間充質(zhì)干細胞促進肝再生的研究進展

侯賓，宋紅麗，沈中陽（. 天津醫(yī)科大學(xué)一中心臨床學(xué)院，天津 300070；. 天津市第一中心醫(yī)院器官移植中心，天津市器官移植重點實驗室，天津 3009）

肝臟發(fā)源于胚胎內(nèi)胚層［1］，成體以后，肝臟修復(fù)、再生可通過3個途徑完成：① 通常肝組織成熟肝細胞經(jīng)過有絲分裂，使肝臟體積和功能得到恢復(fù)；② 當肝臟嚴重受損時，可激活卵圓細胞增殖、分化為肝細胞和膽管上皮細胞；③ 通過骨髓干細胞的參與，骨髓干細胞是肝細胞的重要肝外來源，在特定環(huán)境下可分化成肝干細胞及肝細胞，從而參與肝功能的修復(fù)和重構(gòu)［2］。干細胞分為造血干細胞（hematopoietic stem cell，HSC）和間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cell，MSC）。

MSC是干細胞家族的重要成員，是從間充質(zhì)組織如骨髓（bone mesenchymal，BM）、脂肪組織、臍帶和牙髓中收集的成纖維細胞樣、平板附著細胞，具有自我更新和從不同胚層分化為成體細胞的能力［3-7］。第一次報道MSC時提及，在細胞因子混合物存在的情況下骨髓間充質(zhì)干細胞（bone mesenchymal stem cell，BMSC）能夠分化為成骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞［8］。研究顯示，來自幾乎所有部位的間充質(zhì)組織的MSC都可以通過基因?qū)牖蚣毎蜃诱T導(dǎo)分化成3個胚層的細胞。例如，MSC在體外能夠分化成內(nèi)皮細胞［9］、心肌細胞［10］、骨骼肌細胞［11］、肝細胞［12］、神經(jīng)元細胞、上皮細胞、外周神經(jīng)膠質(zhì)細胞和胰島素分泌細胞等［13］。MSC可以通過分泌細胞因子［14-17］、細胞融合［18］轉(zhuǎn)分化為肝細胞［14，16，18-19］以及通過微泡和細胞物質(zhì)的轉(zhuǎn)移［20］等機制來減少炎癥和免疫反應(yīng)，刺激肝細胞增殖和肝內(nèi)血管生成、抑制肝細胞調(diào)亡等形式促進肝再生［14，18-19，21-25］。本文主要從免疫、細胞因子、轉(zhuǎn)分化及載基因等方面概述MSC促進肝再生的研究。

1 MSC通過免疫介導(dǎo)促進肝再生

MSC可以潛在地與多種免疫細胞相互作用促進干細胞再生，包括作用巨噬細胞、NK細胞、樹突狀細胞（dendritic cell，DC）等［26］。

1.1 巨噬細胞介導(dǎo)的肝再生途徑：MSC能夠激活巨噬細胞分泌集落刺激因子（macrophage colony stimulating factor，M-CSF）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白介素 - 6（interleukin 6，IL-6）［22］。而巨噬細胞消耗實驗證實，巨噬細胞耗竭的情況下，肝損傷小鼠肝臟的再生率受到極大的損害，表明巨噬細胞可能參與肝再生［27］。由此可以推斷，MSC能夠通過巨噬細胞為肝細胞增殖提供初始啟動力，從而促進肝再生［17，28］。

1.2 NK細胞介導(dǎo)的肝再生途徑：使用聚肌苷-聚胞苷酸（polyinosinic-polycytidylic acid，Poly I-C）激活NK細胞時，肝臟再生功能受到影響，而減少NK細胞可以增加肝臟再生率，表明NK細胞可能參與肝再生［27］。在γ-干擾素（interferon-γ，IFN-γ）抵抗的小鼠中，IFN-γ對肝再生的阻滯作用被認為是由肝細胞中的抗增殖蛋白如STAT1、IRF-1和p21cip1/waf1介導(dǎo)［29］。這說明肝臟NK細胞的作用是抑制而不是促進肝臟再生，這種抑制作用很可能是通過NK細胞分泌的IFN-γ介導(dǎo)的［30-31］。研究發(fā)現(xiàn)，MSC與NK細胞在體外能夠相互作用，當靜息的NK細胞被活化，白細胞介素-2（interleukin-2，IL-2）激活，其表面受體表達水平增加。而MSC能夠抑制NK細胞表面的主要活化受體，進一步對NK細胞達到抑制作用［27-28］。因此，通過減少NK細胞，MSC能促進肝再生［32-33］。

1.3 DC介導(dǎo)的肝再生途徑：DC在肝臟內(nèi)分布較稀疏，但在肝損傷后，肝臟DC數(shù)量急劇增加，表明這些細胞在肝再生過程中可能起作用［34］。同時在部分肝切除動物模型中，刺激DC可以促進白細胞介素-10（interleukin -10，IL-10）的產(chǎn)生，增強雌激素受體的表達，作用于免疫系統(tǒng)，調(diào)節(jié)局部炎癥反應(yīng)。同時DC也可以抑制T細胞的產(chǎn)生，降低炎癥水平，并通過NK細胞介導(dǎo)的肝再生途徑，發(fā)揮生物學(xué)作用，從而促進肝再生［34-35］。MSC能夠刺激受損肝臟內(nèi)的DC生成，降低炎癥反應(yīng)，從而促進肝細胞增殖［36］。

1.4 其他免疫因素介導(dǎo)的肝再生途徑：除了以上途徑，MSC受到炎性細胞因子的影響時，能夠趨化性遷移到發(fā)炎的組織，并通過其在先天性免疫以及適應(yīng)性免疫兩個水平上調(diào)節(jié)局部炎癥反應(yīng)［31，37-39］。當病原體入侵人體后，機體防御機制可以分為先天性和適應(yīng)性免疫。

先天性免疫主要依靠巨噬細胞、DC和NK細胞等作為其細胞效應(yīng)物，通過先天模式識別受體（innate pattern recognition receptors，PRR）識別病原體，從而快速激活機體防御機制（包括細胞因子和趨化因子的產(chǎn)生、吞噬作用和其他抗微生物殺傷機制），呈遞抗原至適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。而適應(yīng)性免疫系統(tǒng)由T淋巴細胞和B淋巴細胞組成，識別特異性抗原，從而誘導(dǎo)記憶細胞，產(chǎn)生免疫反應(yīng)［40］。

在先天性免疫方面，MSC通過局部分泌某種介質(zhì)直接抑制MSC附近免疫細胞的增殖，同時通過影響前列腺素和生長因子 （如血管內(nèi)皮生長因子、角質(zhì)形成細胞生長因子和肝細胞生長因子等）的分泌，間接影響免疫調(diào)節(jié)和修復(fù)［41］。在適應(yīng)性免疫方面，MSC則可以通過抗炎Th-2免疫激活，或在IL-10影響下直接誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細胞產(chǎn)生，降低炎癥反應(yīng)［42］。

總之，通過上述途徑，MSC能夠通過刺激巨噬細胞和DC生成，降低NK細胞，減少NK細胞的增殖，減少肝損傷部位的炎癥反應(yīng)，促進肝再生［36］。

2 MSC通過信號傳導(dǎo)促進肝再生

MSC可以通過旁分泌信號途徑釋放各種細胞因子，調(diào)節(jié)炎癥和免疫反應(yīng)，減少肝損傷，刺激肝細胞增殖，從而促進肝再生［14-17］。MSC具有分化為多種細胞類型的潛力，包括成骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞，這些細胞能夠分泌肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）。通過小鼠敲除實驗發(fā)現(xiàn)，HGF結(jié)合酪氨酸激酶受體（cMET受體）后，通過三種信號傳導(dǎo)通路，包括ERK1/2、p38-MAPK和PI3K/Akt通路，啟動細胞信號傳導(dǎo)，在肝組織再生、發(fā)育和增殖中起作用［43］。

2.1 Ras-ERK1/2介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)通路：研究證明，Ras依賴的細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（Ras-ERK1/2）途徑受到HGF / cMET的影響，主要通過促進有絲分裂發(fā)生作用，促進細胞增殖［44］。

2.2 P38/MAPK 介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)通路：HGF與cMET受體的結(jié)合啟動小膜連接的GTP酶Ras的活化。激活Ras能夠進一步激活Raf，后者可以誘導(dǎo)絲裂原活化蛋白激酶/細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（mitogen-activated protein kinase/extracellular signal regulated kinase，MAPK/MEK）的活性。通過MEK3 / 63的信號級聯(lián)反應(yīng)能夠磷酸化p38，后者被認為是涉及應(yīng)激反應(yīng)的促分裂原活化蛋白激酶［45］。由此可見，P38/MAPK可以指導(dǎo)肝細胞應(yīng)答，促進肝細胞生成。

2.3 PI3K/Akt介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)通路：磷脂酰肌醇-3激酶（phosphatidylinositol-3 kinase，PI3K）與蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/Akt）結(jié)合形成PI3K/Akt通路。Akt的作用是通過增加細胞存活因子防止細胞調(diào)亡。在HGF與cMET受體結(jié)合以及隨后的受體二聚化和自體磷酸化之后，被激活的受體募集信號分子Gab-1，其與PI3K相關(guān)聯(lián)。與PI3K的締合引發(fā)磷脂酰肌醇3，4-磷酸（phosphatidylinositol 3，4-biphosphate ，PIP2）和磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸 （phosphatidylinositol 3，4，5-triphosphate，PIP3）的產(chǎn)生，并進一步產(chǎn)生第二信使肌醇三磷酸（inositol triphosphate，IP3），從而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。因此，PI3K/Akt介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)通路能夠作用于肝細胞再生周期的調(diào)節(jié)［45-46］。

HGF/cMET系統(tǒng)可以通過以上3種通路，引起下游信號級聯(lián)反應(yīng)，其通過多種途徑發(fā)揮作用從而產(chǎn)生生物效應(yīng)，促進肝細胞增殖。再生完成后cMET被泛素化并降解，從而阻止HGF/cMET的恒定信號，阻斷其信號通路。而當HGF信號途徑中斷時，肝臟的尺寸較小并且呈現(xiàn)廣泛的細胞死亡［47］。且研究表明HGF過表達的MSC有助于肝細胞再生。綜上所述，HGF可以通過上述3條信號傳導(dǎo)通路的激活，調(diào)節(jié)肝細胞生長、存活、運動、遷移、有絲分裂，并且在肝再生中發(fā)揮重要的作用。

此外，MSC通過旁分泌方式，能夠調(diào)節(jié)SDF-1 / CX趨化因子，釋放其他細胞因子，如胰島素樣生長因子（insulin like growth factors-1，IGF-1）、基質(zhì)細胞衍生因子-1（stromal cell derived factor-1，SDF-1）和CXC趨化性細胞因子受體-4（C-X-C chemokine receptor type 4，CXCR-4）軸［48-49］。其中IGF-1是人體代謝的重要因子，使用過量表達IGF-1的重組腺病毒能夠增加肝臟中HGF的分泌，減少肝細胞調(diào)亡并促進小鼠肝細胞增殖，改善小鼠的肝損傷。同時，BM衍生的AdIGF-I-MSC在肝臟中的應(yīng)用可以導(dǎo)致IGF-I和HGF表達增加，減少肝細胞損傷，促進肝再生［50-51］。MSC的旁分泌信號中還存在一種被稱為外泌體的重要信使，能夠誘導(dǎo)肝細胞轉(zhuǎn)變?yōu)楦温褕A細胞，加速肝臟再生，減少肝損傷［52］。

3 MSC通過直接轉(zhuǎn)分化促進肝再生

3.1 MSC轉(zhuǎn)分化的細胞學(xué)基礎(chǔ)：研究表明，MSC能夠直接轉(zhuǎn)分化為肝細胞，促進肝再生［14，16，18-19］。在對MSC促進肝再生的機制研究過程中發(fā)現(xiàn)了一種獨特的細胞，被命名為多系分化持續(xù)應(yīng)激細胞（multilineage differentiating stress enduring cell，Muse）［4，53］。Muse 細胞具有不易癌變、自我再生的特點。在重癥聯(lián)合免疫缺陷（severe combined immunodeficiency，SCID）小鼠的暴發(fā)性肝炎模型中，Muse細胞通過血管滲透到受損的肝臟，與肝細胞整合后可以自發(fā)分化成肝細胞，并促進肝臟組織修復(fù)。與其他干細胞相比，Muse細胞的獨特之處在于Muse細胞是導(dǎo)入到體內(nèi)后自發(fā)分化成類似于功能性人類肝細胞的細胞，而不是在導(dǎo)入前被誘導(dǎo)成肝細胞［54］。此外，Muse細胞在早期階段也可以作為肝干細胞進行整合，在肝部分切除模型中自發(fā)分化為肝細胞、膽管細胞、竇狀內(nèi)皮細胞和庫普弗細胞等主要的肝臟成分，修復(fù)廣泛損傷的組織和器官從而參與肝再生［54］。重要的是，MSC以外的其他細胞不具有這些多能屬性。這表明Muse細胞可能參與MSC的轉(zhuǎn)分化途徑［54-55］。

3.2 促進MSC轉(zhuǎn)分化作用：研究證實，Wnt /β-連環(huán)蛋白信號傳導(dǎo)途徑在調(diào)節(jié)人類MSC參與的肝細胞分化中起重要作用［56］。在Wnt信號傳導(dǎo)激活后，β-連環(huán)蛋白將轉(zhuǎn)位進入細胞核并共同激活下游轉(zhuǎn)錄因子從而調(diào)節(jié)MSC的分化。此外，間充質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)變和相反的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)變以及表觀遺傳修飾（如DNA甲基化和組蛋白乙酰化）也在MSC向肝細胞分化中起重要作用［36，55，57］。上述途徑最終都將參與MSC的分化，促進MSC向肝細胞轉(zhuǎn)變，從而誘導(dǎo)肝再生。

4 MSC通過載入基因促進肝再生

MSC可作為一種轉(zhuǎn)基因載體，攜帶某種促進肝細胞再生的基因進入受體，并且使該基因能夠在受體內(nèi)持續(xù)穩(wěn)定表達發(fā)揮作用［58］。

MicroRNA-27b是位于C9orf3基因9q22.1染色體上的基因內(nèi)微小RNA，參與影響血管生成、細胞增殖、轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)過程［55］。有實驗證明，MicroRNA-27b轉(zhuǎn)染脂肪來源MSC（adiposederived stem cell，ASC）后，能夠通過以下途徑提高ASC的肝再生能力［59］。在基因水平上，MicroRNA-27b能夠促進ASC中血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）的表達。HO-1不僅直接增加ASC對HGF的分泌，刺激肝細胞增殖，而且介導(dǎo)IL-1受體拮抗劑（interleukin -1 receptor antagonist ，IL-1Ra）和成纖維細胞生長因子-21（fibroblast growth factor-21，F(xiàn)GF-21）的分泌。而IL-1Ra和FGF-21則是肝臟損傷后肝臟再生和保護的重要因子。此外，PGC-1α能夠促進ASC分泌抗炎和細胞保護因子，通過旁分泌途徑發(fā)揮作用。因此，轉(zhuǎn)染MicroRNA-27b的ASCs能夠增強抗炎、保護肝臟，促進肝再生。另一個已知的細胞調(diào)亡抑制基因（B cell lymphoma-2，bcl-2）基因，能夠激活肝星狀細胞，改善肝纖維化［57，60］。研究表明，過表達bcl-2基因的BMSC能促進肝細胞樣細胞的分化，促進肝硬化大鼠肝功能的恢復(fù)［51］。由此可見，過表達bcl-2基因的BMSC在促進肝再生方面也有著應(yīng)用前景。

5 展 望

綜上所述，MSC能夠通過免疫系統(tǒng)、相關(guān)信號通路、細胞因子、轉(zhuǎn)分化、轉(zhuǎn)載相關(guān)基因等刺激肝細胞增殖，從而達到降低組織的炎癥反應(yīng)和促進肝再生的目的。但是目前MSC的臨床應(yīng)用仍存在一些問題，如MSC的獲得效率、最佳的轉(zhuǎn)入途徑、體內(nèi)分化等，仍需要進一步深入研究。