NSCLC相關(guān)的惡性胸腔積液中VEGF表達(dá)及臨床意義研究進(jìn)展

陳 瑤，盧宏達(dá)

（1.江漢大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430056；2.武漢市中心醫(yī)院 腫瘤科，湖北 武漢 430014）

近年來，隨著大氣污染的加重和吸煙的流行，肺癌發(fā)病率和病死率在全球范圍內(nèi)迅速增高。在我國眾多惡性腫瘤中，肺癌已經(jīng)成為名副其實(shí)的“癌癥第一殺手”。根據(jù)國家癌癥中心公布的Cancer Statistics in China，2015顯示，在男性腫瘤中，肺癌發(fā)病率約占四分之一，居首位［1］。其中非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是肺癌最為常見的類型，約占所有肺癌的85%［1］。惡性胸腔積液（malignant pleural effusion，MPE）是晚期NSCLC患者最常見的合并癥之一，常常通過胸水細(xì)胞學(xué)找到惡性細(xì)胞被診斷。MPE的診斷往往提示預(yù)后極差，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。已有證據(jù)顯示，肺癌相關(guān)性MPE患者生存期最短，卵巢癌最長，無法找到原發(fā)灶的MPE患者生存期介于上述兩者之間［2-3］。目前MPE治療方法有胸腔穿刺引流、胸腔置管引流、胸腔內(nèi)灌注化療等，但治療效果卻不盡如人意。因此對(duì)于MPE需要更好的治療方法。

VEGF是一種內(nèi)皮細(xì)胞生長因子，有6個(gè)等型，包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E和胎盤生長因子（PGF）［4］。在1939年，IDE等［5］提出血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth fac?tor，VEGF）由腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生。1971年，F(xiàn)OLKMAN［6］首先提出腫瘤生長的血管依賴性理論，即腫瘤的發(fā)生發(fā)展不僅與腫瘤細(xì)胞本身高度增殖的惡性潛能有關(guān)，更是離不開腫瘤周邊血管的支持，同時(shí)提出抗腫瘤血管生成可能起到抗腫瘤的作用。1983年，SENGER等［7］發(fā)現(xiàn)血管通透性因子（VPF）證實(shí)為血管內(nèi)皮生長因子。1989年，F(xiàn)ERRARA等［8］成功純化分離VEGF，并確立它在血管生成中的重要作用。1992年，F(xiàn)ERRARA等［9］又發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)VEGF受體。隨著腫瘤血管生成研究的不斷深入，VEGF被確認(rèn)為腫瘤血管生成中最重要的調(diào)控因子，也是引起血管通透性改變和內(nèi)皮細(xì)胞遷移的重要因子，參與腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的整個(gè)過程，主要通過激活宿主血管內(nèi)皮細(xì)胞，從而刺激腫瘤血管生成，為腫瘤惡性增殖提供必需的氧和營養(yǎng)物質(zhì)并為腫瘤轉(zhuǎn)移提供通路［10］。VEGF水平也被證實(shí)與NSCLC相關(guān)性MPE患者的預(yù)后相關(guān)，是調(diào)控NSCLC相關(guān)性MPE發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵介質(zhì)［11-12］。NSCLC細(xì)胞能夠產(chǎn)生VEGF促進(jìn)胸腔積液的形成、腫瘤的播撒和血管生長素的產(chǎn)生［13］。因此，VEGF在NSCLC引起的MPE的診斷、治療及預(yù)后等方面具有重大意義。

1 VEGF對(duì)MPE的診斷價(jià)值

MPE診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”是在胸水細(xì)胞沉淀物中找到惡性細(xì)胞，或在胸膜活檢組織中觀察到惡性細(xì)胞［3，14］。目前診斷MPE的方法有影像學(xué)、胸水細(xì)胞學(xué)、胸膜活檢術(shù)、某些腫瘤標(biāo)志物、分子生物技術(shù)等，見表1。但上述方法的敏感性和特異性有限［3，15-24］。因此，對(duì)于MPE仍需一個(gè)敏感度高和特異性強(qiáng)的診斷方法。

分子生物學(xué)技術(shù)補(bǔ)充了細(xì)胞學(xué)診斷MPE的不足，比如惡性積液VEGF和endostatin mRNA的表達(dá)水平顯著高于良性，同時(shí)VEGF mRNA的敏感性為82.6%，準(zhǔn)確性為84.3%。endostatin mRNA則特異性為100%。TTF-1 mRNA在MPE中檢出率為73.2%，敏感度為93%，特異度為100%，精確度為96.6%，在良性中則為0［19-22］。有研究者提出將VEGF作為診斷MPE的指標(biāo)。2016年FAFLIORA等［16］對(duì)VEGF作為MPE的診斷標(biāo)記物做了一項(xiàng)Meta分析，表明MPE患者積液和血清中較高水平的VEGF有顯著差異性，是鑒別良惡性胸腔積液一個(gè)有意義的生物標(biāo)志物。同時(shí)檢測(cè)VEGFR能夠提高診斷靈敏度［17］。有研究［18］顯示MPE中VEGF和內(nèi)皮抑素水平升高能提高與結(jié)核性胸腔積液相鑒別的靈敏度、特異性和準(zhǔn)確性。聯(lián)合檢測(cè)癌胚抗原（CEA）和VEGF對(duì)NSCLC相關(guān)的MPE的診斷有很大的應(yīng)用價(jià)值，但其研究有一定的局限性，仍需進(jìn)一步探索［24］。

表1 MPE的診斷方法Tab.1 Diagnostic methods for MPE

2 MPE新的病理機(jī)制——VEGF

近年來，STATHOPOULOS等［25］提出了一個(gè)如圖1所示的MPE病理機(jī)制模型，表明MPE是腫瘤細(xì)胞和宿主細(xì)胞相互作用的結(jié)果。多種效應(yīng)分子無論從宿主細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞均參與MPE的發(fā)病機(jī)制。一般可分為兩類：一類是免疫調(diào)節(jié)因子，包括白細(xì)胞介素-2（IL-2）、腫瘤壞死因子（TNF）和干擾素（IFN）；另一類是增加血管通透性的有效調(diào)節(jié)劑，如血管內(nèi)皮生長因子、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等。在這些效應(yīng)調(diào)節(jié)劑中，VEGF在胸腔積液的積聚中起著核心作用，通過使血管通透性增加和誘導(dǎo)血管生成來促進(jìn)MPE的發(fā)生發(fā)展。這些相互作用產(chǎn)生的免疫調(diào)節(jié)因子和誘導(dǎo)血管通透性的因子在MPE的形成中起了重要的作用。免疫調(diào)節(jié)因子包括白介素-2、腫瘤壞死因子（TNF）、干擾素（INF）等，誘導(dǎo)血管通透性的因子有VEGF、金屬基質(zhì)蛋白酶（MMPs）等，其中VEGF在胸膜腔液體累積中起了中心作用［26-28］。而針對(duì)VEGF、金屬基質(zhì)蛋白酶（MMPs）為靶點(diǎn)的治療（血管靶向治療）可能成為治療MPE的有效途徑。

圖1 MPE的病理機(jī)制Fig.1 Pathogenesis of MPE

VEGF是一種高度保守的同源二聚體糖蛋白，分子量從35至44 ku不等，能夠促進(jìn)血管增殖、分化、遷移、存活及芽管形成，引起血管通透性的改變，同時(shí)控制血管新生［8，29-30］。VEGF每個(gè)等型可與3個(gè)血管內(nèi)皮生長因子受體（VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3）的特定組合相結(jié)合而發(fā)揮多種生物學(xué)效應(yīng)［29，31］。具體來說，受體酪氨酸激酶包括VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3（也分別稱為Flt-1，KDR/FLK-1和flt-4）和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的受體介導(dǎo)了VEGF的生物學(xué)反應(yīng)，這些受體和通路在驅(qū)動(dòng)VEGF微陣列中起了中心作用［31］。VEGFR-2介導(dǎo)了VEGF的大部分血管生成反應(yīng)，包括通透性增加、遷移、侵襲和血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖［15］。VEGF/VEGFR-2相互作用可激活下游信號(hào)通路來調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，增加血管的通透性，引起局部水腫和炎癥反應(yīng)，從而促進(jìn)腫瘤血管的滲透和轉(zhuǎn)移［29，31］。也有很多上游機(jī)制引發(fā)VEGF在MPE中的表達(dá)，如VEGF基因的mRNA的可變剪接至少可產(chǎn)生6個(gè)剪接變異體（vegf121-206），具有不同的生物學(xué)效應(yīng)，從而促進(jìn)新生血管生成［32］。

在各種類型的肺癌中，特別是非小細(xì)胞肺癌中，VEGF有較高水平的表達(dá)［16-18］。VEGF表達(dá)水平受腫瘤局部多種因素的影響，如缺氧、多種生長因子（如表皮生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子、胰島素樣生長因子等）、多種激素等［33-34］。其中，缺氧能使缺氧誘導(dǎo)因子、轉(zhuǎn)錄因子等多種因子激活，多方面誘導(dǎo)血管生成［35］。如VEGF mRNA轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)后與缺氧誘導(dǎo)結(jié)合因子-1/芳基烴核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白啟動(dòng)子區(qū)的復(fù)合物結(jié)合而使VEGF高表達(dá)［36］。白細(xì)胞介素-6（IL-6）可觸發(fā)VEGF基因轉(zhuǎn)錄，而IL-6本身似乎是許多癌細(xì)胞中VEGF靶向基因［37-38］，因此，自分泌信號(hào)介導(dǎo)的IL-6可進(jìn)一步促進(jìn)VEGF在腫瘤中的分泌，尤其是在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中［39］。這也表明許多能誘導(dǎo)IL-6信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的刺激最終會(huì)觸發(fā)VEGF水平的升高［39］。

因此，VEGF主要通過增加血管通透性和促血管生成兩個(gè)方面來調(diào)控MPE的發(fā)生與發(fā)展，其中血管通透性增加是MPE形成的直接原因，促血管生成是間接原因。

3 VEGF靶向治療MPE研究進(jìn)展

MPE有效的治療仍然是目前臨床面臨的難題和挑戰(zhàn)。何種治療方式對(duì)于何種腫瘤引起惡性胸腔積液最為有效、最合適的給藥方法/劑量、給藥間隔、療程、長期效果以及聯(lián)合給用藥等均缺乏大樣本、隨機(jī)對(duì)照的臨床研究。近年來，隨著分子靶向藥物的研發(fā)，特別是抗腫瘤血管生成的靶向藥物，如針對(duì)血管生長因子的貝伐珠單抗、針對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的重組人血管內(nèi)皮抑素，為MPE的治療提供了新的方向［40］。

3.1 針對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的重組人血管內(nèi)皮抑素

3.1.1 研發(fā)背景 1997年，O′REINY等［41-42］從小鼠內(nèi)皮瘤中分離到血管內(nèi)皮抑素，含有184個(gè)氨基酸，分子量為20 ku，對(duì)誘導(dǎo)小鼠腫瘤血管生成幾乎具有完全抑制作用，顯示較強(qiáng)的抗血管活性，且毒副作用輕。國內(nèi)XU等［43］在Endostatin的基礎(chǔ)上加了9個(gè)氨基酸，使其藥用性能和療效得到顯著提高，成為國家I類新藥，從而研究開發(fā)了抗腫瘤分子靶向藥物重組人血管內(nèi)皮抑素注射液（Endostar商品名：恩度）。于2005年9月被SFDA批準(zhǔn)上市，2006年被《NCCN非小細(xì)胞肺癌臨床實(shí)踐指南（中國版）》收錄，與化療聯(lián)合用于復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移NSCLC的治療［44］，并在臨床上得到廣泛應(yīng)用。

3.1.2 恩度的抗血管生成機(jī)制 血管內(nèi)皮抑素可通過多種機(jī)制發(fā)揮抗腫瘤新生作用：①特異性地作用于新生血管的內(nèi)皮細(xì)胞并抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移，同時(shí)誘導(dǎo)其凋亡而發(fā)揮抗血管生成作用，間接導(dǎo)致腫瘤休眠或退縮［45］；②神經(jīng)纖毛蛋白-1（Neuropilin-1，NRP-1）與VEGF均可促進(jìn)腫瘤微血管生成，且兩者的表達(dá)呈正相關(guān)；SHICHIRI等［46］報(bào)道血管內(nèi)皮抑素可下調(diào)VEGF-A、Neuropilin-1等細(xì)胞因子，而這些細(xì)胞因子與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。阻礙內(nèi)皮細(xì)胞增生與機(jī)制蛋白的相互作用，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，同時(shí)還可以減少Bcl-2、Bcl-xl抗凋亡蛋白，引起內(nèi)皮細(xì)胞G1停滯，抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖；③可以與VEGF、bFGF等血管生成刺激因子競爭性結(jié)合生長因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中的硫酸肝素蛋白聚糖受體，從而抑制血管生成［47］；④可特異性識(shí)別并結(jié)合內(nèi)皮細(xì)胞表面整合素α5β1、αVβ3等，阻止內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)生黏附移行，抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移；誘導(dǎo)黏著斑激酶及樁蛋白的酪氨酸磷酸化作用，并且促進(jìn)黏著斑和肌動(dòng)蛋白彈性纖維的形成，從而干擾細(xì)胞-細(xì)胞間黏附，抑制腫瘤細(xì)胞的黏附侵襲［48］；⑤下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白MMP2/9的表達(dá)［49］。有小鼠模型研究表明，內(nèi)皮抑素過度表達(dá)可下調(diào)VEGF-C基因，抑制淋巴管生成和腫瘤轉(zhuǎn)移至鄰近淋巴結(jié)［50］。因此人重組血管內(nèi)皮抑素是一個(gè)多靶點(diǎn)抗血管生成的藥物，具有潛在研究前景。

3.1.3 臨床研究進(jìn)展 自2006年恩度上市以來，國內(nèi)已有多位學(xué)者將恩度應(yīng)用于腔內(nèi)注射治療惡性漿膜腔積液，近年來的臨床應(yīng)用認(rèn)為，恩度單用或聯(lián)合化療藥治療惡性漿膜腔積液是安全有效的［51-65］。2011-2013年QIN等［51］開展的腔內(nèi)應(yīng)用恩度和或順鉑治療惡性胸腹腔積液的多中心、隨機(jī)對(duì)照臨床研究初步結(jié)論顯示：恩度單藥治療惡性胸膜腔積液，安全有效；初治患者恩度組和恩度聯(lián)合順鉑組的療效優(yōu)于順鉑單藥組。2015年HU等［52］開展了一項(xiàng)重組人血管內(nèi)皮抑素（恩度）聯(lián)合順鉑和順鉑單藥腔內(nèi)化療治療惡性胸腔積液的臨床研究，該研究進(jìn)一步說明胸腔內(nèi)注射恩度聯(lián)合順鉑治療惡性胸腔積液療效較好、耐受性佳，能明顯改善患者的生活質(zhì)量。臨床上由NSCLC引起MPE最為常見，有許多學(xué)者開始探索恩度對(duì)NSCLC引起的MPE治療有效率，并有大量臨床數(shù)據(jù)顯示，恩度有效改善了NSCLC相關(guān)性MPE患者的生活質(zhì)量，療效肯定，不良反應(yīng)輕微，詳見表2［56-63］。

盡管恩度對(duì)包括NSCLC相關(guān)性MPE在內(nèi)的腫瘤進(jìn)展有明顯抑制作用，但目前其優(yōu)化劑量及治療持續(xù)時(shí)間頗具爭議。在目前臨床研究中，恩度均采用7.5 mg/m2，滴注3～4 h，1～14 d。試驗(yàn)研究顯示：恩度的抗腫瘤作用具有時(shí)間依賴性和濃度依賴性，隨著用藥時(shí)間的延長和血藥濃度的逐漸提高，抗腫瘤效果也逐漸提高［64］。KISKER等［55］的研究發(fā)現(xiàn)，給小鼠單側(cè)腹腔注射恩度，2 h內(nèi)恩度很快被清除。而通過微型滲透泵持續(xù)給藥能使血藥濃度長時(shí)間保持穩(wěn)定，而且以單次注射劑量的1/8就可以獲得同樣的效果，表明恩度持續(xù)給藥產(chǎn)生的療效好于相同劑量的短程靜脈給藥。因此，持續(xù)泵入給藥方式為進(jìn)一步提高恩度的抗腫瘤效果和效價(jià)比提供了新的思路。

3.2 針對(duì)血管生長因子的貝伐珠單抗

3.2.1 研發(fā)背景 2004年貝伐珠單抗（Bevacizumab）在國外獲得非小細(xì)胞肺癌適應(yīng)癥而上市。2015年ZHOU等［65］開展的BEYOND研究結(jié)果顯示了貝伐珠單抗在中國晚期或復(fù)發(fā)的非鱗癌NSCLC患者一線治療中的地位，且在具有VEGFR突變的人群也具有較大的優(yōu)勢(shì)。于2015年7月1日貝伐珠單抗被中國CFDA批準(zhǔn)用于非小細(xì)胞肺癌，也成為了世界上最暢銷的抗腫瘤藥物之一。

3.2.2 貝伐珠單抗的抗血管生成機(jī)制 VEGFA在內(nèi)皮細(xì)胞上的結(jié)合位點(diǎn)為VEGFR1和VEGFR2，是兩種受體酪氨酸激酶RTK。其中，VEGFR2在VEGFA介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、血管新生和血管通透性過程中起主要作用。VEGFA與VEGFR2結(jié)合能夠引起受體二聚化和自磷酸化，激活下游多種信號(hào)級(jí)聯(lián)通路［66］。貝伐珠單抗是一種人源化的抗VEGFA單克隆抗體，通過阻斷VEGFA與其受體結(jié)合，抑制其信號(hào)通路，從而控制胸腔積液的形成［67-68］。

表2 恩度治療NSCLC相關(guān)性MPE患者的臨床療效Tab.2 Clinical efficacy of Endostar in treatment of MPE in NSCLC patients

3.2.3 臨床研究進(jìn)展 日本一項(xiàng)多中心、單臂、開放性II期前瞻性臨床研究探討了貝伐珠單抗聯(lián)合紫杉醇/卡鉑靜脈注射治療未經(jīng)化療的伴有惡性胸腔積液的晚期非鱗NSCLC的療效［69］，結(jié)果顯示：伴有惡性胸腔積液的晚期非鱗NSCLC患者接受貝伐珠單抗聯(lián)合紫杉醇/卡鉑治療2～6個(gè)周期后，ORR為60.9%，DCR為87.0%，惡性胸腔積液控制率顯著高于單純化療組（91.3%和78.3%，P=0.08）［69］。國內(nèi)LI等［70］探索了局部使用貝伐珠單抗聯(lián)合鉑類治療惡性胸腔積液的療效。研究結(jié)果顯示：在全身紫杉醇化療的基礎(chǔ)上采用貝伐珠單抗聯(lián)合順鉑胸腔灌注治療惡性胸腔積液，有效減少了胸腔積液量，明顯減少胸腔灌注次數(shù)，提高了患者的生活質(zhì)量，安全性和耐受性良好。同時(shí)國內(nèi)還有許多研究也證實(shí)貝伐珠單抗對(duì)治療NSCLC相關(guān)MPE的安全有效性（見表3）［71-77］。因此，對(duì)于惡性胸腔積液的晚期NSCLC，采用貝伐珠單抗聯(lián)合含鉑雙藥化療靜脈注射，在治療原發(fā)腫瘤的同時(shí)，又能有效地控制惡性胸腔積液，值得臨床嘗試和進(jìn)一步探索。

表3 貝伐珠單抗治療NSCLC相關(guān)性MPE患者的臨床療效Tab.3 Clinical efficacy of Bevacizumab in treatment of MPE in NSCLC patients

4 VEGF對(duì)晚期NSCLC惡性胸腔積液預(yù)后的影響

NSCLC導(dǎo)致MPE形成的主要病理因素是胸膜腫瘤的侵襲［16-19］。VEGF是參與腫瘤侵襲和腫瘤生長全過程的關(guān)鍵因子［10-13］。研究表明，VEGF的表達(dá)水平也被證實(shí)與NSCLC相關(guān)性MPE患者預(yù)后相關(guān)，VEGF和內(nèi)皮抑素在胸腔積液中的水平連同血清中的內(nèi)皮抑素水平，是晚期NSCLC相關(guān)性惡性胸腔積液患者潛在的預(yù)后參數(shù)。重要的是，在一項(xiàng)多元回歸分析中顯示，胸水中VEGF和內(nèi)皮抑素水平及血清中的內(nèi)皮抑素水平被認(rèn)為是NSCLC相關(guān)性MPE患者獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)［78］，而且MPE中較高水平的VEGF提示有較高的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)［70］。也有研究認(rèn)為VEGF表達(dá)與NSCLC相關(guān)性MPE患者的年齡、腫瘤大小、殘余瘤多少以及化療方式無密切關(guān)系，與胸水、胸膜及其他部位轉(zhuǎn)移之間有無關(guān)系尚無一致觀點(diǎn)［45］。單一的VEGF不足以預(yù)測(cè)NSCLC相關(guān)性MPE患者的預(yù)后。這也說明，抗VEGF治療對(duì)NSCLC相關(guān)性MPE具有重要的治療價(jià)值，VEGF水平是晚期NSCLC相關(guān)性MPE患者的預(yù)后指標(biāo)之一［45］。

5 結(jié)語

綜上所述，VEGF在NSCLC相關(guān)性MPE中的表達(dá)研究，無論在診斷和臨床治療上都具有重要的意義。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，MPE的診斷在胸腔積液生化分析、細(xì)胞病理學(xué)和影像檢查等的基礎(chǔ)上取得了長足的進(jìn)步，分子生物學(xué)技術(shù)補(bǔ)充了細(xì)胞病理學(xué)的不足，提供了更多敏感性高和特異性強(qiáng)的指標(biāo)。MPE的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，VEGF在一定程度上揭示了MPE的形成機(jī)制，同時(shí)為MPE的治療提供了新的靶點(diǎn)。恩度和貝伐珠單抗在中國上市以來，大量研究證實(shí)，恩度和貝伐珠單抗等抗血管靶向治療藥物對(duì)NSCLC伴MPE的晚期腫瘤患者，不僅改善了患者的生活質(zhì)量，而且在一定程度上延長了患者生存期，然而準(zhǔn)確判斷胸水治療療效的標(biāo)準(zhǔn)仍然是面臨的重要問題，需要更多的大樣本研究來進(jìn)一步證實(shí)。目前，越來越多靶向藥物的問世，為晚期腫瘤患者改善生活質(zhì)量及延長生存期帶來新希望。

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