四環(huán)素膠體金免疫檢測(cè)技術(shù)的研究

栗慧，金艷丹，張巖蔚，魏東，*

（1.河北省農(nóng)產(chǎn)品安全檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北張家口075000；2.河北北方學(xué)院食品安全研究中心，河北張家口075000）

四環(huán)素（tetracycline，TC）是廣譜抗菌藥，由放線菌產(chǎn)生，具有殺菌作用，廣泛應(yīng)用于畜禽類(lèi)動(dòng)物細(xì)菌病的治療，或用作畜禽類(lèi)動(dòng)物的生長(zhǎng)促進(jìn)劑[1]，其作用機(jī)制在于藥物能特異性地與細(xì)菌核糖體30S亞基的A位置結(jié)合，阻止氨基酰－tRNA在該位上的聯(lián)結(jié)，從而抑制肽鏈的增長(zhǎng)和影響細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成[2]。但研究發(fā)現(xiàn)，如果用藥量過(guò)多會(huì)造成動(dòng)物源性食品中TC殘留，能夠引起食用者毒性反應(yīng)主要是表現(xiàn)在對(duì)胃、腸、肝臟的損害，以及牙齒的染色，還會(huì)造成過(guò)敏反應(yīng)、二重感染、致畸胎作用[3-4]。因此，我國(guó)農(nóng)業(yè)部于2002年12月24日規(guī)定了四環(huán)素在各種動(dòng)源性食品中的使用限量。牛/羊奶中四環(huán)素類(lèi)抗生素的總量不得超過(guò)100 ng/kg，所有食品動(dòng)物的腎臟、肝臟及肌肉中分別不得超過(guò)600、300 ng/kg及100 ng/kg，禽蛋中不得超過(guò)200 ng/kg，魚(yú)/蝦的肉中不得超過(guò)100 ng/kg[5]。由于利益的驅(qū)動(dòng)，部分養(yǎng)殖企業(yè)仍發(fā)生畜禽類(lèi)動(dòng)物體內(nèi)TC含量超標(biāo)事件，從而造成對(duì)消費(fèi)者的傷害。為了減少動(dòng)物源性食品中TC殘留對(duì)人體的傷害，必須要采用相應(yīng)的檢測(cè)措施。目前的檢測(cè)方法主要是液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）、高效液相色譜（HPLC）以及毛細(xì)管電泳法（CE）等，但這些方法操作繁瑣、專(zhuān)業(yè)性強(qiáng)、儀器價(jià)格昂貴、不能普及[6-11]。因此，迫切需要建立一種精確、高效、經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)手段。

膠體金試紙條是近年興起的一種快速檢測(cè)新技術(shù)，是在酶聯(lián)免疫技術(shù)和層析技術(shù)相結(jié)合的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種固相標(biāo)記免疫測(cè)定新技術(shù)，具有小而便攜、不需儀器設(shè)備輔助、操作非常簡(jiǎn)單、用肉眼即能判斷結(jié)果等諸多優(yōu)點(diǎn)，非常適用于食品的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)[12-15]，已在臨床診斷中得到了廣泛應(yīng)用，目前已開(kāi)始應(yīng)用于小分子物質(zhì)的檢測(cè)，如毒素、藥物殘留、環(huán)境監(jiān)測(cè)等非臨床檢測(cè)領(lǐng)域。

納米級(jí)膠體金顆粒的制備及抗體的標(biāo)記是膠體金免疫層析技術(shù)的關(guān)鍵，直接關(guān)系到建立的檢測(cè)方法的性能優(yōu)劣[16]。本試驗(yàn)采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金；TC多克隆抗體與已制備好的膠體金溶液進(jìn)行標(biāo)記。為以后裝配TC膠體金試紙條奠定了基礎(chǔ)，為T(mén)C在食品樣品中的快速檢測(cè)方法的建立提供理論參考。

1 材料

1.1 主要藥品及試劑

氯金酸：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氯化鈉、碳酸鉀：天津市永大化學(xué)試劑有限公司；檸檬酸三鈉：阿拉丁化學(xué)品有限公司；HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；四環(huán)素多克隆抗體：河北北方學(xué)院實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 主要儀器

電子天平：北京賽多利斯儀器系列有限公司；恒溫磁力攪拌器（JB-2型）：上海雷磁新經(jīng)儀器有限公司；紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（Lambda365）：鉑金埃爾默儀器有限公司；超聲波清洗器（KQ-500B型）：昆山市超聲儀器有限公司；干燥箱（FX101-3）：上海樹(shù)立儀器儀表有限公司；超純水機(jī)（Milli-Q Reference）：美國(guó)熱電公司。

2 方法

2.1 膠體金制備前處理

試驗(yàn)所需所有玻璃器具均用超聲波清洗器進(jìn)行清洗30 min，用蒸餾水、超純水依次沖洗，烘干；將所有器具放入酸缸中浸泡過(guò)夜，取出后用自來(lái)水沖洗干凈，再用蒸餾水、超純水依次浸泡沖洗，烘干備用。

2.2 膠體金制備

采用檸檬酸三鈉還原法：

1）將裝有100 mL 0.01%氯金酸溶液的錐形瓶放在磁力攪拌器上邊攪拌邊加熱，直至沸騰。

2）沸騰后迅速加入1.8 mL 1%檸檬酸三鈉，顏色發(fā)生變化后繼續(xù)加熱15 min。

3）加熱完成后，待溶液冷卻至室溫，將體積恢復(fù)至原體積。

2.3 膠體金的鑒定

1）用肉眼觀察：通過(guò)肉眼觀察膠體金溶液的顏色、狀態(tài)，進(jìn)行初步的鑒定。

2）可見(jiàn)光光譜法：使用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)對(duì)膠體金在400 nm～700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，得到膠體金的可見(jiàn)光吸收光譜，對(duì)膠體金的質(zhì)量進(jìn)一步的鑒定。

2.4 膠體金標(biāo)記抗體

1）將裝有1 mL膠體金溶液的離心管中加入一定量的0.25 mol/L K2CO3調(diào)節(jié)pH值，獲得溶液A。

2）將四環(huán)素多克隆抗體稀釋?zhuān)尤氲饺芤篈中，攪拌反應(yīng)30 min，獲得溶液B。

3）向溶液 B 中加入 100 μL 10%NaCl，攪拌反應(yīng)30 min。

2.5 標(biāo)記最適pH值的確定

將裝有1mL膠體金溶液的離心管中加入0.25mol/L K2CO3調(diào)節(jié) pH 值分別為 5、6、7、8、9、10，其他條件均相同。加入稀釋的四環(huán)素抗體，攪拌反應(yīng)30 min，再加入100 μL 10%NaCl，攪拌反應(yīng)30 min。根據(jù)金標(biāo)抗體顏色變化及OD值選擇最適pH值。

2.6 標(biāo)記最佳蛋白量的確定

將裝有1mL膠體金溶液的離心管中加入0.25mol/L K2CO3調(diào)節(jié)pH值。加入稀釋四環(huán)素抗體的5 000倍、6 000倍、7 000倍、8 000倍、9 000倍、10 000倍，攪拌反應(yīng)30 min，其他條件均相同。再加入100 μL 10%NaCl，攪拌反應(yīng)30 min。根據(jù)金標(biāo)抗體顏色變化選擇最佳蛋白加入量。

2.7 膠體金標(biāo)記抗體（金標(biāo)抗體）活性鑒定

將羊抗鼠二抗用PBS稀釋50倍后，與制備好的金標(biāo)抗體共同點(diǎn)樣于硝酸纖維素膜（NC膜）上，觀察顯色結(jié)果，鑒定金標(biāo)抗體是否標(biāo)記成功。

使用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)對(duì)膠體金在400 nm～700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，得到金標(biāo)抗體的可見(jiàn)光吸收光譜，對(duì)金標(biāo)抗體活性進(jìn)一步鑒定。

3 結(jié)果與分析

3.1 膠體金的質(zhì)量鑒定

膠體金的質(zhì)量鑒定結(jié)果如圖1。

圖1 膠體金樣品Fig.1 Colloidal gold

通過(guò)肉眼觀察，制備的膠體金溶液，顏色呈現(xiàn)紫紅色、透亮、無(wú)雜質(zhì)，狀態(tài)穩(wěn)定。

用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)對(duì)制備的膠體金溶液進(jìn)行掃描，在波長(zhǎng)范圍是400 nm～700 nm內(nèi)，得到如圖2所示的吸收光譜圖。

圖2 膠體金可見(jiàn)光光譜圖Fig.2 The visible spectra of colloidal gold

由圖2可知，最大吸收峰為524 nm，OD值為1.010 2，峰寬較小，波形平滑，證明制備的膠體金顆粒大小均，分布均勻。

3.2 標(biāo)記最適pH值的確定

膠體金對(duì)蛋白的吸附主要因素在于pH值，圖3中所示為不同pH值對(duì)標(biāo)記結(jié)果的影響，從左至右pH值依次增大。

圖3 不同pH值對(duì)金標(biāo)抗體的影響Fig.3 The impact of prestige antibody at different pH

1號(hào)管為膠體金溶液，經(jīng)pH試紙條測(cè)試為酸性，pH在5左右，向其直接加入抗體后，顏色變?yōu)榻咏咨?號(hào)管為膠體金溶液及4 μL K2CO3，經(jīng)pH試紙條測(cè)試為酸性，pH在6左右，向其直接加入抗體后，顏色變?yōu)榈凵?號(hào)管為膠體金溶液及8 μL K2CO3，經(jīng)pH試紙條測(cè)試為中性，pH在7左右，向其直接加入抗體后，顏色不發(fā)生變化；4號(hào)管為膠體金溶液及12 μL K2CO3，經(jīng)pH試紙條測(cè)試為堿性，pH在8左右，向其直接加入抗體后，顏色不發(fā)生變化；5號(hào)管為膠體金溶液及16 μL K2CO3，經(jīng)pH試紙條測(cè)試為堿性，pH在9左右，向其直接加入抗體后，顏色略發(fā)生變化；6號(hào)管為膠體金溶液及20 μL K2CO3，經(jīng)pH試紙條測(cè)試為堿性，pH在10左右，向其直接加入抗體后，顏色進(jìn)一步加深。通過(guò)觀察顏色的變化，可知1、2、5、6號(hào)管的pH值不適合膠體金標(biāo)記抗體蛋白，3、4號(hào)管的pH值適合膠體金標(biāo)記抗體蛋白。

根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)一步確定最佳pH值需要K2CO3的用量，設(shè)計(jì)7組試驗(yàn)，每毫升膠體金溶液中添加 K2CO3用量分別是：0、5、8、9、10、11、12 μL。根據(jù)上述用量標(biāo)記蛋白的OD值如圖4所示。

圖4 最佳標(biāo)記pH值選擇Fig.4 Best mark pH value selection

由圖4可知，隨著K2CO3添加量的增加，金標(biāo)抗體的OD值也隨之增加，當(dāng)K2CO3的添加量達(dá)到9 μL之后，曲線趨于平緩。本試驗(yàn)選擇每毫升金標(biāo)溶液中添加 0.25 mol/L K2CO39 μL。

3.3 標(biāo)記最佳蛋白量的確定

標(biāo)記最佳蛋白量的選擇的結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 標(biāo)記最佳蛋白量的選擇Fig.5 Selection of labeled optimum protein

如圖5所示試驗(yàn)結(jié)果，從左到右稀釋倍數(shù)依次增加，表明抗體含量依次減少，管中的液體顏色也發(fā)生不同程度的變化，4、5、6號(hào)管中液體顏色依次加深，2、3號(hào)管中液體顏色沒(méi)有變化，1號(hào)管中明顯抗體量過(guò)剩?；谠陬伾蛔儠r(shí)所用抗體含量的基礎(chǔ)上增加20%即為穩(wěn)定1 mL膠體金實(shí)際所需要的抗體量，本試驗(yàn)選擇將抗體稀釋6 000倍。

3.4 金標(biāo)抗體活性鑒定

金標(biāo)抗體活性鑒定結(jié)果如圖6。

圖6 金標(biāo)抗體活性的確定Fig.6 To determine the gold labeled antibody activity

羊抗鼠二抗與金標(biāo)抗體作用后，NC膜上有明顯的紅色斑點(diǎn)，表明四環(huán)素多克隆抗體與膠體金成功標(biāo)記。

金標(biāo)抗體可見(jiàn)光光譜圖見(jiàn)圖7。

圖7 金標(biāo)抗體可見(jiàn)光光譜圖Fig.7 Gold labeled antibody visible light spectrogram

由圖7可知，膠體金最大吸收峰所在波長(zhǎng)為524nm，OD值為1.010 2。金標(biāo)抗體最大吸收峰所在波長(zhǎng)為528 nm，OD值為1.024 1。膠體金標(biāo)記抗體的過(guò)程中最大吸收峰所在波長(zhǎng)發(fā)生了偏移，說(shuō)明其中物質(zhì)的分子組成及空間構(gòu)型發(fā)生了變化。由此表明膠體金標(biāo)記抗體成功。

4 結(jié)論

膠體金的制備方法有檸檬酸三鈉還原法、抗壞血酸還原法、硼氫化鈉還原法、檸檬酸三鈉-鞣酸法等[17-19]。本試驗(yàn)采用的制備方法是檸檬酸三鈉還原法，通過(guò)肉眼觀察及可見(jiàn)光光譜掃描法可知制備出的膠體金溶液顏色呈現(xiàn)紫紅色，狀態(tài)穩(wěn)定，峰寬較小，波形平滑。由此表明膠體金制備成功，根據(jù)Li J S等[20]研究表明膠體金粒徑在10 nm～70 nm最大吸收峰與粒徑之間存在線性關(guān)系：Y=0.427 1X+514.56，式中：Y為最大吸收峰；X為膠體金粒徑。由該公式可得膠體金粒徑為22.1 nm，屬于比較合適與抗體蛋白標(biāo)記的粒徑。

膠體金溶液標(biāo)記四環(huán)素抗體通過(guò)與羊抗鼠二抗反應(yīng)和可見(jiàn)光光譜掃描法表明標(biāo)記成功，優(yōu)化標(biāo)記條件，選用最佳標(biāo)記pH值為7.5左右，即需要添加9 μL 0.25 mol/L K2CO3調(diào)節(jié)pH值；最佳蛋白添加量為抗體稀釋6 000倍。膠體金的制備與標(biāo)記成功為四環(huán)素膠體金試紙條的研制奠定了基礎(chǔ)。

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