小桐子MYB基因家族的鑒定及JcMYB308基因的克隆與低溫表達(dá)分析

辛胡 顏岳輝 丁雪梅 劉潮 高永 代冬琴唐利洲 王海波

（1. 西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，昆明 650224；2. 曲靖師范學(xué)院 云南高原生物資源保護(hù)與利用研究中心 云南省高校云貴高原動(dòng)植物遺傳多樣性及生態(tài)適應(yīng)性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，曲靖 655011）

小桐子（Jatropha curcas L.）又名麻瘋樹、黃腫樹（廣東）、膏桐（云南）、桐油樹（臺(tái)灣）、假花生（廣西），發(fā)源于加勒比海的海島，現(xiàn)廣泛分布和栽培于熱帶、亞熱帶等地區(qū)［1-2］，在我國主要分布于廣西西南部和西部、云南南部和東南部等地區(qū)［3］。它屬大戟科（Euphorbiaceae）麻瘋樹屬（Jatropha）多年生木本油料植物，其種子含油量高，流動(dòng)性好，是加工生物柴油的優(yōu)質(zhì)原料，且耐干旱貧瘠，是干熱河谷地區(qū)理想的生態(tài)造林樹種［4-5］，被世界公認(rèn)為生物能源樹種。其油被改性后適用于各種柴油機(jī)，并在閃點(diǎn)、凝固點(diǎn)、硫含量、一氧化碳排量及顆粒值等關(guān)鍵技術(shù)均優(yōu)于國內(nèi)零號(hào)柴油，達(dá)到歐洲二號(hào)排放標(biāo)準(zhǔn)。另外，其種仁可作為傳統(tǒng)的肥皂及潤滑油原料［6］，有瀉下和催吐功效［7-8］，油麩可作農(nóng)藥及肥料［9］，兼具經(jīng)濟(jì)價(jià)值及良好的開發(fā)前景［10］。

生物與非生物逆境脅迫下，植物通過一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子，并結(jié)合靶基因上游特定順式作用元件從而激活或抑制抗逆相關(guān)基因以特定的時(shí)空與強(qiáng)度進(jìn)行轉(zhuǎn)錄表達(dá)，進(jìn)而抵抗不利環(huán)境［11］。目前，已經(jīng)鑒定的植物抗逆轉(zhuǎn)錄因子包括 MYB、WRKY、ZFP、AP2/ERF、bHLH、NAC、VOZ、CAMTA及 EIN3等［12-13］。其中，MYB基因家族及MYB結(jié)構(gòu)域基因進(jìn)化時(shí)間較長，且存在于所有真核生物中，是植物界最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一［14］，參與植物細(xì)胞分化、葉片等器官的形態(tài)建成、次生物質(zhì)代謝、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)及環(huán)境因子的應(yīng)答等過程［15］。根據(jù)MYB結(jié)構(gòu)域的數(shù)量及分布，MYB基因一般分為4種類型，其中，R2R3-MYB是植物中分布最為廣泛的一種MYB基因［16-17］，而R1R2R3-MYB（3R-MYB）主要存在于動(dòng)物體中，參與動(dòng)物細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)等過程［18-19］，但在植物中數(shù)量較少，一般含有4-5個(gè)［20］，4R-MYB在大部分動(dòng)植物中僅含有1個(gè)，而且人們對(duì)其功能的了解甚少。本研究基于小桐子基因組數(shù)據(jù)庫，對(duì)MYB基因家族在全基因組水平進(jìn)行了鑒定，并克隆到一個(gè)MYB基因家族基因JcMYB308，順式作用元件與qRT-PCR分析顯示其可能參與小桐子多種非生物脅迫如低溫的應(yīng)答過程，本研究為進(jìn)一步對(duì)該基因進(jìn)行功能驗(yàn)證及轉(zhuǎn)基因研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料及處理 本實(shí)驗(yàn)選用的小桐子種子取自云南省楚雄州元謀縣。選取飽滿的小桐子種子，1.5% CuSO4溶液消毒15 min后，用無菌水漂洗3-5次，置于26℃的恒溫培養(yǎng)箱中吸漲24 h。隨后，將吸漲的種子于無菌水中漂洗2-3次后，置于墊有5層無菌水濕潤濾紙的托盤中，在相對(duì)濕度（RH）為75%、26/20℃、16/8 h光周期的恒溫培養(yǎng)箱中萌發(fā)5 d。選取發(fā)芽較好的種子播于消毒的培養(yǎng)土中，并于相同條件的恒溫培養(yǎng)箱中生長約15 d，直至第2片真葉展開。隨后將生長15 d后的小桐子幼苗置于相對(duì)濕度（RH）為75%、12℃、16/8 h光周期的低溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行低溫脅迫處理，分別取低溫脅迫0.5、3、12、24、48 h與對(duì)照（正常培養(yǎng)）的第2片真葉、莖及根，置于貼好標(biāo)簽的自封袋中，液氮速凍后存于-80℃冰箱中用于RNA的提取。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)的主要試劑 本研究中大腸桿菌 Trans1-T1（DH5α）、TransZol Up、DNase I、TransStart Taq DNAPolymerase、氨芐青霉素（Amp）、X-gal、IPTG、2× Easy Taq PCR SuperMix（+dye）、EasyPure Plasmid MiniPrep Kit、pEASY-T1 Cloning Kit、Trans 2K Plus II DNA Marker、TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix、TransStart Top Green qPCR SuperMix等購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；引物合成及測序由華大基因有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 小桐子MYB基因家族全基因組成員鑒定及序列分析 從GenBank下載小桐子最新注釋蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，通過Pfam（http://pfam.xfam.org/）下載MYB結(jié)構(gòu)域的隱馬可夫模型（PF02701），利用Hmmer3.0軟件的Hmmsearch程序?qū)π⊥┳拥鞍踪|(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)（閾值E＜1e-10，序列相似性＞50%），得到候選的小桐子MYB蛋白質(zhì)序列，并手工去除重復(fù)序列。將非冗余的候選序列利用Pfam與CDD在線工具分析MYB蛋白結(jié)構(gòu)域做進(jìn)一步篩選，得到最終的小桐子MYB家族蛋白序列。將鑒定的小桐子MYB蛋白序列利用ClustalX（Version2.0）進(jìn)行序列相似性比對(duì)，然后用MEGA6.0軟件通過鄰接法（NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，并采用自展法（Bootstrap）進(jìn)行檢驗(yàn)。

1.2.2 總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成 利用兩步裂解法提取小桐子對(duì)照與12℃低溫脅迫0.5、3、12、24、48 h的根、莖及葉片的總RNA，并利用DNase I消化RNA中的殘余基因組DNA，得到純化的總RNA。分別取3 μg總RNA，以Anchored Oligo（dT）為逆轉(zhuǎn)錄引物，利用 TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix合成第一鏈 cDNA。

1.2.3 小桐子JcMYB308基因cDNA片段的克隆 以1.2.2反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，使用雙封閉熱啟動(dòng)DNA聚合酶TransStart Taq DNA Polymerase進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列為：JcMYB308_F1：5'-AACCCATTTGCCTTGTCT-3'；JcMYB308_R1：5'-CTCCATCGCCAGTCTTCA-3'。擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，51.8℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃后延伸20 min。切膠回收目的條帶（約700 bp），與克隆載體pEASY-T1連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，涂Amp抗性LB平板，過夜培養(yǎng)，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證陽性克隆，提取重組質(zhì)粒命名為pEASY-T1-JcMYB308。

1.2.4 小桐子JcMYB308基因的序列分析 利用BioEdit軟件將克隆的小桐子JcMYB308基因cDNA序列翻譯成氨基酸序列，用在線工具ProtParam計(jì)算其理論分子量、等電點(diǎn)等基本參數(shù)。將獲得的小桐子JcMYB308基因?qū)enBank小桐子基因組序列（Annotation release 101）進(jìn)行tblastn檢索得到其基因與CDS序列，同時(shí)下載其它植物的MYB308基因序列、CDS序列及氨基酸序列。利用在線軟件GSDS（Gene Structure Display Server，http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）進(jìn)行CDS序列與基因序列比對(duì)以確定基因內(nèi)含子與外顯子的結(jié)構(gòu)并繪制基因結(jié)構(gòu)圖。將小桐子JcMYB308蛋白序列與其它植物MYB308進(jìn)行序列相似性比對(duì)，然后用MEGA6.0軟件通過鄰接法（NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。利用GenBank的CDD工具對(duì)比對(duì)文件進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析并利用GenDOC軟件繪圖。

1.2.5 小桐子JcMYB308基因的熒光定量表達(dá)分析 利用1.2.2中獲得的小桐子各器官低溫脅迫條件下的cDNA為模板，以18S rRNA為內(nèi) 參（GenBank登 錄 號(hào)：AY823528）， 利 用TransStart Top Green qPCR SuperMix進(jìn) 行 小 桐子JcMYB308基因的qRT-PCR擴(kuò)增，使用儀器為 Roche Lightcycler 96，20 μL反 應(yīng) 體 系， 每 個(gè)樣品重復(fù)3次。JcMYB308基因擴(kuò)增引物序列JcMYB308_F2（5'-AACCCATTTGCCTTGT-3'），JcMYB308_R2（5'-CAGCAGCCTTCACCAT-3'）；內(nèi)參基因18S rRNA擴(kuò)增引物序列18S rRNA_F（5'-AGAAACGGCTACCACATC-3'），18S rRNA_R（5'-CCAAGGTCCAACTACGAG-3'）。 擴(kuò) 增 條 件 為 ：94℃預(yù)變性30 s；94℃變性10 s，50.8℃退火15 s，72℃延伸15 s，45個(gè)循環(huán)，之后增加溶解曲線程序：95℃ 10 s，65℃ 60 s，97℃ 1 s，連續(xù)檢測信號(hào)。采用2-ΔΔCt方法進(jìn)行基因差異表達(dá)分析。組織差異表達(dá)分析以葉片的表達(dá)量為基準(zhǔn)，低溫差異表達(dá)分析以對(duì)照（CK）的表達(dá)量為基準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 小桐子MYB基因家族全基因組成員鑒定及序列分析

自GenBank下載小桐子最新注釋蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，結(jié)合Pfam與CDD結(jié)構(gòu)域分析共鑒定到213個(gè)小桐子MYB基因家族成員，其中1R-MYB 86個(gè)、R2R3-MYB 122個(gè)、3R-MYB 4個(gè)、4R-MYB 1個(gè)，JcMYB-308基因?qū)儆赗2R3-MYB亞家族中的一員。同時(shí)，對(duì)小桐子MYB家族進(jìn)行理化性質(zhì)分析表明：小桐子213個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)序列長度分布在88-2 039 aa之間，等電點(diǎn)分布在4.49-10.33之間。聚類分析顯示小桐子MYB家族分為6個(gè)亞家族（圖1）。

2.2 小桐子JcMYB308基因片段cDNA的克隆

以小桐子低溫脅迫48 h的葉片提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板擴(kuò)增JcMYB308基因片段。結(jié)果表明，擴(kuò)增產(chǎn)物約713 bp，與預(yù)期設(shè)計(jì)引物結(jié)果一致（圖2-A）。將目的條帶切膠回收后與T/A克隆載體pEASY-T1連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)菌落PCR 鑒定陽性克?。▓D2-B），之后陽性克隆過夜培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒（圖2-C）。

2.3 小桐子JcMYB308基因的序列分析

利用BioEdit 軟件將克隆的小桐子 JcMYB308 基因的部分 cDNA序列翻譯成氨基酸序列（圖 3）。

圖1 通過ClustalX序列比對(duì)MEGA6.0鄰接法構(gòu)建的小桐子MYB基因家族進(jìn)化樹

從GenBank下載其它植物的MYB308蛋白序列，通過ClustalX2.0序列比對(duì)，并利用MEGA5.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，MYB308蛋白在N端序列保守性較高，分別鑒定到2個(gè)MYB結(jié)構(gòu)域，而中部與C端的序列一致性相對(duì)較?。▓D4）。單子葉植物和雙子葉植物單獨(dú)聚類為兩個(gè)分支，而小桐子與同屬大戟科的蓖麻親緣關(guān)系最近，序列一致性為62.7%（圖5）。

為了分析小桐子JcMYB308基因的結(jié)構(gòu)特征，構(gòu)建了JcMYB308與其它物種MYB308基因內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)圖和系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明，所有考察的植物MYB308基因都含有2個(gè)外顯子，且都包含5'和3'非編碼區(qū)（5'-UTR和3'-UTR）。其中，小桐子JcMYB308基因5'-UTR區(qū)域長度約為1 791 bp，與其它植物MYB308基因結(jié)構(gòu)差異較為顯著（圖6）。

2.4 小桐子JcMYB308基因的表達(dá)分析

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，MYB類轉(zhuǎn)錄因子中包含與植物抗逆性相關(guān)的基因［21］。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)小桐子JcMYB308基因進(jìn)行組織差異與低溫脅迫表達(dá)分析。結(jié)果表明，JcMYB308基因在根、莖、葉器官中均有表達(dá)，但存在組織差異性。其中，在小桐子根中表達(dá)量較高；其次是莖，而在葉片中表達(dá)量相對(duì)較低（圖7-A）。另外，小桐子JcMYB308基因在葉片、莖及根中都屬于低溫誘導(dǎo)表達(dá)基因，在葉中，在低溫脅迫的0.5 h-12 h持續(xù)誘導(dǎo)高表達(dá)，并在低溫脅迫12 h達(dá)到最大表達(dá)量，較對(duì)照提高6.73倍（圖7-B），而在莖與根中，均在低溫脅迫24 h達(dá)到最大表達(dá)量，分別較對(duì)照提高18.17倍與10.93倍（圖7-C、D），說明JcMYB308基因與小桐子的抗冷性形成直接相關(guān)。

圖2 小桐子JcMYB308基因cDNA片段克隆

圖3 小桐子JcMYB308基因的部分cDNA及對(duì)應(yīng)的氨基酸序列

3 討論

MYB類轉(zhuǎn)錄因子家族特有的MYB結(jié)構(gòu)域是一段含有約51-53個(gè)氨基酸殘基的肽段，包含一系列高度保守的氨基酸殘基和間隔序列［22］。其廣泛分布于真核生物中，也是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一［23］。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，小桐子MYB基因家族包含213個(gè)成員，其中R2R3-MYB成員122個(gè)。目前Katiyar 等［24］報(bào)道水稻和擬南芥中分別包含155和197個(gè)MYB成員，其中發(fā)現(xiàn)水稻中含R2R3-MYB基因109個(gè)；Du等［25-27］在玉米和大豆中分別鑒定到157和244個(gè)R2R3-MYB成員；Willcins等［28］在楊樹中鑒定到192個(gè)R2R3-MYB成員；Li等［22］在黃瓜基因組中鑒定到55個(gè)R2R3-MYB基因。而本研究構(gòu)建進(jìn)化樹分析顯示，胡楊、黃瓜與小桐子同屬雙子葉分支，表明它們的親緣關(guān)系、生物學(xué)功能比較近，但數(shù)據(jù)剖析結(jié)果與之相反，數(shù)量相差較大，反而與單子葉植物相接近。但一些研究者也發(fā)現(xiàn)，有些雙子葉植物與小桐子R2R3-MYB成員數(shù)量相差甚少，如Matus等［29］在葡萄中鑒定到108個(gè)R2R3-MYB成員；Katiyar［24］等于擬南芥中發(fā)現(xiàn)其有126個(gè)R2R3-MYB成員。因此，可以推知，MYB基因家族成員雖然分布在不同物種中，隨著親緣關(guān)系的近與遠(yuǎn)其數(shù)量有一定的變化，但對(duì)于大多數(shù)單、雙子葉植物來說，它們的親緣關(guān)系出現(xiàn)交叉性。

MYB基因家族不僅參與植物的大部分生長發(fā)育過程［31］，還在植物體內(nèi)參與調(diào)控其生物的合成及信號(hào)傳導(dǎo)的過程，如調(diào)節(jié)花青素、類黃酮、木質(zhì)素的合成、毛狀體的分化、抗逆信號(hào)的傳導(dǎo)等［16-17］。在研究中我們發(fā)現(xiàn)，小桐子JcMYB308基因?qū)儆赗2R3-MYB亞家族中的一員。諸多文獻(xiàn)報(bào)道，R2R3-MYB亞家族所含轉(zhuǎn)錄因子與植物的多種非生物脅迫應(yīng)答如低溫密切相關(guān)。如Cominelli等和Seo等［32-33］研究發(fā)現(xiàn)在擬南芥中AtMYB60和AtMYB96在ABA信號(hào)傳遞過程中起調(diào)控作用，具有調(diào)控氣孔導(dǎo)度、提

高植物抗旱和抗病能力的功能；其中AtMYB30、AtMYB60、AtMYB96及VvMYB60的共同特點(diǎn)是都參與抗逆信號(hào)的傳遞與調(diào)控過程；Ding等［34］報(bào)道了擬南芥基因AtMYB15的過量表達(dá)可以提高擬南芥對(duì)ABA的敏感性，并提高了植物的抗旱性。本研究通過基因結(jié)構(gòu)和進(jìn)化分析顯示及qRT-PCR分析結(jié)果初步斷定JcMYB308基因可能參與小桐子抗冷性的形成過程，它在不同組織中均有表達(dá)，其中于葉中，在低溫脅迫0.5 h-12 h持續(xù)誘導(dǎo)高表達(dá)；還發(fā)現(xiàn)它的表達(dá)于某一時(shí)段或時(shí)刻高表達(dá)后又開始趨于下降，若作圖呈現(xiàn)鐘罩性。對(duì)此現(xiàn)象我們認(rèn)為，小桐子生活于干熱河谷地區(qū)，由于缺乏對(duì)低溫的適應(yīng)能力，對(duì)其植株于12℃進(jìn)行低溫處理，達(dá)到最大抗性的低溫訓(xùn)化時(shí)間后其體內(nèi)的生理生化活動(dòng)依次減弱，所以表達(dá)量下降。此外，Agarwal等［21］在擬南芥中也發(fā)現(xiàn)AtMYB15參與抗寒基因的表達(dá)調(diào)控；Van等［35］研究表明與之聚類于同一亞家族的AtMYB72與植物誘導(dǎo)系統(tǒng)性抗性獲得有關(guān)。雖然本實(shí)驗(yàn)研究的小桐子R2R3-MYB亞家族成員之一MYB308基因在其它物種中報(bào)道甚少，但基于以上研究充分證實(shí)，MYB

類轉(zhuǎn)錄因子家族與植物的耐脅迫性密切相關(guān)。就當(dāng)前的研究而言，MYB基因家族雖作為一個(gè)大家族，數(shù)量甚多，但與植物抗冷性相關(guān)的基因僅有一小部分。本研究結(jié)果有助于更好地了解MYB轉(zhuǎn)錄因子在小桐子中對(duì)低溫響應(yīng)的作用。

圖4 植物MYB308氨基酸多序列比對(duì)

圖5 小桐子JcMYB308與其他物種MYB308轉(zhuǎn)錄因子的進(jìn)化分析

圖6 植物MYB308的基因結(jié)構(gòu)分析

圖7 小桐子JcMYB308基因的表達(dá)模式分析

4 結(jié)論

本研究基于小桐子最新注釋全基因組數(shù)據(jù)庫，通過生物信息學(xué)鑒定得知小桐子全基因組共含213個(gè)MYB基因家族成員，聚類為6個(gè)亞家族，其中MYB308基因?qū)儆赗2R3-MYB亞家族成員。利用RTPCR成功克隆了小桐子JcMYB308基因，其克隆片段長度為713 bp，基因結(jié)構(gòu)具有較高的保守性，均含有兩個(gè)外顯子，進(jìn)化樹顯示其與同屬大戟科的蓖麻親緣關(guān)系最近，序列一致性為62.7%。qRT-PCR表達(dá)分析表明，小桐子JcMYB308基因的表達(dá)存在組織表達(dá)特異性，在根中表達(dá)量較高，而在葉片中表達(dá)量相對(duì)較低，在根與莖中低溫脅迫24 h時(shí)達(dá)到最大表達(dá)量。

［1］張無敵, 宋洪川, 偉小巋, 等. 元謀縣小桐子種植的適應(yīng)性研究［J］. 農(nóng)業(yè)與技術(shù) , 2001, 21（2）：22-25.

［2］曾覺民. 可大力發(fā)展的生物質(zhì)能源植物-膏桐［J］. 云南林業(yè),2006, 27（2）：21-22.

［3］陳麗, 吳軍, 曾妮, 等. 用GC-MS分析不同采收和貯存時(shí)期的麻瘋種子油的脂肪酸［J］. 熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào), 2007, 15（5）：443-446.

［4］ 王濤. 中國主要生物質(zhì)燃料油木本能源植物資源概況與展望［J］. 科技導(dǎo)報(bào) , 2005, 23（5）：12-14.

［5］Nakashima K, Ito Y, Yamaguchi-Shinozaki K. Transcriptional regulatory network in response to abiotic stress in Arabidopsis and grasses［J］. Plant Physiology, 2009, 149（1）：88-95.

［6］李靜, 吳芬宏, 陳延燕, 等. 麻風(fēng)樹種子提取物對(duì)幾種害蟲的殺蟲活性［J］. 農(nóng)藥 , 2006, 45（1）：57-58.

［7］范菊娣, 楊松, 宋寶安, 等. 麻風(fēng)樹農(nóng)藥和醫(yī)藥生物活性研究進(jìn)展［J］. 農(nóng)藥 , 2006, 45（5）：298-301.

［8］王兆玉, 杜延琪, 岑岳柱, 等. 小油桐葉甲醇提取物對(duì)福壽螺的藥效試驗(yàn)［J］. 南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2009, 29（6）：1235-1237.

［9］劉杰, 李黔柱, 尹航, 等. 麻風(fēng)樹植物資源的研究與開發(fā)利用進(jìn)展［J］. 貴州大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版, 2006, 23（2）：105-110.

［10］ 劉玉君, 沈世華. 小桐子種子油體蛋白的提取及其電泳分析［J］. 林業(yè)科學(xué) , 2008, 44（8）：37-40.

［11］劉輝, 李德軍, 鄧治. 植物應(yīng)答低溫脅迫的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究進(jìn)展［J］. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2014, 47（18）：3523-3533.

［12］Wang HB, Zou ZR, Wang SS, et al. Global analysis of transcriptome responses and gene expression profiles to cold stress of Jatropha curcas L［J］. PLoS One, 2013, 12（12）：e82817.

［13］Wang HB, Zou ZR, et al. Deep sequencing- based transcriptome analysis of the oil-bearing plant Physic Nut（Jatropha curcas L.）under cold stress［J］. Plant Omics, 2014, 7（3）：178-187.

［14］Zhang L, Ma H. Complex evolutionary history and diverse domain organization of SET proteins suggest divergent regulatory interactions［J］. New Phytologist, 2011, 195（1）：248-263.

［15］Lipsick JS. One billion years of Myb［J］. Oncogene, 1996, 13（2）：223-235.

［16］Jiang C, Gu J, Chopra S, et al. Ordered origin of the typical twoand three-repeat Myb genes［J］. Gene, 2004, 326（2）：13-22.

［17］Wilkins O, Nahal H, Foong J, et al. Expansion and diversification of the populus R2R3-MYB family of transcription factors［J］. Plant Physiology, 2009, 149（2）：981-993.

［18］Takahashi T, Nakagoshi H, Sarai A, et al. Human A-myb gene encodes a transcriptional activator containing the negative regulatory domains［J］. FEBS Letters, 1995, 358（1）：89-96.

［19］Foos G, Grimm S, Klempnauer KH. Functional antagonism between members of the myb family：B-myb inhibits v-myb-induced gene activation［J］. EMBO J, 1992, 11（12）：4619-4629.

［20］Kranz H, Scholz K, Weisshaar B. c-MYB oncogene-like genes encoding three MYB repeats occur in all major plant lineages［J］.Plant Journal, 2000, 21（2）：231-235.

［21］Agarwal M, Hao YJ, Kapoor A, et al. A R2R3 Type MYB transcription factor Is involved in the cold regulation of CBF genes and in acquired freezing tolerance［J］. J Biol Chem, 2006, 281（49）：37636-37645.

［22］Li Q, Zhang C, Li J, et al. Genome-wide identification and characterization of R2R3-MYB family in Cucumis sativus［J］.PLoS One, 2012, 7（10）：e47576.

［23］Riechmann JL, Heard J, Martin G, et al. Genome-wide comparative analysis among eukaryotes［J］. Science, 2000, 290（5499）：2105-2110.

［24］Katiyar A, Smita S, Lenka SK, et al. Genome-wide classification and expression analysis of MYB transcription factor families in rice and Arabidopsis［J］. BMC Genomics, 2012, 13 ：544.

［25］Du H, Feng BR, Yang SS, et al. The R2R3-MYB transcription factor gene family in maize［J］. PLoS One, 2012, 7（6）：e37463.

［26］Du H, Yang SS, Liang Z, et al. Genome-wide analysis of the MYB transcription factor superfamily in soybean［J］. BMC Plant Biology, 2012, 12（7）：106.

［27］ Du H, Feng BR, et al. The R2R3-MYB transcription factor gene family in maize［J］. PLoS One, 2012, 7（6）：e37463.

［28］Willcins O, Nahal H, Foong J, et al. Expansion and diversification of the Populus R2R3-MYB family of transcription factors［J］.Plant Physiology, 2009, 149（2）：981-993.

［29］Matus JT, Aquea R, Arce-Johnson P. Analysis of the grape MYB R2R3 subfamily reveals expanded wine quality-related glades and conserved gene structure organization across Vitis and Arabidopsis genomes［J］. BMC Plant Biology, 2008, 8（7）：83.

［30］Braun EL, Grotewold E. Newly discovered plant c-myb-like genes rewrite the rvolution of the plant MYB gene family［J］. Plant Physiology, 1999, 121（1）：21-24.

［31］段俊枝, 李瑩, 周雷, 等. 利用基因工程技術(shù)提高水稻耐冷性的研究進(jìn)展［J］. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2015, 27（4）：705-712.

［32］Cominelli E, Galbiati M, Vavasseur A, et al. A guard-cell-specific MYB transcription factor regulates stomatal movements and plant drought tolerance［J］. Curr Biol, 2005, 15（13）：1196-1200.

［33］Seo PJ, Park CM. MYB96-mediated abscisic acid signals induce pathogen resistance response by promoting salicylic acid biosynthesis in Arabidopsis［J］. New Phy, 2010, 186（2）：471-483.

［34］Ding ZH, Li SM, An XL, et al. Transgenic expression of MYB15 confers enhanced sensitivity to abscisic acid and improved drought tolerance in Arabidopsis thaliana［J］. Genetics and Genomics,2009, 36（1）：17-29.

［35］Van dES, Verhagen BW, Van DR, et al. MYB72 Is required in early signaling steps of rhizobacteria-induced systemic resistance in Arabidopsis［J］. Plant Physiology, 2008, 146（3）：1293-1304.