草地貪夜蛾組織蛋白酶B的基因克隆、序列分析、三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及其分子對(duì)接模擬

程杏安 葉靜敏 蔣旭紅 劉展眉 胡美英

（1. 仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)研究所，廣州 510225；2. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲(chóng)毒理研究室，廣州 510642）

昆蟲(chóng)組織蛋白酶，尤其是Cathepsin B類(lèi)酶，在不同物種中被研究，包括雙翅目，鞘翅目，半翅目，鱗翅目等。在大多數(shù)鞘翅目昆蟲(chóng)中，組織蛋白酶B是腸內(nèi)的一類(lèi)蛋白水解酶，屬于木瓜蛋白酶類(lèi)［1］。大量的研究表明，組織蛋白酶與昆蟲(chóng)的消化作用、昆蟲(chóng)的個(gè)體發(fā)育、組織分化以及變態(tài)反應(yīng)密切相關(guān)，因此已被考慮為該目害蟲(chóng)防治的靶蛋白。在某些雙翅目和半翅目昆蟲(chóng)中，半胱氨酸蛋白酶也是重要的消化蛋白酶［2］。許多研究證實(shí)組織蛋白酶參與了昆蟲(chóng)的胚前期卵子發(fā)生以及卵子發(fā)生過(guò)程中某些卵子細(xì)胞的退化，蚊子（Culex pipiens pallens）產(chǎn)卵前的卵子細(xì)胞解體過(guò)程中，出現(xiàn)了Cathepsin B和Cathepsin L的活化［3］。在棉鈴蟲(chóng)（Helicoverpa armigera）成蟲(chóng)的脂肪體、卵巢、卵中含有組織蛋白酶B［4-5］。經(jīng)證實(shí)蚊子的卵子退化實(shí)際上是一種細(xì)胞凋亡，也即程序性細(xì)胞死亡過(guò)程（program cell death，PCD）［6］。這說(shuō)明組織蛋白酶參與了卵子細(xì)胞的程序化死亡。

昆蟲(chóng)組織蛋白酶通過(guò)其蛋白降解活性和維持正常的細(xì)胞程序性死亡功能，在昆蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育和代謝過(guò)程中起著重要的作用。在各種卵生動(dòng)物中，胚胎發(fā)育處于外源營(yíng)養(yǎng)缺乏的條件下，因此發(fā)育的胚胎必須從卵儲(chǔ)存物中獲取所需的營(yíng)養(yǎng)，組織蛋白酶作為重要的消化蛋白酶［7］，在這一過(guò)程中通過(guò)分解氨基酸組分高度豐富的卵黃蛋白提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)，組織蛋白酶通過(guò)降解卵黃蛋白為胚胎發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而參與胚胎發(fā)生過(guò)程［8-9］。全變態(tài)昆蟲(chóng)的變態(tài)發(fā)育是一個(gè)包含了大量組織降解與重建的關(guān)鍵發(fā)育事件。此期間，大多數(shù)幼蟲(chóng)組織逐步被破壞分解，而成蟲(chóng)組織則從成蟲(chóng)盤(pán)中重新發(fā)育分化形成。棉鈴蟲(chóng)組織蛋白酶B在成蟲(chóng)期表達(dá)，參與成蟲(chóng)脂肪的解體，為卵母細(xì)胞發(fā)育提供養(yǎng)料，在胚胎發(fā)育中水解卵黃蛋白供給胚胎發(fā)育必需的氨基酸［10］。用抑制劑抑制組織蛋白酶活性，可以擾亂昆蟲(chóng)的正常代謝、導(dǎo)致昆蟲(chóng)發(fā)育不正?；蚪K止胚胎發(fā)育，進(jìn)而殺死蟲(chóng)體［11-12］，達(dá)到防治害蟲(chóng)的目的。因此，組織蛋白酶可以成為害蟲(chóng)防治的重要靶標(biāo)蛋白，尤其是Cathepsin B（SCB）這種組織蛋白酶，它們?cè)诶ハx(chóng)體內(nèi)含量豐富，功能多樣，已在多種昆蟲(chóng)中被研究，其基因序列被克隆和深入分析，這些研究為進(jìn)一步探索組蛋白酶的功能奠定基礎(chǔ)。

綜上所述，組織蛋白酶參與昆蟲(chóng)發(fā)育過(guò)程正常的細(xì)胞程序性死亡是昆蟲(chóng)完成變態(tài)發(fā)育所必需的，因此組織蛋白酶可以成為農(nóng)藥作用的新靶標(biāo)，任何抑制組織蛋白酶活性的化合物都有可能干擾昆蟲(chóng)正常發(fā)育，研究組織蛋白酶及其與抑制化合物的相互作用，對(duì)新農(nóng)藥開(kāi)發(fā)有重要理論指導(dǎo)意義。本研究以草地貪夜蛾離體細(xì)胞Sf9為對(duì)象開(kāi)展研究，克隆組織蛋白酶SCB基因，分析序列特征，再采用分子模擬軟件包以同源建模的方法模擬預(yù)測(cè)SCB三維結(jié)構(gòu)和活性中心，以及其與對(duì)應(yīng)抑制劑的結(jié)合模式，旨為基于組織蛋白酶靶標(biāo)的新農(nóng)藥開(kāi)發(fā)及其作用機(jī)理研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda）Sf9細(xì)胞系（中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)）。trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞和pEASY-T1克隆載體購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。ExTaq DNA聚合酶（5 U/μL）、dNTPs（each 15 mmol/L）購(gòu)自東盛生物公司；凝膠DNA回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司；DL2000、AMV 反轉(zhuǎn)錄酶（10 U/μL）購(gòu)自 TaKaRa公司；CA-074me（CA）購(gòu)自默克公司；EB自北京百泰克生物科技有限公司；質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司；RNA提取試劑Trizol 購(gòu)自Invitrogen公司；基因組DNA小樣抽提試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；引物合成和測(cè)序均由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。其它常規(guī)試劑為分析純?cè)噭籇U-640核酸蛋白檢測(cè)儀（Beckman公司）；PCR儀（Bio-Red公司）；Power Pac1000電泳儀（Bio-Red公司）；Tanon-4200凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）；Discovery Studio 2.1分析軟件購(gòu)自創(chuàng)藤科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 PCR引物的設(shè)計(jì)與合成 借助NCBI信息庫(kù)的BLAST程序和DNAStar 軟件對(duì)NCBI公布的棉鈴蟲(chóng)（Helicoverpa armigera）、煙夜蛾（Helicoverpa assulta）和甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）三種夜蛾科昆蟲(chóng)Cathepsin B cDNA序列進(jìn)行輔助分析，發(fā)現(xiàn)三者的ORF序列保守性很強(qiáng)，同源性在90%以上。同時(shí)前人研究表明可以利用棉鈴蟲(chóng)Cathepsin B ORF序列兩端直接設(shè)計(jì)引物克隆煙夜蛾Cathepsin B ORF序列［12］，本研究中Sf9細(xì)胞從草地貪夜蛾（S. frugiperda）分離獲得，而甜菜夜蛾與草地貪夜蛾同屬灰翅夜蛾屬，所以甜菜夜蛾與草地貪夜蛾Cathepsin B基因的同源性應(yīng)該更高，利用甜菜夜蛾的Cathepsin B ORF序列兩端設(shè)計(jì)引物更能直接克隆出草地貪夜蛾的Cathepsin B ORF序列，引物為：SexiCB P1：5'- atggtcgcttcgcgt-3'（正向引物）；SexiCB P2 ：5'- ttaaacatcaacaag-3'（反向引物）。

1.2.2 RNA和DNA的提取 Sf9細(xì)胞總RNA和基因組DNA的提取，cDNA的反轉(zhuǎn)錄合成，均參照對(duì)應(yīng)的試劑盒說(shuō)明和步驟進(jìn)行。

1.2.3 SCB ORF序列的克隆與分析 以反轉(zhuǎn)錄合成的Sf9細(xì)胞cDNA為模板，利用引物SexiCB P1和SexiCB P2分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性 5 min；95℃變性 1 min，54℃退火 1 min，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)。最后72℃延伸10 min。電泳分析PCR產(chǎn)物，出現(xiàn)一條1 000 bp左右的條帶，DNA回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物，產(chǎn)物序列，利用NCBI BLAST程序把測(cè)定結(jié)果與甜菜夜蛾的Cathepsin B基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，確定目的基因SCB片段序列。

為了獲得SCB基因ORF全長(zhǎng)序列，將所獲的PCR產(chǎn)物切膠回收克隆到pEASY-T1克隆載體上構(gòu)建SCB- pEASY-T1重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌trans1-T1，挑取陽(yáng)性克隆先進(jìn)行菌落PCR鑒定和質(zhì)粒PCR鑒定，確定陽(yáng)性克隆。把陽(yáng)性克隆菌液送測(cè)序，通過(guò)序列比對(duì)分析，確定SCB基因ORF全長(zhǎng)序列。采用NCBI的BLAST，ClustalX2等生物信息學(xué)軟件對(duì)SCB ORF序列進(jìn)行特征分析。

1.2.4 SCB編碼區(qū)內(nèi)含子的確定 根據(jù)已獲得的SCB ORF cDNA序列兩端設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)的特異性引物：

SCB P1：5'-ATGGTCGCTTCGCGTGCAAC-3'（正向引物），SCB P2：5'-TTAAACATCAACAAGGAGTG-3'（反向引物）。

以提取的Sf9細(xì)胞基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR條帶與基因克隆過(guò)程的PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果比較，如結(jié)果一致，將PCR產(chǎn)物測(cè)序，繼而把基因組DNA為模板的擴(kuò)增產(chǎn)物序列與SCB ORF進(jìn)行序列比對(duì)，如結(jié)果一致，表明SCB編碼區(qū)沒(méi)有內(nèi)含子。

1.2.5 SCB同源建模預(yù)測(cè)三維結(jié)構(gòu) 同源建模是以已知三維結(jié)構(gòu)的高同源性蛋白為模板，所需模板序列相似度超過(guò)30%［13］。步驟包括：（1）模板蛋白的確定：采用BLAST把SCB氨基酸序列在PDB蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行序列相似性搜索，確定用于SCB三維結(jié)構(gòu)建模的同源蛋白。（2）序列聯(lián)配：采用Discovery Studio/Homology軟件包中的Clustal W程序?qū)δ康牡鞍着c模板蛋白序列進(jìn)行比對(duì)［14］，然后根據(jù)晶體結(jié)構(gòu)知識(shí)手動(dòng)調(diào)整序列聯(lián)配結(jié)構(gòu)，以確定模建蛋白的SCRs（Structural Conserved Regions，結(jié)構(gòu)保守區(qū)）和Loop區(qū)。（3）蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的模建和動(dòng)力學(xué)優(yōu)化：在序列比對(duì)基礎(chǔ)上，利用軟件包的Homology模塊中的Modeler程序構(gòu)建SCB的三維結(jié)構(gòu)。模建后對(duì)各模型以PDF total energy 進(jìn)行排序，選取能量最低的構(gòu)象作為目的蛋白的初始三維結(jié)構(gòu)。利用軟件包的Standard Dynamics Cascade 程序?qū)CB的初始三維結(jié)構(gòu)模型進(jìn)行分子力學(xué)和分子動(dòng)力學(xué)優(yōu)化，以獲得蛋白更接近其在溶液環(huán)境的構(gòu)象。首先采用最陡下降法（Steepset descent method，SD）對(duì)初始結(jié)構(gòu)進(jìn)行500步的優(yōu)化，然后采用500步的共軛梯度法（Conjugate gradient method，CG）進(jìn)行能量?jī)?yōu)化。完成上述優(yōu)化后，在300 K的溫度下對(duì)模型進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬［15-16］。（4）蛋白結(jié)構(gòu)合理性評(píng)價(jià)：為了驗(yàn)證所模擬和預(yù)測(cè)的模建蛋白三維結(jié)構(gòu)模型的合理性。采用軟件包中的Profile-3D程序和拉曼圖Ramachandran對(duì)分子力學(xué)和分子動(dòng)力學(xué)優(yōu)化后的蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行合理性評(píng)價(jià)［17］。

1.2.6 SCB的活性位點(diǎn)分析及其與抑制劑的對(duì)接

1.2.6.1 SCB的活性位點(diǎn)分析 應(yīng)用Discovery Studio軟件包中的Binding Site模塊搜索SCB可能的活性位點(diǎn)，位點(diǎn)分析過(guò)程采用CVFF力場(chǎng)。Binding Site模塊提供兩種方法尋找蛋白質(zhì)中可能的活性位點(diǎn)：通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)表面的幾何形狀分析尋找能與底物結(jié)合的口袋，預(yù)測(cè)可能的結(jié)合位點(diǎn)；通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)家族在進(jìn)化過(guò)程中的保守氨基酸進(jìn)行研究，確定這些氨基酸殘基在三維結(jié)構(gòu)中的位置，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的活性位點(diǎn)。

1.2.6.2 SCB與抑制劑的對(duì)接 首先應(yīng)用Discovery Studio軟件包中Builder程序構(gòu)建抑制劑小分子并同時(shí)進(jìn)行能量最小化優(yōu)化。采用Cdock對(duì)接程序?qū)⒌鞍着c化合物對(duì)接，對(duì)接中參數(shù)設(shè)置為對(duì)接后配體自動(dòng)產(chǎn)生10個(gè)不同的對(duì)接構(gòu)象，采用score ligand pose程序的不同打分函數(shù)對(duì)這些構(gòu)象進(jìn)行評(píng)價(jià)［18］，并采用consensus score 程序?qū)ζ溥M(jìn)行打分排列［19］；蛋白與化合物小分子的最佳對(duì)接復(fù)合物將由對(duì)接能量、氫鍵結(jié)合數(shù)和一致性打分結(jié)果決定。同時(shí)，采用軟件包中Calculate Interaction Energy程序進(jìn)行抑制劑小分子與活性位點(diǎn)每個(gè)氨基酸的結(jié)合自由能計(jì)算，以確定蛋白與抑制劑小分子對(duì)過(guò)程中的關(guān)鍵氨基酸。

我國(guó)成人患者抗生素相關(guān)性腹瀉危險(xiǎn)因素的Meta分析…………………………………………………… 毛 婷等（20）：2845

2 結(jié)果

2.1 獲取Sf9細(xì)胞總RNA

本研究抽提Sf9細(xì)胞總RNA，采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA，紫外燈下可見(jiàn)到清晰18S rRNA帶型（圖1-A），結(jié)果表明RNA抽提質(zhì)量較好，未發(fā)生明顯降解，再進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)獲得Sf9細(xì)胞總cDNA，以其為模板，利用SexiCB P1和SexiCB P2引物進(jìn)行擴(kuò)增（圖1-B），分別獲得1 000 bp左右的片段序列，進(jìn)行序列測(cè)定，序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)所獲的擴(kuò)增片段與甜菜夜蛾的Cathepsin B基因序列同源性高達(dá)90%，表明所獲PCR產(chǎn)物為Sf9細(xì)胞即草地貪夜蛾的SCB基因序列。

圖1 Sf9細(xì)胞總RNA的瓊脂糖電泳圖（A）和SCB PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳分析圖（B）

2.2 獲取SCB基因ORF全長(zhǎng)序列

挑取SCB- pEASY-T1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌trans1-T1陽(yáng)性克隆，進(jìn)行菌落PCR和質(zhì)粒PCR鑒定均擴(kuò)增出1 000 bp左右條帶（圖2），表明挑取的克隆為含有重組質(zhì)粒的真陽(yáng)性克隆。把陽(yáng)性克隆菌液送測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與上述目的片段進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果一致，即得到SCB基因ORF全長(zhǎng)序列。SCB基因ORF為1 026 bp，編碼341個(gè)氨基酸。SCB ORF的cDNA全長(zhǎng)序列已經(jīng)登錄GenBank，登錄號(hào)為HQ110064。

圖2 SCB-pEASY-T1重組質(zhì)粒PCR鑒定

2.3 Sf9細(xì)胞基因組DNA的PCR擴(kuò)增

以基因組DNA為模板，分別利用 SCB P1和SCB P2引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，由圖3可知，擴(kuò)增產(chǎn)物均為1 000 bp左右，與基因克隆過(guò)程的PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果一致。將PCR產(chǎn)物送測(cè)序，比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，基因組DNA為模板的擴(kuò)增產(chǎn)物與對(duì)應(yīng)的SCB ORF序列一致，表明SCB編碼區(qū)沒(méi)有內(nèi)含子。

圖3 SCB PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳分析

2.4 SCB基因ORF推測(cè)的氨基酸序列信號(hào)肽分析

用程序SignalP 3.0分析蛋白質(zhì)SCB信號(hào)肽剪切位點(diǎn)（圖4），SCB信號(hào)肽的最有可能的剪切位點(diǎn)在20到21位之間，預(yù)測(cè)其蛋白信號(hào)肽序列為：MVASRATFVALVCALALASA。蛋白質(zhì)切割信號(hào)肽后經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單的加工過(guò)程而成為成熟肽。SCB成熟肽含有321個(gè)氨基酸。

圖4 SCB推導(dǎo)的氨基酸序列信號(hào)肽預(yù)測(cè)

2.5 SCB氨基酸組分和親水性分析

SCB氨基酸成分分析結(jié)果（表1）顯示，SCB分別由321個(gè)氨基酸組成，蛋白質(zhì)中酸性氨基酸為Asp，在SCB中占蛋白分子量的12.68%，利用頻率為11.53%；堿性氨基酸為L(zhǎng)ys，占蛋白分子量的12.23%，利用頻率為9.97%；極性氨基酸為Asn、Cys、Gln、Ser、Thr和Tyr，占蛋白分子量的28.76%，利用率為28.66%；疏水氨基酸為Ala、Ile、Leu、Phe、Trp和Val，占蛋白分子量的29.35%，利用頻率為28.66%。各種氨基酸在同一蛋白質(zhì)組成中利用次數(shù)不一樣，SCB 利用最多的是Gly，利用32次，占蛋白分子量的5.13%，利用頻率為9.97%；其次為L(zhǎng)eu，利用25 次，占蛋白分子量的7.95%，利用頻率為7.79%，Met利用最少為3 次，占蛋白分子量的1.11%，利用頻率為0.93%。

用ExPASy Proteomics Server軟件的Kyte-Doolittle法（Window size設(shè)為9）對(duì)SCB編碼的氨基酸序列進(jìn)行親水性分析，結(jié)果（圖5）表明SCB整個(gè)蛋白分子呈親水性，但在0線(xiàn)以上的A、B、C、D、E五個(gè)區(qū)域表現(xiàn)出較強(qiáng)的親脂性，其中A區(qū)域?yàn)樾盘?hào)肽。

表1 SCB編碼蛋白的氨基酸組成

2.6 SCB氨基酸序列同源性分析

將SCB氨基酸序列在NCBI信息庫(kù)中進(jìn)行同源性搜索，在鱗翅目、鞘翅目、雙翅目、半翅目4個(gè)目7個(gè)科選出12種昆蟲(chóng)以及家鼠（Rattus norvegicus）和獼猴（Rhesus monkey）兩種哺乳動(dòng)物的組蛋白酶Cathepsin B基因氨基酸序列。應(yīng)用DNAStar軟件對(duì)SCB氨基酸序列用Clustal W方法進(jìn)行一致性比對(duì)，結(jié)果見(jiàn)圖7，包括草地貪夜蛾在內(nèi)的15個(gè)物種的Cathepsin B氨基酸序列有12個(gè)保守的半胱氨酸殘基（Cys，C）位點(diǎn)，而保守性最強(qiáng)的氨基酸殘基為甘氨酸（Gly，G），有23個(gè)保守位點(diǎn)，酸性氨基酸（Asp，D）有5個(gè)保守位點(diǎn)，另外，Gly是SCB氨基酸序列中含量最豐富的氨基酸。計(jì)算各序列的遺傳距離（圖6），可知SCB與甜菜夜蛾的Cathepsin B基因相似度最高，相似度達(dá)96.2%，其次與煙夜蛾和棉鈴蟲(chóng)的相似度也較高，分別為88.8%和88.5%，與半翅目的錐獵蝽（Triatoma infestans）相似度最低為51.2%，與兩個(gè)哺乳動(dòng)物家鼠和獼猴的Cathepsin B基因相似度分別為57.7%和55.2%，高于半翅目昆蟲(chóng)錐獵蝽。

圖5 SCB氨基酸親脂性分析

根據(jù)距離建立系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)［20］將15個(gè)Cathepsin B 基因的氨基酸序列分為四大類(lèi)（圖8）：第1類(lèi)主要為鱗翅目昆蟲(chóng)的Cathepsin B，本研究中的SCB也聚到這類(lèi)，與同屬的甜菜夜蛾Cathepsin B一致性最高。鱗翅目各昆蟲(chóng)間Cathepsin B相對(duì)距離根據(jù)科屬的不同差異較大，同屬距離最近，不同屬或不同科距離較遠(yuǎn)。第2類(lèi)為半翅目，哺乳動(dòng)物的家鼠和獼猴聚到這類(lèi)；第3和4類(lèi)分別為雙翅目和鞘翅目。

2.7 SCB二級(jí)結(jié)構(gòu)及其三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

2.7.1 SCB二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)是氨基酸序列和三維構(gòu)象之間的橋梁，對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)能得到許多重要的結(jié)構(gòu)信息［21］。SCB 成熟肽氨基酸序列用DNAStar軟件的Garnier-Robson法進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。由圖9可知，SCB的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由19個(gè)α螺旋，10個(gè)β折疊，32個(gè)β轉(zhuǎn)角以及26個(gè)不規(guī)則轉(zhuǎn)曲結(jié)構(gòu)組成。

圖6 昆蟲(chóng) SCB一致性和差異度矩陣

圖7 昆蟲(chóng)SCB 氨基酸序列比對(duì)

圖8 昆蟲(chóng)SCB的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

圖9 Garnier-Robson方法預(yù)測(cè)SCB二級(jí)結(jié)構(gòu)

圖10 SCB和1MIR氨基酸序列比對(duì)結(jié)果

圖11 SCB蛋白溫度（A）和內(nèi)能（B）在500 ps動(dòng)力學(xué)模擬中隨時(shí)間變化情況

圖12 SCB三維結(jié)構(gòu)模型（A）和親疏水性三維結(jié)構(gòu)模型（B）

2.7.3 SCB三維結(jié)構(gòu)模型可靠性分析 利用Discovery Studio 軟件的Verify Protein（Profile-3D）程序?qū)σ褬?gòu)建的SCB的三維結(jié)構(gòu)模型進(jìn)行可靠性分析，圖13-A顯示除了N端和C端（肽鏈兩端的得分與許小于0），兩個(gè)模型絕大部分氨基酸殘基的Profile-3D得分都大于0，說(shuō)明幾乎所有殘基都位于合理位置。為了進(jìn)一步直觀地對(duì)SCB的三維結(jié)構(gòu)模型進(jìn)行其合理性分析，運(yùn)用拉曼圖檢測(cè)所模擬蛋白結(jié)構(gòu)的合理性。由圖13-B可知，絕大部分氨基酸殘基落在非常合理的藍(lán)色區(qū)域內(nèi)。由上述Profile-3D分析和拉曼圖分析表明構(gòu)建的SCB的三維結(jié)構(gòu)的二面角分布和立體構(gòu)象均較為合理，符合立體化學(xué)φ、ψ二面角分布的要求。

圖13 SCB三維模型的Profile-3D分析（A）和拉曼圖分析（B）

2.8 SCB與抑制劑模擬對(duì)接

使用Discovery Studio 軟件包中的Binding Site 程序?qū)CB 三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行可能活性位點(diǎn)搜索，得到15個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。選取軟件中排列在第1位的作為最佳活性位點(diǎn)用于下一步的模擬對(duì)接。采用軟件包中的Cdock程序進(jìn)行SCB與抑制劑（CA）的模擬對(duì)接，對(duì)接后每個(gè)抑制劑將產(chǎn)生10個(gè)與蛋白結(jié)合的不同構(gòu)象，根據(jù)程序?qū)Σ煌瑯?gòu)象的打分評(píng)價(jià)，選出最優(yōu)構(gòu)象。SCB與CA對(duì)接后形成的最優(yōu)復(fù)合物結(jié)構(gòu)模型。由圖14-A可知，SCB結(jié)合口袋比較淺，形狀不規(guī)則、袋口較寬。不同化合物結(jié)構(gòu)不相同，進(jìn)入蛋白活性中心后，與活性中心位點(diǎn)相互作用的氨基酸，以及作用強(qiáng)弱、作用方式等也不同，本研究對(duì)CA與SCB活性位點(diǎn)的相互作用進(jìn)行模擬。由圖14-B可知，CA與SCB活性位點(diǎn)的ILE5、VAL23等多個(gè)氨基酸相互作用，其中分別與VAL23和ASN24形成兩個(gè)氫鍵。由此可見(jiàn)CA和與SCB具有較強(qiáng)的相互作用。

蛋白與不同化合物形成的復(fù)合物中起主要作用的氨基酸殘基可能不同。本研究計(jì)算了抑制劑分子CA與SCB對(duì)應(yīng)蛋白酶活性位點(diǎn)中單個(gè)氨基酸殘基的相互作用能。根據(jù)這個(gè)相互作用能，進(jìn)一步確定SCB與CA分子相互作用的關(guān)鍵氨基酸殘基。由表2可知CA與SCB活性位點(diǎn)單個(gè)氨基酸殘基相互作用的能量包括：總相互作用能、范德華力相互作用能和靜電相互作用能（表中只顯示總能量小于-0.5 kcal/mol的氨基酸殘基）。CA與SCB活性位點(diǎn)的ARG19、VAL23、ASN24有較強(qiáng)的相互作用，是關(guān)鍵的氨基酸，總作用能分別為-11.43、-9.22、-8.67 kcal/mol，3個(gè)殘基對(duì)復(fù)合物形成的貢獻(xiàn)最大，且均主要表現(xiàn)為靜電相互作用能，其中VAL23、ASN24與CA形成氫鍵。

圖14 CA與SCB對(duì)接復(fù)合物（A）和CA與SCB活性位點(diǎn)的結(jié)合模式（B）

3 討論

研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)是了解蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能的重要途徑。氨基酸序列對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)象起著決定性的作用，很多同源性的氨基酸序列就可以決定同一蛋白構(gòu)象，這是蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的理論基礎(chǔ)［22］。目前研究蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)方法包括X射線(xiàn)晶體衍射技術(shù)和核磁共振技術(shù)［23］均屬于生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，它們能夠準(zhǔn)確測(cè)定蛋白三維結(jié)構(gòu)，但同時(shí)也存在許多技術(shù)難點(diǎn)，使得測(cè)定進(jìn)度性對(duì)于大量未知蛋白來(lái)說(shuō)顯得十分緩慢。為了加快新蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)測(cè)定及其與化合物的相互作用方式，當(dāng)前通過(guò)PDB蛋白結(jié)構(gòu)信息庫(kù)中搜索已知結(jié)構(gòu)的同源蛋白質(zhì)作為模板，利用同源建模軟件對(duì)新蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)建模是最為常用且有效的一種蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)方法［22］。隨著生物信息學(xué)的快速發(fā)展及其在生物學(xué)研究中的突出作用，蛋白質(zhì)同源模建技術(shù)已經(jīng)成為一種可靠性高且被廣泛認(rèn)可的蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)技術(shù)。任何一對(duì)氨基酸序列長(zhǎng)度大于80的蛋白質(zhì)，如果兩者的序列同源性超30 %，則可認(rèn)為它們具有相似的三維結(jié)構(gòu)，即蛋白質(zhì)的基本折疊相同［24］。本研究中克隆的組織蛋白酶基因SCB的ORF，編碼區(qū)能夠分別編碼321個(gè)氨基酸，在PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索發(fā)現(xiàn)蛋白1MIR與SCB的氨基酸序列同源性高達(dá)60%以上。因此符合蛋白同源建模的條件，可以以1MIR為模板分別對(duì)SCB的三維結(jié)構(gòu)模型進(jìn)行預(yù)測(cè)。

表2 CA與SCB氨基酸殘基的相互作用

有關(guān)組織蛋白酶的結(jié)構(gòu)分析及其與化合物相互作用的機(jī)理，在各種物種中做了較多的研究。晶體學(xué)分析結(jié)果表明錐蟲(chóng)Cathespin B在Pro93和Leu94斷裂形成成熟蛋白，而且在N端活性位點(diǎn)之前還有16 個(gè)額外的氨基酸殘基。錐蟲(chóng)Cathespin B與抑制劑CA-074［25］相互作用形成的復(fù)合物結(jié)構(gòu)，以人類(lèi) Cathepsin B（1GMY），老鼠 Cathepsin B（1CTE）and 斑馬Cathepsin B（1F2A），作為模板蛋白用MODELLER［26］同源建模技術(shù)以及MODELLER分析替換技術(shù)進(jìn)行了分析研究。CA-074通過(guò)與Cathespin B結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸殘基Gly165、Gys122等形成多個(gè)氫鍵而牢固結(jié)合與Cathespin B，同時(shí)大量的疏水氨基酸殘基在S2位點(diǎn)上提供結(jié)合能。有研究還發(fā)現(xiàn)錐蟲(chóng)Cathespin B活性位點(diǎn)有一個(gè)橫跨的‘occluding loop’結(jié)構(gòu)，在Cathepsin L同源物rhodesain上沒(méi)有發(fā)現(xiàn)這個(gè)結(jié)構(gòu)，這與‘occluding loop’是Cathespin B區(qū)別Cathepsin L類(lèi)組織蛋白酶特征的觀點(diǎn)一致［27-28］，然而該研究發(fā)現(xiàn)錐蟲(chóng)Cathespin B的‘ occluding loop’ 結(jié)構(gòu)比哺乳動(dòng)物的Cathespin B多3個(gè)氨基酸殘基，而且在His 194 and His195之間形成一個(gè)雙重構(gòu)造。這些區(qū)別的發(fā)現(xiàn)對(duì)設(shè)計(jì)錐蟲(chóng)組織蛋白酶專(zhuān)一性抑制劑類(lèi)藥物，防治錐蟲(chóng)病很有意義的。本研究用Discovery Studio同源建模軟件對(duì)SCB蛋白與其對(duì)應(yīng)抑制劑CA的相互作用模式進(jìn)行模擬，結(jié)果表明SCB結(jié)合口袋比較淺，形狀不規(guī)則、袋口較寬。結(jié)合能預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)CA與SCB活性位點(diǎn)的ARG 19、VAL 23、ASN 24有較高的相互作用能，是關(guān)鍵的氨基酸。這些研究對(duì)進(jìn)一步運(yùn)用生物實(shí)驗(yàn)手段研究其結(jié)構(gòu)和功能，為設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)昆蟲(chóng)組織蛋白酶類(lèi)抑制劑殺蟲(chóng)劑有重要意義。

4 結(jié)論

本研究克隆獲得草地貪夜蛾Cathepsin B基因ORF序列，該基因的ORF為1 026 bp 的片段，編碼341 個(gè)氨基酸。同源建模預(yù)測(cè)該組織蛋白酶的三維結(jié)構(gòu)，確定其折疊成緊密而穩(wěn)定的球狀結(jié)構(gòu)，含6 個(gè)二硫鍵。分子對(duì)接模擬表明該酶活性中心的ARG19、VAL23和ASN24為關(guān)鍵氨基酸殘基，以氫鍵與抑制劑分子為結(jié)合。

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