁酸橙花酯、異戊酸橙花酯、2-甲基丁酸香葉酯、異戊酸香葉酯、反-2-己烯酸香葉酯、糠酸橙花酯、糠酸香葉酯、苯甲酸橙花酯、苯甲酸香葉酯、肉桂酸橙花酯、肉桂酸香葉酯、肉豆蔻酸橙花酯和肉豆蔻酸香葉酯）：純度≥97%，美國Sigma-Aldrich公司；二氯甲烷、乙醇：色譜純，德國Merck公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

內(nèi)標(biāo)溶液：精密稱取內(nèi)標(biāo)物3-苯丙酸乙酯500.0 mg，用乙醇溶解并定容至100 mL的容量瓶中，得到濃度為5 mg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液。

15種萜烯醇酯混合標(biāo)準(zhǔn)溶液Ⅰ：分別稱取0.1 g（精確至0.1 mg）15種萜烯醇酯標(biāo)準(zhǔn)品，用乙醇溶解并定容至50 mL的容量瓶中，配制濃度為2 mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液Ⅰ，置冰箱于4℃下保存，有效期3個(gè)月。

15種萜烯醇酯混合標(biāo)準(zhǔn)溶液Ⅱ：準(zhǔn)確移取10 mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液Ⅰ，置于100 mL容量瓶中，以乙醇稀釋并定容至刻度，配制濃度為200 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液Ⅱ，置冰箱于4℃下保存，有效期3個(gè)月。

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制：準(zhǔn)確移取 0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液Ⅱ，置于10 mL容量瓶中，加入50 μL內(nèi)標(biāo)溶液，用乙醇稀釋并定容至刻度，制得標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，其濃度分別為：2、4、10、20、40 μg/mL。

1.3 樣品處理

準(zhǔn)確稱取0.3 g（精確至0.1 mg）食用香精、香料樣品于50 mL具塞三角瓶中，分別加入50 μL內(nèi)標(biāo)溶液和10 mL乙醇，用漩渦混合器混合均勻，再用超聲萃取30 min，加入適量無水硫酸鈉充分脫水，靜置，取上層清液，經(jīng)0.22 μm尼龍膜過濾后，得到待測樣品溶液，其中內(nèi)標(biāo)物在提取液中的濃度為25 μg/mL。

1.4 氣相色譜-質(zhì)譜儀器分析條件

設(shè)定GC-MS分析條件，分別對標(biāo)準(zhǔn)工作溶液、樣品溶液和空白溶液進(jìn)行檢測分析，具體分析條件為色譜柱：Elite-35MS毛細(xì)管色譜柱，固定相：35%苯基/65%甲基聚硅氧烷，規(guī)格：60 m×0.25 mm×0.25 μm；進(jìn)樣口溫度：280℃；進(jìn)樣量：0.5 μL，不分流進(jìn)樣；載氣：氦氣（純度≥99.999%），恒流模式，流速：1.0 mL/min；升溫程序：初始溫度60℃，以 5℃/min升溫至260℃，保持10 min。質(zhì)譜分析條件：電離方式：電子轟擊源（EI）；電離能量：70 eV；傳輸線溫度：260 ℃；離子源溫度：200℃；溶劑延遲：8 min，選擇離子掃描模式（SIM）分段掃描，以特征離子進(jìn)行定量分析；15種萜烯醇酯定量和定性選擇離子見表1。

表1 15種萜烯醇酯類化合物定量和定性選擇離子Table 1 Retention times，quantitative ions and qualitative ions of the fifteen terpene carboxylates

續(xù)表1 15種萜烯醇酯類化合物定量和定性選擇離子Continue table 1 Retention times，quantitative ions and qualitative ions of the fifteen terpene carboxylates

2 結(jié)果與討論

2.1 氣相色譜條件的優(yōu)化

色譜柱的填料、規(guī)格很大程度上影響檢測的效果。增加柱長可使理論塔板數(shù)增大，但同時(shí)使峰寬加大，分析時(shí)間延長。因此，填充柱的柱長要選擇適當(dāng)。一般情況下，柱長選擇以使組分能完全分離，分離度達(dá)到所期望的值為準(zhǔn)。比較了Elite-35MS、Elite-17MS和HP-INNOWAX色譜柱對香精、香料中萜烯醇酯類化合物的分離效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以色譜柱Elite-35MS檢測標(biāo)準(zhǔn)工作溶液效果最好，其填料為35%苯基/65%甲基聚硅氧烷，中等極性色譜柱，規(guī)格：60 m×0.25 mm×0.25 μm。色譜圖如圖1所示。結(jié)果顯示，以該方法檢測標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，萜烯醇酯類化合物峰形和分離效果較好。

圖1 Elite-35MS檢測15種萜烯醇酯類化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流圖Fig.1 Elite-35MS/TIC of the fifteen terpene carboxylates mixed standard solution

以色譜柱Elite-17MS檢測標(biāo)準(zhǔn)工作溶液效果，Elite-17MS色譜柱的填料為50%苯基/50%甲基聚硅氧烷，中等極性色譜柱，規(guī)格：30 m×0.25 mm×0.25 μm。色譜圖如圖2所示。結(jié)果顯示，以該方法檢測標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，萜烯醇酯類化合物不能很好的分離，出現(xiàn)目標(biāo)化合物峰的重疊。

圖2 Elite-17MS檢測15種萜烯醇酯類化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流圖Fig.2 Elite-17MS/TIC of the fifteen terpene carboxylates mixed standard solution

以色譜柱HP-INNOWAX檢測標(biāo)準(zhǔn)工作溶液效果，HP-INNOWAX色譜柱的填料：鍵合/交聯(lián)聚乙醇，強(qiáng)極性柱，規(guī)格：30 m×0.25 mm×0.25 μm。色譜圖如圖3所示。結(jié)果顯示，以該方法檢測標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，萜烯醇酯類化合物不能很好的分離，出現(xiàn)目標(biāo)化合物峰的重疊，并且，基線出現(xiàn)飄移。

圖3 HP-INNOWAX檢測15種萜烯醇酯類化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流圖Fig.3 HP-INNOWAX/TIC of the fifteen terpene carboxylates mixed standard solution

結(jié)果表明，Elite-35MS毛細(xì)管色譜柱的峰型和分離效果最好。且本方法試驗(yàn)表明，色譜柱的長度影響樣品的分離度，柱子越長分離度越高，信噪比越高。

2.2 方法的線性方程及檢出限

標(biāo)準(zhǔn)工作曲線繪制及結(jié)果計(jì)算：分別取標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行分析，以標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中15種萜烯醇酯類化合物和3-苯丙酸乙酯的色譜峰面積比對其相應(yīng)濃度比進(jìn)行回歸分析，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線；取最低濃度工作標(biāo)準(zhǔn)溶液，做10次平行試驗(yàn)，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差，3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差為檢出限，10倍標(biāo)準(zhǔn)偏差為定量限，結(jié)果如表2所示。

表2 15種萜烯醇酯類化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、檢測限和定量限Table 2 Regression equations，correlation coefficients，limits of detection（LODs）and limits of quantification（LOQs）of the fifteen terpene carboxylates

2.3 方法的精密度和加標(biāo)回收率進(jìn)行檢測

方法的準(zhǔn)確度、精密度分別用回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差衡量。對同一樣品在相同條件下，取樣6次，并根據(jù)測定結(jié)果的平均值計(jì)算15種萜烯醇酯類化合物的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD%）；對食用香精、香料樣品中，分別添加低、中、高3種水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液，標(biāo)準(zhǔn)加入量分別為10、100、500 mg/kg進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗(yàn)，計(jì)算含量的方法為：將相同條件下測得的樣品溶液中15種萜烯醇酯類化合物和3-苯丙酸乙酯的色譜峰面積比，代入所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得樣品中萜烯醇酯類化合物的含量，結(jié)果詳見表3。

從表3可知，15種萜烯醇酯的平均加標(biāo)回收率在83.4%～113.8%范圍內(nèi)，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在2.31%～4.11%之間，表明本方法準(zhǔn)確性高，重復(fù)性好，適合定量分析。

表3 15種萜烯醇酯類化合物的回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 3 Recoveries and relative standard deviations（RSD）of the fifteen terpene carboxylates

2.4 實(shí)際樣品的測定及與標(biāo)準(zhǔn)方法的比較

應(yīng)用所建立的方法，選取5個(gè)食用香精香料樣品（樣品類型包括表香、精油和浸膏等），測定樣品中萜烯醇酯類化合物的含量。不同食用香精香料中萜烯醇酯類化合物的含量見表4。

表4 不同食用香精香料中萜烯醇酯類化合物的含量Table 4 Contents of the fifteen terpene carboxylates in flavor samples mg/kg

結(jié)果說明，本試驗(yàn)提供的方法能夠快速，準(zhǔn)確對食用香精香料中萜烯醇酯類化合物進(jìn)行定量、定性分析。

3 結(jié)論

本文提供一種萜烯醇酯類化合物的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測方法，比較了Elite-35MS、Elite-17MS和HP-INNOWAX色譜柱，選擇了峰形和分離效果最好的Elite-35MS柱為分離柱，所采用的色譜條件使15種目標(biāo)化合物及內(nèi)標(biāo)色譜峰都分離度較好，并且均具有較好的線性相關(guān)性，檢出限在1.95 mg/kg～4.01 mg/kg之間，平均加標(biāo)回收率在83.4%～113.8%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于5.0%。本方法的回收率高，重復(fù)性好，適合于食用香精香料中萜烯醇酯的定性確認(rèn)、定量分析。

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