黑米中黃酮類化合物的穩(wěn)定性分析

王磊，劉長(zhǎng)姣，吳婕

（吉林工商學(xué)院糧食學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130507）

黑米又稱紫米、烏米，在中國(guó)和東亞地區(qū)被譽(yù)為“補(bǔ)血米”、“長(zhǎng)壽米”等[1]。黑米營(yíng)養(yǎng)豐富，蛋白質(zhì)平均含量為13%左右，比普通白米高46%～66%；氨基酸組成齊全，含有17種人體必需的氨基酸，組成比例優(yōu)于白米且氨基酸組成模式接近人體模式[2]。此外，黑米中富含鐵、鋅、銅、錳等微量元素及VB1、VB2等B族維生素，還含有花色苷、黃酮、生物堿、甾醇等一些對(duì)人體健康有益的生物活性物質(zhì)[3-4]，屬于綠色保健食品，極具開發(fā)價(jià)值。黑米中含有黃酮類物質(zhì)，黃酮類化合物是一類重要的具有多樣生物活性的含氧雜環(huán)天然有機(jī)化合物，廣泛存在于植物中[5]。黃酮不僅具有抗菌、消炎鎮(zhèn)痛、降血壓、降血脂、清熱解毒等作用，在抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、抑制脂肪酶等方面也有顯著效果，是目前功能性食品和醫(yī)藥品競(jìng)相開發(fā)的重點(diǎn)領(lǐng)域[6]。本文以超聲波輔助水浴浸提黑米中黃酮類化合物，考察溫度、pH值、光照、氧化劑、還原劑和金屬離子等對(duì)黑米黃酮穩(wěn)定性的影響，為生產(chǎn)中有效利用黑米總黃酮、提高黑米的附加值提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑米：產(chǎn)自黑龍江省五?？h；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇、硝酸鋁、氫氧化鈉、亞硝酸鈉等試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

722可見分光光度計(jì)：上海佑科儀器儀表有限公司；SC-3610高速離心機(jī)：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；FA2004W電子天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；KQ-500E型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；GZX-9070MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 方法

1.3.1 黑米黃酮的提取工藝流程

黑米（烘干后）→粉碎過60目篩→取樣→加一定濃度的乙醇→超聲波輔助水浴浸提（液料比60 mL/g、乙醇濃度45%、超聲時(shí)間45 min、提取溫度50℃）→抽濾→離心（3 500 r/min，10 min）→上清液定容→510nm處測(cè)吸光度。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法見參考文獻(xiàn)[7]。

1.3.3 黃酮類化合物含量的測(cè)定

采用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法[8]測(cè)定提取液中黃酮類化合物含量。

1.3.4 黑米中黃酮類化合物穩(wěn)定性研究

1.3.4.1 溫度對(duì)黃酮類化合物穩(wěn)定性的影響

取5支潔凈試管，各加入10 mL黃酮提取液，將提取液分別在20、40、60、80、90 ℃下水浴鍋內(nèi)恒溫60 min，然后取出冷卻至室溫，在波長(zhǎng)510 nm下測(cè)吸光度。

1.3.4.2 pH值對(duì)黃酮類化合物穩(wěn)定性的影響

取8支潔凈試管，各加入10 mL黃酮提取液，用HCl、NaOH 調(diào)節(jié)黃酮提取液的 pH 值至 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，在室溫避光條件下放置 6 h，然后在波長(zhǎng)510 nm下測(cè)吸光度。

1.3.4.3 光照對(duì)黃酮類化合物穩(wěn)定性的影響

取5支潔凈試管，各加入10 mL黃酮提取液，密閉在自然光照射下放置，用黑暗避光的樣品做對(duì)照，于1、2、3、4、5 d 時(shí)定時(shí)取樣，在波長(zhǎng) 510 nm 下測(cè)吸光度。

1.3.4.4 H2O2對(duì)黃酮類化合物穩(wěn)定性的影響

H2O2在食品中的允許使用量應(yīng)不超過2%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），因此選取0%～2%H2O2溶液進(jìn)行試驗(yàn)。量取30%H2O2配制成0.1 g/mL的H2O2溶液。取6支潔凈試管分別加入 H2O2溶液 0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL，用蒸餾水稀釋至5 mL，然后加5 mL樣液，即H2O2溶液的終濃度為0%、0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%，搖勻后在室溫下靜置3 h，然后在波長(zhǎng)510 nm下測(cè)吸光度。

1.3.4.5 Na2SO3對(duì)黃酮類化合物穩(wěn)定性的影響

Na2SO3在食品中的允許使用量應(yīng)不超過0.05%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），因此選取0%～0.05%Na2SO3溶液進(jìn)行試驗(yàn)。稱取0.625 gNa2SO3配制成2.5 g/L的Na2SO3溶液。取 6支潔凈試管分別加入 Na2SO3溶液 0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL，用水稀釋至5 mL，然后加5 mL樣液，即Na2SO3溶液的終濃度為 0%、0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%搖勻后在室溫下靜置3 h后，在波長(zhǎng)510 nm下測(cè)吸光度。

1.3.4.6 金屬離子對(duì)黃酮類化合物穩(wěn)定性的影響

研究 K+、Na+、Ca2+、Al3+、Mg2+和 Fe3+等金屬離子對(duì)黑米中黃酮類化合物穩(wěn)定性的影響。配制0.2 mol/L的KCl、NaCl、CaCl2、AlCl3、MgCl2溶液，0.01 mol/L 的 FeCl3溶液，取6個(gè)試管分別加入金屬離子溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，均用水稀釋至 5 mL，然后再加入 5 mL試液，靜置6 h后觀察現(xiàn)象測(cè)吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程

以吸光度（A）為縱坐標(biāo)，總黃酮質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示，得到回歸直線方程：Y=0.507 9X-0.003 5（Y 為吸光度；X 為質(zhì)量濃度，mg/mL），R2=0.999 6。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of rutin

2.2 不同因素對(duì)黑米中黃酮類化合物穩(wěn)定性的影響

2.2.1 溫度對(duì)黑米黃酮穩(wěn)定性的影響

溫度對(duì)黑米黃酮穩(wěn)定性的影響見圖2。

由圖2所示，在20℃～60℃時(shí)，黑米黃酮提取液的顏色基本無變化，吸光度值隨溫度變化不大，比較穩(wěn)定。60℃以上時(shí)，吸光度值明顯上升，提取液變成藍(lán)紫色。當(dāng)溫度大于80℃以上時(shí)，提取液呈紫色，吸光度值隨溫度的升高而極顯著增大。這可能是由于溫度升高促使黃酮成分分解，產(chǎn)生更多的酚羥基[9]。試驗(yàn)表明，黑米黃酮在60℃以下顯示了良好的耐熱穩(wěn)定性，應(yīng)盡量避免在80℃以上高溫條件下存放和應(yīng)用。

圖2 溫度對(duì)黑米黃酮穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effect of temperature on the stability of flavonoids in grown black rice

2.2.2 光照對(duì)黑米黃酮穩(wěn)定性的影響

光照對(duì)黑米黃酮穩(wěn)定性的影響見圖3。

圖3 光照對(duì)黑米黃酮穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effect of light on the stability of flavonoids in grown black rice

由圖3可知，在自然光和避光條件下放置5 d后，黑米總黃酮提取液的吸光度均有所下降，但在自然光條件下下降更明顯。這是因?yàn)樵谧匀还鈼l件下，黃酮類物質(zhì)發(fā)生了自身氧化降解[8-9]。隨著時(shí)間延長(zhǎng)，黃酮提取液的顏色由深紫色變?yōu)闇\紫色。在避光保存時(shí)，黃酮提取液的吸光度變化不大，所以黑米總黃酮提取液應(yīng)在避光條件下保存為佳。

2.2.3 pH值對(duì)黑米黃酮穩(wěn)定性的影響

pH值對(duì)黑米黃酮穩(wěn)定性的影響見圖4。

由圖4可知，黑米黃酮提取液在pH6.0時(shí)，吸光度為0.58，達(dá)到最大，與原樣液的吸光度接近。調(diào)節(jié)pH值，黃酮提取液顏色發(fā)生變化，pH值為2～6時(shí)，顏色為亮紅色，且pH值越小，吸光度越低，顏色也越深。pH值為7～10時(shí)，顏色呈灰藍(lán)色，隨著pH值增大，提取液顏色加深且吸光度變小。說明黑米黃酮類化合物在酸堿性較強(qiáng)的環(huán)境中容易受到破壞，應(yīng)避免強(qiáng)酸或強(qiáng)堿的環(huán)境。

圖4 pH值對(duì)黑米黃酮穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect of pH on the stability of flavonoids in grown black rice

2.2.4 H2O2對(duì)黑米黃酮穩(wěn)定性的影響

H2O2對(duì)黑米黃酮穩(wěn)定性的影響見圖5。

由圖5可知，黑米中黃酮類化合物的吸光度隨H2O2濃度的增加而緩慢減小，但變化不大。當(dāng)H2O2質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%時(shí)，吸光度為0.51，與H2O2質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%、0.8%、1.2%、1.6%4組間差異不顯著（p＞0.05）。這表明黑米黃酮具有較好的抗氧化性。

2.2.5 Na2SO3對(duì)黑米黃酮穩(wěn)定性的影響

Na2SO3對(duì)黑米黃酮穩(wěn)定性的影響見圖6。

圖6 Na2SO3對(duì)黑米黃酮穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effect of Na2SO3on the stability of flavonoids in grown black rice

由圖6可知，黑米黃酮提取液的吸光度值隨著Na2SO3溶液濃度的增加先大幅下降后逐漸趨于平緩，當(dāng)濃度在0.05%時(shí)，吸光度值最低，與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0%、0.01%兩組之間差異顯著（p＜0.01），說明還原劑Na2SO3對(duì)黑米黃酮提取液有強(qiáng)烈破壞作用，保存時(shí)需要避免與此類還原物質(zhì)接觸。

2.2.6 金屬離子對(duì)黑米黃酮穩(wěn)定性的影響

在相同濃度不同金屬離子條件下的黑米黃酮穩(wěn)定性差異很大，提取液在不同金屬離子條件下的吸光度見表1。

表1 不同金屬離子對(duì)黑米中黃酮類化合物的穩(wěn)定性影響Table 1 Effects of metal ions on the stability of grown black rice flavonoids

如表1所示，隨著離子濃度增加，加入K+、Na+的提取液，吸光度變化幅度不明顯，表明K+和Na+基本對(duì)黑米黃酮的穩(wěn)定性沒有影響；而加入Al3+、Ca2+、Mg2+、Fe3+的吸光度變化較大，表明這些金屬離子對(duì)黑米黃酮的穩(wěn)定性影響明顯，原因可能是黃酮的鄰二酚羥基與金屬離子發(fā)生反應(yīng)后形成絡(luò)合物導(dǎo)致的[10]。加入Ca2+時(shí)提取液有部分沉淀生成。因此黑米黃酮在保存時(shí)應(yīng)避免與含 Ca2+、Al3+、Mg2+和 Fe3+離子的容器接觸。

3 結(jié)論

以黑龍江五常黑米為原料，研究黑米中黃酮類化合物的穩(wěn)定性。在不同條件下，黑米黃酮的穩(wěn)定性有一定的差異。在20℃～60℃時(shí)黃酮類化合物的含量基本不變；長(zhǎng)時(shí)間的光照對(duì)黑米黃酮的穩(wěn)定性影響較大；黑米中黃酮含量在酸堿性較強(qiáng)的環(huán)境中容易受到破壞，在弱酸性條件下比較穩(wěn)定；對(duì)氧化劑H2O2具有較好的抗氧化性，但對(duì)還原劑Na2SO3顯示出很大的不穩(wěn)定性；K+和Na+兩種金屬離子對(duì)黑米黃酮穩(wěn)定性幾乎沒有影響。而 Al3+、Ca2+、Mg2+、Fe3+能明顯降低黑米黃酮的穩(wěn)定性。

[1]楊志剛,張燕萍,楊海定,等.超聲波輔助提取常熟黑米類黃酮及其抗氧化活性分析[J].食品科學(xué),2013,34(18):118-122

[2]劉媛媛.黑米及黑米酒中抗氧化成分分析[D].楊凌:西北農(nóng)林科技大學(xué),2013

[3]孫曉俠,吳珊珊,王改玲.超聲波強(qiáng)化提取黑米皮色素的工藝研究[J].中國(guó)釀造,2010,11(9):133-136

[4]PSARRA E,MAKRIS D P,KALLITHRAKA S,et al.Evaluation of the antiradical and reducing properties of selected Greek white wines:correlation with polyphenolic composition[J].Journal of the Science of Food and Agriculture,2002,82:1014-1020

[5]粱丹,張保東.黃酮類化合物提取和分離方法研究進(jìn)展[J].周口師范學(xué)院學(xué)報(bào),2007,24(5):87-89

[6]賴毅勤,周宏兵.近年來黃酮類化合物提取和分離方法研究進(jìn)展[J].食品與藥品,2007,9(4):54-58

[7]王麗娟,劉蘇萌,李可,等.黑苦蕎中黃酮類化合物的穩(wěn)定性和抑菌活性研究[J].糧食與油脂,2015,28(8):62-65

[8]張慧,王遂.假酸漿中總黃酮的提取及穩(wěn)定性研究[J].食品科技,2014,39(10):203-207

[9]王英,張玉剛,戴洪義.蘋果皮中類黃酮的超聲波輔助提取及穩(wěn)定性研究[J].食品科學(xué),2011,32(16):178-181

[10]李紅姣,李巨秀,趙忠.酶法輔助提取山杏種皮黑色素工藝優(yōu)化及其穩(wěn)定性[J].食品科學(xué),2016,37(10):69-75