蒲公英提取物中總酚酸含量測(cè)定方法的優(yōu)化

張艷，余正勇，耿福能，吳桃清，楊亮，肖懷，3，趙昱，3，劉衡，3，*

（1.云南省昆蟲(chóng)生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南大理671000；2.藥用特種昆蟲(chóng)開(kāi)發(fā)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，云南大理671000；3.中國(guó)西南藥用昆蟲(chóng)及蛛形類(lèi)資源開(kāi)發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心，云南大理671000；4.四川好醫(yī)生藥業(yè)集團(tuán)，四川成都610000）

蒲公英又名婆婆丁、黃花地丁等，為菊科植物蒲公英Taraxacum mongolicum Hand.-Mazz.、堿地蒲公英Taraxacum borealisinense Kitag.或同屬數(shù)種植物的干燥全草[1]，其性味苦、甘、寒，歸肝、胃經(jīng)，具有清熱解毒、消腫散結(jié)、利尿通淋的功效，常用于治療疔瘡腫毒、乳癰、腸癰和熱淋澀痛等癥[1]，具有較高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、藥用保健作用效果明顯和綠色無(wú)公害的特點(diǎn)[2]，國(guó)內(nèi)外已開(kāi)發(fā)出了一系列的藥品、保健品和化妝品[3]。蒲公英作為一種食藥兩用的植物，營(yíng)養(yǎng)成分豐富，主要有黃酮類(lèi)、酚酸類(lèi)、三萜類(lèi)、多糖類(lèi)等[4-6]，其中VC和VB2的含量均高于日常食用的蔬菜，礦質(zhì)元素的含量也較高[7]，還含有抗腫瘤活性元素——硒[8]。研究表明，蒲公英中的酚酸類(lèi)物質(zhì)具有抗病毒、抗炎、抗菌、提高免疫力、抗氧化、清除自由基的作用[9]。因此測(cè)定蒲公英中總酚酸含量對(duì)其質(zhì)量品質(zhì)的評(píng)價(jià)以及進(jìn)行深入研究藥物作用機(jī)理有重要意義。本試驗(yàn)采用三氯化鐵-鐵氰化鉀比色法（普魯士藍(lán)比色法）[10-12]，以咖啡酸為對(duì)照品測(cè)定蒲公英提取物中總酚酸的含量，并對(duì)該法顯色條件進(jìn)行優(yōu)化，為蒲公英營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值的進(jìn)一步加工利用提供依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 儀器

BSA124S分析天平：賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；UV-6000PC紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司；AKSW-V-16艾柯實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī)：成都艾柯水處理設(shè)備有限公司；ZLG-5中藥浸膏噴霧干燥機(jī)：常州一步干燥設(shè)備有限公司；酒精計(jì)：武強(qiáng)縣滏陽(yáng)儀表廠。

1.2 試劑

咖啡酸標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：110885-200102）：中國(guó)食品藥品檢定研究院；三氯化鐵（批號(hào)：20140705）、鐵氰化鉀（批號(hào)：20140602）：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司，AR；十二烷基硫酸鈉（批號(hào)：201406）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司，AR；鹽酸（批號(hào)：20120629）：汕滇藥業(yè)有限公司，AR；95%乙醇（批號(hào)：20160818）：天津市福成化學(xué)試劑廠，AR。

1.3 材料

蒲公英：云南大理市金貝中藥材市場(chǎng)，大理大學(xué)昆蟲(chóng)生物醫(yī)藥研究院何苗老師鑒定為藥用蒲公英Taraxacum mongolicum Hand.-Mazz.。

2 方法

2.1 蒲公英提取物制備工藝流程

取干燥、粉碎的蒲公英適量，加10倍量的水，微沸提取2 h，提取2次，過(guò)濾，合并濾液，濃縮至比重為1.08～1.10時(shí)攪拌并緩慢加入90%的乙醇，使溶液含醇量達(dá)到60%，持續(xù)緩慢攪拌1 h，4℃靜置24 h，過(guò)濾，濾液濃縮至比重為1.08～1.10時(shí)噴霧干燥，即得蒲公英提取物。連續(xù)制備三批蒲公英提取物，批號(hào)：170110、170111、170112。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備

精密稱取蒲公英提取物4.0 mg置10 mL量瓶中，加入70%的乙醇超聲溶解，定容，即得供試品溶液。

2.2.2 咖啡酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

精密稱取105℃干燥至恒重的咖啡酸標(biāo)準(zhǔn)品5.0 mg，置50 mL棕色量瓶中，加入70%乙醇溶解，定容，即得100 μg/mL的咖啡酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.3 測(cè)定波長(zhǎng)的確定

精密量取標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液各1.0 mL于25 mL棕色量瓶中，加70%乙醇至5.0 mL，分別加入0.3%SDS溶液2.0 mL，0.6%三氯化鐵與0.9%鐵氰化鉀（體積比為1∶1）混合溶液2.0 mL，暗處放置5 min，加0.1 mol/L的鹽酸溶液至刻度，暗處放置20 min，以70%乙醇溶液代替咖啡酸為空白對(duì)照，于400 nm～800 nm波長(zhǎng)下掃描，并記錄結(jié)果，見(jiàn)圖1。由此可知，最大吸收波長(zhǎng)為764 nm。

圖1 咖啡酸及供試品光譜圖Fig.1 Absorption spectrum of caffeic acid and sample

2.4 咖啡酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密量取標(biāo)準(zhǔn)品溶液 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于25 mL棕色量瓶中，補(bǔ)加70%乙醇至5.0 mL，分別加入0.3%SDS溶液2.0 mL，0.6%三氯化鐵與0.9%鐵氰化鉀（體積比為1∶1）混合溶液2.0 mL，暗處放置5 min，加0.1 mol/L的鹽酸溶液至刻度，暗處放置20 min，以不含咖啡酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液的空白溶劑為對(duì)照，于764 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值。以咖啡酸濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸分析。

2.5 供試品分析

精密量取供試品溶液1.0 mL于25 mL棕色量瓶中，加70%乙醇至5.0 mL，照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備項(xiàng)下的方法，自精密加入0.3%SDS溶液2.0 mL起，依法測(cè)定吸光度值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中含咖啡酸的濃度，計(jì)算，即得。

3 結(jié)果與分析

3.1 顯色時(shí)間的影響

供試品分析中，其他操作不變，定容后，在764 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值，每隔10分鐘測(cè)定一次，至80min，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖2。供試品溶液在顯色20 min后，吸光度值趨于穩(wěn)定，故確定顯色時(shí)間為20 min。

圖2 顯色時(shí)間的影響Fig.2 Effect of coloration time

3.2 顯色劑用量的影響

供試品分析中，改變0.9%鐵氰化鉀與0.6%三氯化鐵（體積比為1∶1）混合溶液加入量分別為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，其余試劑加入量不變，同法測(cè)定吸光度值，平行測(cè)定3份，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 顯色劑用量的影響Fig.3 Effect of the dosage of chromogenic agent

由圖3可知，顯色劑加入量對(duì)吸光度影響較大，隨著顯色劑用量的增加，吸光度值先增加后趨于穩(wěn)定，當(dāng)顯色劑用量大于2.0 mL時(shí)，吸光度值基本無(wú)變化，所以最佳顯色劑用量確定為2.0 mL。

3.3 鹽酸濃度考察

供試品分析中，改變鹽酸濃度分別為0.01、0.05、0.1、0.2 mol/L，其他操作不變，測(cè)定吸光度值，平行測(cè)定3份，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖4。

由圖4可知，供試品溶液在加入鹽酸濃度為0.1mol/L時(shí)，吸光度值最大，故鹽酸濃度確定為0.1 mol/L。

3.4 SDS用量的影響

供試品分析中，改變0.3%SDS溶液溶液加入量為 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，其他操作不變，測(cè)定吸光度值，平行測(cè)定3份，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖4 鹽酸濃度的影響Fig.4 Effect of he concentration of hydrochloric acid

圖5 SDS用量的影響Fig.5 Effect of the dosage of Sodium dodecyl sulfate（SDS）

由圖5可知，供試品溶液在加入SDS的量為2.0mL時(shí)，吸光度值較大，且穩(wěn)定性較好，故確定SDS的用量為2.0 mL。

綜上所述：顯色劑用量為2.0 mL，鹽酸的濃度為0.1 mol/L，SDS溶液用量為2.0 mL，顯色時(shí)間為20 min，為蒲公英提取物中總酚酸含量測(cè)定的最佳顯色條件。

3.5 方法學(xué)考察

3.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

根據(jù)“2.4”項(xiàng)下的方法，以咖啡酸濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性方程為Y=0.191 2X+0.088 9，r=0.999 2，結(jié)果表明咖啡酸在2.0 μg/mL～20.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖6。

圖6 咖啡酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Standard curve of Caffeic acid

3.5.2 精密度試驗(yàn)

精密量取供試品溶液1.0 mL，按“2.4”項(xiàng)下顯色條件顯色，連續(xù)測(cè)定6次，并記錄吸光度。結(jié)果的RSD為0.03%，表明儀器精密度良好。

3.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密量取供試品溶液1.0 mL，按“2.4”項(xiàng)下顯色條件顯色，2 h內(nèi)每隔5分鐘測(cè)定1次，并記錄吸光度。結(jié)果顯色60 min內(nèi)的RSD為1.90%，表明供試品吸光度在60 min內(nèi)基本穩(wěn)定。

3.5.4 重復(fù)性試驗(yàn)

精密量取供試品溶液1.0 mL，照“2.4”項(xiàng)下顯色條件顯色并測(cè)定，平行6份，記錄吸光度。結(jié)果的RSD為1.84%，表明方法重復(fù)性良好。

3.5.5 加樣回收試驗(yàn)

精密稱定6份已知含量的蒲公英提取物4.0 mg于10 mL量瓶，精密加入“2.2”項(xiàng)下咖啡酸標(biāo)準(zhǔn)品5.0 mL，加入70%乙醇定容，精密量取1.0 mL，按“2.4”項(xiàng)下顯色條件顯色并測(cè)定，記錄吸光度，見(jiàn)表1，計(jì)算總酚酸的回收率。結(jié)果平均加樣回收率為98.86%，RSD為0.84%，說(shuō)明該方法準(zhǔn)確性好。

表1 加樣回收率試驗(yàn)Table 1 Recovery of added samples test

3.6 樣品檢測(cè)與分析

分別取不同批號(hào)的蒲公英提取物6份，照“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別取供試品溶液1.0 mL于25 mL量瓶中，自加70%乙醇至5.0 mL起，按“2.4”項(xiàng)下顯色條件顯色，以70%乙醇溶液代替供試品為空白，于764 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，見(jiàn)表2。由此可見(jiàn)，蒲公英提取物中總酚酸平均含量為120.5 mg/g。

表2 蒲公英提取物中總酚酸含量測(cè)定結(jié)果（n=6）Table 2 Contentdetermination of total phenolic acids in extract of Taraxacum mongolicum（n=6）

4 討論

植物總酚酸定量測(cè)定的方法較多，普遍使用的有普魯士藍(lán)法、Folin-酚法、亞硝酸鈉—硝酸鋁配位顯色法、紫外分光光度法等，而普魯士藍(lán)法與其他幾種方法相比靈敏度高，且采用該法溶液體系均一、線性良好[13]。采用該法測(cè)定總酚酸含量時(shí)，顯色條件對(duì)吸光度有較大影響，且溫度和外源光也有一定的影響，因此顯色條件需嚴(yán)格控制，并避光保存，定時(shí)測(cè)量才能保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。

供試品溶解時(shí)，采用甲醇溶液、50%甲醇溶液和95%乙醇溶液都不能完全溶解，有少許沉淀，而70%乙醇溶液基本能使供試品完全溶解，且使用70%乙醇溶液作溶劑時(shí)反應(yīng)更加靈敏，穩(wěn)定性也相對(duì)較好[11]，因此溶劑選用70%乙醇；本試驗(yàn)還對(duì)加入酸的種類(lèi)進(jìn)行了考察，分別考察了0.1 mol/L鹽酸和0.1 mol/L醋酸，結(jié)果表明加入鹽酸穩(wěn)定性較醋酸好。

蒲公英中含有多種酚酸，其中包括咖啡酸[14]，故本試驗(yàn)以咖啡酸為對(duì)照品建立了蒲公英總酚酸的含量測(cè)定方法。該方法操作簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確度及精密度高，重復(fù)性和穩(wěn)定性好，儀器普及率高，易于推廣等優(yōu)點(diǎn)，可用于蒲公英提取物及制劑中總酚酸定量分析及質(zhì)量控制，同時(shí)對(duì)某些藥材的總酚酸分析及質(zhì)量控制有一定的參考價(jià)值。

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