移植免疫與器官再生的研究進展

劉泉，齊忠權(quán)（.哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院硬組織發(fā)育與再生實驗室，黑龍江哈爾濱 50086；2.廣西大學醫(yī)學院，廣西壯族自治區(qū) 南寧 530004；3.廈門大學醫(yī)學院，福建 廈門 3602）

在臨床移植手術(shù)和免疫抑制取得巨大成功后的數(shù)十年間，同種移植免疫領(lǐng)域堪稱突破的進展較少。異種移植由于排斥和感染等障礙舉步維艱，令很多研究者失去興趣。器官再生研究盡管方興未艾，但距離解決人類的實際問題還有相當長的路要走。近年來，隨著干細胞技術(shù)和基因編輯技術(shù)的發(fā)展，移植與再生領(lǐng)域取得了巨大發(fā)展。在此，我們對科學意義和應用前景較為突出的進展加以評述，掛一漏萬乃至謬誤之處，懇請同行指正。

近年來，移植領(lǐng)域令人矚目的進展之一是異種移植的“復興”，使異種移植真正成為了器官移植的未來［1］。這主要歸功于基因修飾技術(shù)，特別是CRISPR/Cas技術(shù)的發(fā)展。一方面，基因修飾技術(shù)可消除供者異種抗原表達，并使供者細胞表達保護性分子。例如，基因修飾豬-非人靈長類生命支持性腎移植后，已實現(xiàn)受者長期存活［2-3］?；蛐揎椮i-狒狒異位心臟移植，采用αCD40單抗為基礎(chǔ)的免疫抑制治療，實現(xiàn)了移植物長期存活［4］。由于尚未有異種原位心臟移植長期存活的動物實驗，在開展臨床試驗之前，應證明異種原位心臟移植能夠較長時間發(fā)揮生命支持作用；另一方面，通過CRISPR/Cas9技術(shù)滅活豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒（porcine endogenous retrovirus，PERV）是異種移植近年的重要突破。盡管外源性病毒可以在豬的飼養(yǎng)繁殖過程中通過各種手段加以清除，但PERV整合在豬的基因組中，缺乏有效的清除方法。Yang等［5］采用CRISPR/Cas9 技術(shù)破壞了PK15細胞（一種豬胚胎腎細胞系）基因組內(nèi)62個PERV pol基因的高度保守區(qū)域，從而使PK15細胞喪失了令HEK 293細胞（一種人胚胎腎細胞系）感染PERV的能力。繼而，研究人員證明了PERV可以從豬細胞傳播至人細胞，并可在人細胞之間相互傳播［6］。更重要的是，研究人員采用CRISPR/Cas9技術(shù)滅活了豬胚胎原代成纖維細胞的PERV，并通過體細胞核轉(zhuǎn)移獲得豬胚胎，最終得到了全基因組滅活PERV的健康仔豬［6］。盡管異種移植還有諸如免疫排斥及生理相容性等問題需要解決，這兩項研究成果無疑對提高異種移植的安全性具有重要的意義，使異種移植向臨床應用邁進了一大步。

在同種移植領(lǐng)域，有兩項值得關(guān)注的進展。第一個是遺傳學在臨床同種移植中的應用。移植排斥從根本上講是由于供者和受者之間基因，特別是人類白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）基因的不同。近年來，隨著二代測序（next-generation sequencing，NGS）準確率和效率的提高以及成本的下降，采用NGS進行HLA分型將成為未來的發(fā)展趨勢［7-8］。全基因組關(guān)聯(lián)分析（genome-wide association study，GWAS）作為發(fā)掘遺傳因素對表型影響的有力工具，在移植排斥、免疫抑制藥代動力學和移植后新發(fā)糖尿病等方面得到一定應用［9-12］。供者表觀遺傳學特征如DNA甲基化和組蛋白的修飾，已被證明與缺血/再灌注損傷和移植物存活相關(guān)［13］。受者表觀遺傳學特征對移植排斥、免疫抑制治療及其誘發(fā)疾病等方面影響的研究多圍繞基因如FOXP3的DNA去甲基化，為早期診斷提供線索［13-15］；第二個進展來自同種移植抗原遞呈途徑的研究?！靶蜇炄毎蹦Ｐ停碩輔助細胞 （T helper cells，Th） -樹突狀細胞（dendritic cells，DC）-細胞毒性T細胞（cytotoxic T cells，CTL），是CTL識別抗原、接受輔助并活化的途徑［16-18］。然而，移植領(lǐng)域既往的研究認為，受者間接途徑特異性Th與受者DC在二級淋巴器官內(nèi)相互作用，而受者直接途徑CTL只能識別移植物細胞上的抗原，這樣的“四細胞”模型顯然與“三細胞”模型相悖。研究人員為解決這個問題提出了半直接途徑的概念［19］，但缺乏物質(zhì)基礎(chǔ)和器官移植實驗的證明。近來有體內(nèi)實驗數(shù)據(jù)支持半直接途徑在移植排斥中的重要作用，即完整的供者MHC-肽復合物轉(zhuǎn)運至受者DC從而激活受者的CD4和CTL，而非供者DC直接接觸活化受者T細胞［20-22］。供者MHC-肽復合物以供者DC產(chǎn)生的外泌體為載體進行轉(zhuǎn)運［20-21］，也有研究認為前者可來源于移植物實質(zhì)細胞［22］。以上進展為診治同種移植排斥反應提供了新思路。

誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）曾為器官再生帶來希望［23］。然而，通過iPSC在體外構(gòu)建實體臟器的研究進展非常緩慢［24］。物種間嵌合體的應用打破了這個困境［25］，成為近年來器官再生領(lǐng)域的亮點之一，有望產(chǎn)生來自患者自身細胞的器官用于移植［24］。通過構(gòu)建人-動物嵌合體獲得人的器官，首先要通過基因修飾去除動物體內(nèi)的特定器官，從而為人器官發(fā)育提供所需的“巢”。然后將人的多能干細胞（pluripotent stem cell，PSC）引入動物早期胚胎內(nèi)發(fā)育為嵌合體。發(fā)育成熟后，獲取人的器官。目前已知，物種之間進化距離近的容易獲得嵌合體，如小鼠與大鼠之間。已經(jīng)實現(xiàn)將小鼠-大鼠嵌合獲得的小鼠胰腺細胞，用于治療同品系小鼠鏈脲霉素（streptozocin，STZ）誘導的糖尿?。?6］。進化距離遠的較難構(gòu)建嵌合體，如人和豬之間。研究人員采用不同狀態(tài)的人PSC初步驗證了人-豬嵌合的總體水平，但是嵌合率只有1/100000［27］。而化學方法處理的人PSC能夠使人-小鼠嵌合率達到1/100［28］。這種PSC在人-豬嵌合實驗中的表現(xiàn)值得期待。結(jié)合前述滅活PERV豬的進展，在不遠的將來人-豬嵌合體有望成為移植器官的重要來源。當然，前提是人-動物嵌合的倫理問題得到妥善解決。

數(shù)十年科技、臨床和制造業(yè)發(fā)展成果的累積正在拉開新一輪科技革命的大幕。移植和再生領(lǐng)域的革命性進步也同樣呼之欲出。我國科技、臨床工作者與企業(yè)應當緊密合作，奮力抓住這次機遇，從科學研究、技術(shù)研發(fā)、應用轉(zhuǎn)化和產(chǎn)業(yè)化等角度占領(lǐng)制高點。此外，可以預見的是，異種或人-動物嵌合體來源組織器官的應用將會引起醫(yī)學倫理、政策法規(guī)和社會共識等方面的問題與爭論。我國科技和醫(yī)藥衛(wèi)生行政主管部門應引導掃清這些障礙，造福人類。