脂肪基質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化的研究現(xiàn)狀

孟燕，張利平，元小冬，錢琳琳，張萍淑

脂肪基質(zhì)細(xì)胞（adipose-derived stromal cells，ADSC）具有體內(nèi)含量多、易獲得、低免疫原性、高可塑性及自體移植無(wú)倫理問題等優(yōu)點(diǎn)。ADSC源性神經(jīng)元樣細(xì)胞彌補(bǔ)了神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)量少、臨床難以獲取的不足，為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的細(xì)胞移植療法奠定基礎(chǔ)。自ADSC被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，海內(nèi)外學(xué)者從不同角度對(duì)ADSC向神經(jīng)元樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化開展了大量研究，本文就ADSC向神經(jīng)元樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化的研究現(xiàn)狀進(jìn)行綜述。

1 ADSC的生物學(xué)特性

2001年ZUK等[1-2]首次從脂肪組織中分離出一種與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSC）形態(tài)相似的成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞，稱之為ADSC。他們發(fā)現(xiàn)在體外培養(yǎng)過程中ADSC表達(dá)具有多向分化能力基質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)志物--CD29、CD44；之后又有研究報(bào)道，ADSC不表達(dá)造血干細(xì)胞的表面標(biāo)志物--CD34[3-4]，這證明了ADSC是一種成體干細(xì)胞。ADSC體外培養(yǎng)細(xì)胞周期分析也符合幼稚細(xì)胞的特點(diǎn)，大部分細(xì)胞處于靜止期及DNA合成前期，少部分細(xì)胞處于增殖期。ZUK等[1-2，5]還發(fā)現(xiàn)，在一定條件下ADSC能夠向多種細(xì)胞分化，即ADSC是具有多向分化潛能的間充質(zhì)干細(xì)胞。ADSC增殖穩(wěn)定、衰老性低，體外培養(yǎng)10代后細(xì)胞的增長(zhǎng)速度仍未明顯降低[5]，為ADSC體外培養(yǎng)與研究提供了必要條件。關(guān)于ADSC的生長(zhǎng)特點(diǎn)、免疫表型、多向分化等方面的研究均從不同方面說(shuō)明了ADSC是一種與BMSC相似且具有弱免疫原性和多向分化潛能的間充質(zhì)干細(xì)胞[1-2，6]，因而引起眾多學(xué)者的關(guān)注。

2 ADSC向神經(jīng)元樣細(xì)胞誘導(dǎo)及鑒定

2.1 化學(xué)誘導(dǎo)法

ZUK等[2]首次采用細(xì)胞培養(yǎng)基添加β-琉基乙醇對(duì)ADSC進(jìn)行誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)后的細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)元特異性標(biāo)志--神經(jīng)元特異烯醇化酶（Neuron specific enolase，NSE）和神經(jīng)元核心抗原（NeuN）。葉長(zhǎng)青、蔡亞楠等[7，8]參照Z(yǔ)UK的方法用β-巰基乙醇誘導(dǎo)成人ADSC向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)后的細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)元細(xì)胞特異性標(biāo)志物--NSE和微管相關(guān)蛋白2（Microtubule associated protein 2，MAP2），并未表達(dá)膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物--神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白（Glial fibrillary acidic protein，GFAP），進(jìn)一步觀察后發(fā)現(xiàn)ADSC源性神經(jīng)元在形態(tài)學(xué)和超微結(jié)構(gòu)上與成熟神經(jīng)元細(xì)胞高度相似。Ashjian等[9]利用含有胰島素、異丁基甲基黃嘌呤、吲哚美辛等物質(zhì)的培養(yǎng)基對(duì)ADSC進(jìn)行誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)后的細(xì)胞表達(dá)早期神經(jīng)元的標(biāo)志NSE、NeuN等，卻并未表達(dá)MAP2和GFAP等成熟神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志。在此基礎(chǔ)上，Saffodr等[10]用胰島素、氫化考地松等試劑采用雞尾酒式方法對(duì)大鼠源性ADSC進(jìn)行誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)后細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)巢蛋白（nestin）、GFAP、NeuN、S-100蛋白和MAP2等神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志蛋白，并表達(dá)NR-1、NR-2亞單位的谷氨酸受體及生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43（Growth associated protein43，GAP43）、突觸蛋白1（synapsin 1）和電壓門控鈣離子通道。

經(jīng)典的化學(xué)誘導(dǎo)法是最早發(fā)現(xiàn)的誘導(dǎo)方法，常用的有β-琉基乙醇、丁基羥基茴香醚、二甲基亞砜等物質(zhì)，其機(jī)制可能與化學(xué)試劑抗氧化功能引起的胞內(nèi)變化有關(guān)?；瘜W(xué)誘導(dǎo)法具有誘導(dǎo)時(shí)間短、誘導(dǎo)分化率高等優(yōu)點(diǎn)，但誘導(dǎo)后的神經(jīng)元樣細(xì)胞存活時(shí)間短，限制了對(duì)其功能的深入研究?；谶@些進(jìn)一步研究應(yīng)繼續(xù)探索化學(xué)誘導(dǎo)法的最優(yōu)試劑、最適濃度及如何延長(zhǎng)誘導(dǎo)后細(xì)胞存活的時(shí)間。

2.2 因子誘導(dǎo)法

Razavi S等[11]利用堿性成纖維因子（Basic fibroblast growth factor，bFGF）分別將BMSC和ADSC誘導(dǎo)為神經(jīng)球，然后用bFGF、表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）、B27進(jìn)行神經(jīng)誘導(dǎo)，對(duì)2種細(xì)胞分化過程中MAP2和GFAP的表達(dá)情況進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)ADSC源性神經(jīng)細(xì)胞GFAP表達(dá)率較低，而MAP2表達(dá)率相似，得出ADSC比BMSC更適于向神經(jīng)元細(xì)胞誘導(dǎo)分化的結(jié)論。另有學(xué)者發(fā)現(xiàn)ADSC神經(jīng)元分化潛能與BMSC相似，但ADSC比BMSC有更高的增殖能力[12]。Taki Tiraihi等[13]以司來(lái)吉蘭為預(yù)誘導(dǎo)劑，全反式維甲酸（All-trans retinoic acid，RA）和重組人刺猬因子（Recombinant human sonic hedgehog，shh）為誘導(dǎo)劑將ADSC向運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元樣細(xì)胞誘導(dǎo)，并確定了誘導(dǎo)劑的最適濃度。深入研究后，再次將ADSC用B27、EGF、bFGF誘導(dǎo)為神經(jīng)干細(xì)胞后用Shh、RA、腦源性生長(zhǎng)因子（Brain derived growth factor，BDNF）等因子進(jìn)一步誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)后的細(xì)胞表達(dá)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元生長(zhǎng)發(fā)育的標(biāo)志物—胰島素基因增強(qiáng)結(jié)合蛋白1（Insulin gene enhanced binding protein 1，Islet-1）、少突膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子2（Oligodendrocyte transcription factor 2，Olig2）、同源框基因HB9，且呈典型的神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)[14]。

因子誘導(dǎo)法是從體內(nèi)細(xì)胞分化的研究中發(fā)展而來(lái)，目前應(yīng)用較多的因子有EGF、bFGF、BDNF等。因子誘導(dǎo)法有細(xì)胞毒性小、細(xì)胞存活率高等優(yōu)點(diǎn)[15]，但各種細(xì)胞因子半衰期較短、難以保持持久活性因而限制了因子誘導(dǎo)法的使用。

2.3 基因修飾法

Nurr-1基因是孤兒核受體轉(zhuǎn)錄因子超家族中的一員，與胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化及中腦多巴胺能神經(jīng)元發(fā)育和存活密切相關(guān)。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Nurr-1基因具有促進(jìn)胚胎干細(xì)胞、BMSC向神經(jīng)元分化的作用[16，17]。在此基礎(chǔ)上，Yang Y等[18]發(fā)現(xiàn)經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染Nurr-1基因后ADSC的神經(jīng)分化能力明顯增強(qiáng)，為ADSC神經(jīng)誘導(dǎo)方面提供了新方法。microRNAs（miRNAs）為真核生物中一類內(nèi)源性的、具有調(diào)控基因功能的非編碼RNA，其在生物發(fā)育和細(xì)胞分化中至關(guān)重要。miRNA-124、miRNA-9在大腦中含量豐富，在神經(jīng)干細(xì)胞的分化及神經(jīng)元突觸形成過程中發(fā)揮著重要作用[19，20]。有學(xué)者報(bào)道朊蛋白可能通過調(diào)節(jié)miRNA-124--羧基端小結(jié)構(gòu)域磷酸酶1（small C-terminal domain phosphatase 1，SCP1）軸發(fā)揮促進(jìn)ADSC神經(jīng)分化的作用[21]。此后，Hu F等[22]對(duì)RA誘導(dǎo)ADSC神經(jīng)分化過程中miRNAs、靶基因和信號(hào)通路間關(guān)系網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行的探究，有助于理解ADSC分化機(jī)制，尋找高效率的誘導(dǎo)方法。

目前為止ADSC向神經(jīng)元樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化尚無(wú)一種公認(rèn)的方法，后續(xù)研究可嘗試闡明ADSC的神經(jīng)分化機(jī)制，力圖尋找一種安全、高效、可持續(xù)的誘導(dǎo)方法。

3 ADSC源性神經(jīng)元樣細(xì)胞功能研究

近年來(lái)在ADSC源性神經(jīng)元樣細(xì)胞的電生理特性、神經(jīng)分泌功能等方面均有報(bào)道。Saffodr等[10]對(duì)ADSC源性神經(jīng)元樣細(xì)胞進(jìn)行深入研究發(fā)現(xiàn)，N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid，NMDA，興奮性神經(jīng)遞質(zhì)L-谷氨酸同系物）可使其大量死亡，表明ADSC源性神經(jīng)元樣細(xì)胞已形成了功能性NMDA受體。Jang S等[23]發(fā)現(xiàn)經(jīng)bFGF和腺苷酸環(huán)化酶激活劑誘導(dǎo)的ADSC源性神經(jīng)元樣細(xì)胞具有功能性離子電流。另有學(xué)者報(bào)道，ADSC細(xì)胞膜K+通道不能產(chǎn)生動(dòng)作電位，ADSC源性神經(jīng)元樣細(xì)胞具有較高的靜息膜電位，且受到高鉀刺激后迅速去極化[24]，說(shuō)明ADSC源性神經(jīng)元的K+通道已發(fā)育完備，即ADSC源性神經(jīng)元具有產(chǎn)生正常神經(jīng)元功能的電生理基礎(chǔ)。在ADSC源性神經(jīng)元樣細(xì)胞分泌功能方面，Taki Tiraihi等[14]利用熒光染料FM43-1、鈣離子指示劑和電壓敏感性染料等對(duì)ADSC源性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元進(jìn)行進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)后的細(xì)胞具有釋放突觸囊泡、支配肌管活動(dòng)功能。另有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ADSC源性神經(jīng)元樣細(xì)胞具有分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、BDNF及多巴胺的功能[25，26]。

目前研究表明，ADSC源性神經(jīng)元樣細(xì)胞電生理特性與正常神經(jīng)元相似，并具有一定的神經(jīng)分泌功能，但誘導(dǎo)后細(xì)胞是否為功能完備的神經(jīng)元細(xì)胞及是否能夠和宿主細(xì)胞整合發(fā)揮正常神經(jīng)元接受刺激、產(chǎn)生及傳導(dǎo)沖動(dòng)功能還需深入研究。

4 ADSC治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的應(yīng)用潛能

ADSC體內(nèi)應(yīng)用主要包括體外誘導(dǎo)分化后移植和移植后體內(nèi)分化兩方面。ADSC具有弱免疫原性、免疫調(diào)節(jié)性、釋放營(yíng)養(yǎng)因子等特性使其適用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的細(xì)胞治療。

4.1 缺血缺氧性腦病

缺血缺氧性腦病是腦血管疾病最常見的類型，考慮到藥物治療的局限性，尋找新的替代療法是必要的。近年來(lái)各種干細(xì)胞被應(yīng)用于缺血性腦病的細(xì)胞治療，其中ADSC具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[27]。劉斌等[28，29]將ADSC源性神經(jīng)干細(xì)胞移植到腦缺血大鼠模型中，發(fā)現(xiàn)其可上調(diào)大鼠腦缺血灶局部血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)，促進(jìn)腦缺血區(qū)新生血管形成，從而發(fā)揮神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)和促進(jìn)細(xì)胞功能恢復(fù)作用。另有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，ADSC可能通過細(xì)胞替代和抗炎作用促進(jìn)腦缺血小鼠神經(jīng)功能恢復(fù)并改善其學(xué)習(xí)記憶能力[30]。此外，成人大腦的側(cè)腦室室下區(qū)（subventricular zone，SVZ）及海馬齒狀回顆粒下層（subgranular zone，SGZ）存在具有再生能力的神經(jīng)干細(xì)胞，激活這些細(xì)胞可促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)再生達(dá)到治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的目的。在此基礎(chǔ)上，Oh SH、Schwerk A等[31，32]向小鼠腦損傷處注射ADSC后發(fā)現(xiàn)，SVZ神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化增多并向腦損傷處遷移，表明ADSC能促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞分化進(jìn)而發(fā)揮修復(fù)神經(jīng)功能的作用。以上研究可以看出ADSC可通過神經(jīng)分化、旁分泌、免疫調(diào)節(jié)、促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)再生等方面對(duì)缺血缺氧性腦病起治療作用。

4.2 帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）

PD是一種由于黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元死亡及神經(jīng)傳導(dǎo)通路中斷導(dǎo)致的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病。目前關(guān)于PD的治療只能以改善癥狀為主，不能阻止病情的發(fā)展，更無(wú)法治愈，因此需要尋找一種有效的治療方法。6-羥基多巴胺（6-hydroxydopamine，6-OHDA）可導(dǎo)致大腦黑質(zhì)特異性變性并引發(fā)神經(jīng)毒性反應(yīng)，常被用于制作PD動(dòng)物模型。Gu H等[33]對(duì)ADSC所分泌的物質(zhì)是否具有保護(hù)細(xì)胞免受6-OHDA毒性的能力進(jìn)行測(cè)試，發(fā)現(xiàn)ADSC培養(yǎng)液可以減輕6-OHDA造成的氧化應(yīng)激反應(yīng)和神經(jīng)毒性，進(jìn)而減少神經(jīng)元死亡。另有學(xué)者報(bào)道ADSC源性神經(jīng)干細(xì)胞可改善PD大鼠的行為活動(dòng)，其機(jī)制可能與減輕大鼠腦內(nèi)6-OHDA所致的氧化應(yīng)激損傷有關(guān)[34]。Takahashi等[35]將ADSC源性神經(jīng)元樣細(xì)胞移植到PD大鼠模型中，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)多巴胺能神經(jīng)元標(biāo)記物并能改善PD大鼠的運(yùn)動(dòng)癥狀。此外，對(duì)于1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四羥嘧啶（1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP）、魚藤酮等神經(jīng)毒性物質(zhì)制備的PD動(dòng)物模型ADSC移植療法均可提高其多巴胺水平、發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)功能[36，37]。ADSC源性神經(jīng)元樣細(xì)胞為PD的細(xì)胞替代療法提供了新思路。

4.3 阿爾茨海默病（Azheimer disease，AD）

AD是以進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙和行為損害為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變，是老年期癡呆最常見的類型。AD以Aβ淀粉樣蛋白沉積和神經(jīng)纖維纏結(jié)為主要病理特征，目前AD的病因及發(fā)病機(jī)制尚未闡明，缺乏有效的治療手段。目前干細(xì)胞移植法治療AD的研究日益增多。Kim S等[38]將ADSC通過靜脈和腦內(nèi)定向注射到AD小鼠模型，發(fā)現(xiàn)兩種方法均能減少Aβ淀粉樣蛋白沉積并改善小鼠認(rèn)知功能障礙。Ma T等[39]利用淀粉樣前體蛋白（Amyloid precursor protein，APP）/早衰素1（Premature senility 1，PS1）雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠模型也證實(shí)了ADSC具有減少淀粉樣蛋白沉積和恢復(fù)小鼠記憶功能的作用。目前研究表明，ADSC減少Aβ淀粉樣蛋白沉積、改善臨床癥狀是以ADSC分泌Aβ淀粉樣蛋白水解酶中的關(guān)鍵酶--腦啡肽酶為理論依據(jù)[40]。ADSC移植治療簡(jiǎn)便、安全，很可能成為將來(lái)治療AD的一種新途徑。

ADSC及ADSC源性神經(jīng)元樣細(xì)胞在治療肌萎縮側(cè)索硬化、亨廷頓舞蹈病、周圍神經(jīng)損傷等神經(jīng)系統(tǒng)疾病動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面均取得了不同程度的進(jìn)展[41，42]，同時(shí)在歐洲等地初步開展了ADSC治療缺血性卒中的臨床研究，其療效有待于進(jìn)一步報(bào)道。

5 總結(jié)及展望

隨著細(xì)胞生物學(xué)和組織工程學(xué)研究的不斷深入，ADSC分離、培養(yǎng)、神經(jīng)分化、分化后細(xì)胞檢測(cè)及體內(nèi)應(yīng)用等方面均取得了突破性進(jìn)展，使ADSC源性神經(jīng)元用于治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病成為可能。但其研究系統(tǒng)尚不完善，仍存在很多問題有待解決。目前主要的限制有：①缺乏ADSC特異性標(biāo)志物，不能明確獲取的細(xì)胞即為成體干細(xì)胞；②ADSC向神經(jīng)細(xì)胞分化方法有很多，但ADSC體內(nèi)及體外定向分化的基因調(diào)控機(jī)制尚未闡明，目前仍缺乏一種確定的分化率高、安全、持久的誘導(dǎo)方法；③ADSC向神經(jīng)細(xì)胞分化的研究仍局限于形態(tài)學(xué)、神經(jīng)特異性標(biāo)記、電生理基礎(chǔ)等方面，缺乏綜合研究證實(shí)ADSC源性神經(jīng)元樣細(xì)胞為功能完備的神經(jīng)元；④ADSC移植后改善宿主神經(jīng)損傷功能機(jī)制不明，移植體內(nèi)的ADSC是否適應(yīng)體內(nèi)神經(jīng)、體液等環(huán)境繼續(xù)生長(zhǎng)分化有待進(jìn)一步確定；⑤ADSC在神經(jīng)分化過程中能否排除致瘤性風(fēng)險(xiǎn)及是否發(fā)生免疫紊亂等改變尚屬未知。盡管尚有問題需要解決，但是隨著組織工程學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)迅速發(fā)展，人們對(duì)其認(rèn)識(shí)不斷加深，ADSC未來(lái)極有可能取代目前的干細(xì)胞源而成為細(xì)胞工程學(xué)、基因?qū)W治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的載體。

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