活性葉酸對不良妊娠治療效果研究

梅 瑾，王 昊，盧 莎，張艷珍，陳益明，張 聞，殷一旋，毛愛芬

(杭州市婦產(chǎn)科醫(yī)院 杭州市婦幼保健院產(chǎn)前診斷/篩查中心，浙江 杭州310008)

近年的研究發(fā)現(xiàn)，我國的不良妊娠結(jié)局發(fā)生率較高，占妊娠總數(shù)的5%～20%[1]。不良妊娠結(jié)局包括流產(chǎn)、死胎、早產(chǎn)、胎兒畸形及先天性出生缺陷等，嚴重影響人口健康素質(zhì)和社會經(jīng)濟發(fā)展。葉酸是母體與胎兒間營養(yǎng)交換的重要物質(zhì)，低血漿葉酸水平與不良妊娠結(jié)局風險增加相關(guān)[2]。亞甲基四氫葉酸還原酶(5,10-methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)是葉酸代謝過程中的關(guān)鍵酶，該基因多態(tài)性常導(dǎo)致葉酸代謝功能受損，并與胎兒先天畸形、自然流產(chǎn)等關(guān)系密切[3]。因此，目前的治療主要通過補充葉酸來爭取降低不良妊娠結(jié)局的發(fā)生率[4]，但對是否采用活性葉酸補充存在爭議。本課題通過探討活性葉酸與普通葉酸補充對不良妊娠結(jié)局改善的有效性，來分析葉酸補充在不良妊娠治療中的作用地位，結(jié)果報道如下。

1對象與方法

1.1研究對象

選取2014年4月至2016年4月于杭州市婦產(chǎn)科醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心就診，曾有不良妊娠結(jié)局的育齡期婦女為研究對象，不良妊娠結(jié)局的類型包括：自然流產(chǎn)、胚胎停育、神經(jīng)管缺陷、無腦兒、腦積水、腦癱、染色體病、先天性智力低下、先天性心臟病、唇腭裂、多發(fā)畸形等。所有研究對象經(jīng)過一般問診和查體之后，均需符合以下要求：①婦科檢查、B 超檢查等已排除生殖系統(tǒng)解剖畸形；②無甲狀腺功能亢進/減退、糖尿病等內(nèi)分泌相關(guān)疾病； ③TORCH 優(yōu)生五項檢查陰性； ④生殖免疫檢測為陰性；⑤ABO及Rh血型無溶血；⑥無家族性遺傳病史；⑦無惡性腫瘤及其他全身性疾病。采用前瞻性隨機雙盲的研究方法，研究對象、發(fā)藥及隨訪的醫(yī)療人員均不知曉患者所服用葉酸的種類。將研究對象隨機分成活性葉酸組與普通葉酸組，前組每日服用活性葉酸0.8mg，后組每日服用普通葉酸0.8mg。活性葉酸組年齡(19～38)歲，平均年齡(29.57±3.63)歲，體質(zhì)指數(shù)為(22.78±2.34)kg/m2；普通葉酸組年齡(21～40)歲，平均年齡(29.45±3.96)歲，體質(zhì)指數(shù)為(22.59±1.92)kg/m2。兩組年齡、體質(zhì)指數(shù)均無統(tǒng)計學(xué)差異(均P>0.05)。所有研究對象隨訪至胎兒出生。服用葉酸6個月內(nèi)懷孕且為非不良妊娠結(jié)局者認為治療有效。最終完成隨訪的活性葉酸組共122例，普通葉酸組共120例。

1.2標本采集

在征得受檢者知情同意并簽字后，進行基因診斷分析。對受檢者空腹抽取外周靜脈血2mL，加入含乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetie acid，EDTA)抗凝劑的采血管內(nèi)混勻。

1.3方法

采用前瞻性隨機雙盲的研究方法?；钚匀~酸組：給予甲基葉酸片(商品名Jarrow Formulas Methyl Folate，每片含甲基四氫葉酸葡萄糖銨鹽0.400mg)口服，每天1次，每次2片。普通葉酸組：給予復(fù)合葉酸片(Elevit Pronatal，商品名愛樂維，國藥準字號：H20140354，每片含葉酸0.800mg)口服，每天1次，每次1片。

1.3.1 DNA提取

從外周靜脈血中提取脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)所用的DNA微量樣本基因組提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司，操作步驟按照試劑盒說明書進行。同時抽取1名健康對照者外周血及1份無核酸蒸餾水為對照同時進行DNA提取操作，確保提取操作無誤。

1.3.2 熒光定量PCR檢測MTHFR基因

采用熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(quantitative polymerase chain reaction，PCR)技術(shù)來分析MTHFR基因C677T和A1298C兩個位點單核苷酸多態(tài)性的基因型。實驗反應(yīng)體系中：探針工作液2μL、引物工作液1μL、5X Light Cycler master mix 4μL、分子級無菌水 10μL、DNA 3μL。qPCR擴增循環(huán)條件為：95℃，預(yù)變性10min，1個循環(huán)；95℃變性5s，57℃退火10s，72℃延伸15s，45個循環(huán)；qPCR結(jié)束后溶解曲線的條件為：95℃ 1min，45℃ 1min，45℃～68℃以0.14℃/s的升溫速率進行溶解曲線分析且在此階段采集熒光信號。反應(yīng)結(jié)束后通過LightCycle480的Gene Scanning軟件(Version 1.5)對HRM曲線進行分析。每次檢測同時帶有3個標準品及2個陽性對照，以及1個陰性對照。采用雙盲對所有樣本進行分型，并從所有樣本中隨機抽提10%的樣本進行重復(fù)驗證。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計軟件SPSS 20. 0進行統(tǒng)計學(xué)分析。運用卡方檢驗對兩組MTHFR C677T和A1298C兩位點的基因型頻率分布、等位基因頻率分布及出生結(jié)局進行比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

活性葉酸組共有122例研究對象完成最終隨訪，普通葉酸組為120例，兩組的葉酸基因多態(tài)性分布無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0. 05)。經(jīng)過葉酸治療后，活性葉酸組的妊娠人數(shù)較普通葉酸組高，有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0. 05)；在再次妊娠結(jié)局為不良妊娠的結(jié)果中，活性葉酸組顯著少于普通葉酸組(P<0.01)，見表1。對再次妊娠為正常妊娠的病例中進行C677T和A1298C基因多態(tài)性比較發(fā)現(xiàn)，C677T位點為CC野生純合型及A1298C為AA野生純合型的患者，兩組的正常妊娠率比較均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0. 05)；C677T位點的TT突變純合型、CT突變雜合型、A1298C位點的CC突變純合型的患者，活性葉酸組的妊娠率顯著高于普通葉酸組(P<0. 01)；活性葉酸組中，A1298C位點的AC雜合型的患者妊娠率也較普通葉酸組高(P<0. 05)，見表2。

表1兩組C677T和A1298C兩位點基因型頻率分布及葉酸治療后兩組妊娠及不良妊娠比較[n(%)]

Table 1 Comparison of genotype frequency distribution of C677T and A1298C locus and normal pregnancy rate/adverse pregnancy rate after treatment in two groups [n(%)]

項目活性葉酸組(n=122)普通葉酸組(n=120)χ2PC677T基因型0．0710．965CC39(31．97)40(33．33)CT51(41．80)50(41．67)TT32(26．23)30(25．00)A1298C基因型0．0510．975AA61(50．00)59(49．17)AC37(30．33)36(30．00)CC24(19．67)25(20．83)妊娠人數(shù)98(80．33)83(69．17)3．9970．046再次妊娠結(jié)局為不良妊娠5(0．51)15(18．07)7．6920．006

表2兩組C677T和A1298C基因多態(tài)性與葉酸治療后正常妊娠關(guān)系[n(%)]

Table 2 Association between normal pregnancy after treatment and C677T and A1298C gene polymorphism in two groups [n(%)]

項目活性葉酸組(n=93)普通葉酸組(n=68)χ2PC677T基因型 CC23(58．97)25(62．50)0．1030．748 CT42(82．35)29(58．00)7．1710．007 TT28(87．50)14(46．67)11．8140．000A1298C基因型 AA42(68．85)34(57．63)1．6270．202 AC30(81．08)21(58．33)4．4850．034 CC21(87．50)13(52．00)7．2650．007

3討論

3.1 5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因的多態(tài)性

人類MTHFR基因是葉酸代謝的關(guān)鍵酶，位于人類染色體1p36.3，編碼656個氨基酸，包括11個外顯子和10個內(nèi)含子。MTHFR基因編碼的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化5，10-亞甲基四氫葉酸為5-甲基四氫葉酸，為機體的正常甲基化過程提供甲基基團。目前研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)MTHFR基因有近20種基因多態(tài)性突變位點，其中最具有臨床意義的兩個突變位點是C677T和A1298C。C677T多態(tài)性突變?yōu)镸THFR基因第4外顯子的第677位核苷酸上胞嘧啶(cytosine，C)突變?yōu)樾叵汆奏?thymine，T)，表現(xiàn)為3種基因型，即CC、CT和TT型。A1298C多態(tài)性突變?yōu)镸THFR基因第7外顯子上的第1298位核苷酸上腺嘌呤(adenine，A)被C替代，表現(xiàn)為3種基因型，AA、AC和CC型。

3.2 5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因的多態(tài)性及其與不良妊娠結(jié)局的相關(guān)性

葉酸是體內(nèi)重要的甲基供體，葉酸代謝途徑的正常運轉(zhuǎn)對于維持DNA正常甲基化和DNA從頭合成以及DNA修復(fù)是至關(guān)重要的。MTHFR基因C677T基因的CT雜合型突變可使酶的活性下降35%，TT純合型突變更可使酶的活性下降70%，這一基因多態(tài)性影響葉酸的正常代謝，進而引起DNA低甲基化，干擾DNA合成和DNA損傷修復(fù)，造成DNA鏈斷裂、染色體重組改變和分離異常。孕婦對葉酸的需求量為正常人的2～3倍，一旦MTHFR基因發(fā)生風險突變而導(dǎo)致其對葉酸的利用能力降低，容易導(dǎo)致胎兒神經(jīng)管畸形及唇腭裂、唐氏綜合征，以及自發(fā)性流產(chǎn)、胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩、早產(chǎn)及新生兒低出生體質(zhì)量等葉酸代謝相關(guān)的疾病發(fā)生風險增高[5]。

3.3活性葉酸治療療效

研究表明，在健康女性中，活性葉酸的攝入與普通葉酸相比能更有效的改善葉酸的水平，并更能有效預(yù)防早孕期的神經(jīng)管缺陷[6]。但在不良妊娠史患者中，活性葉酸補充與普通葉酸治療效果比較，國內(nèi)尚未見報道。本研究發(fā)現(xiàn)，對存在不良妊娠史患者的治療中，活性葉酸的再次妊娠率較普通葉酸高，且再次妊娠的正常妊娠數(shù)顯著高于普通葉酸組(P<0.05)，說明針對此類患者，活性葉酸的療效優(yōu)于普通葉酸。進一步對正常妊娠的患者進行葉酸基因多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn)，對于存在C677T和A1298C位點突變的患者，活性葉酸的療效明顯，但在未存在突變的患者中，活性葉酸與普通葉酸的治療療效未見顯著性差異(P>0.05)。由此可見葉酸代謝基因C677T和A1298C位點突變可能與女性不良妊娠相關(guān)，且對于該位點突變的患者，活性葉酸治療有效。但需要指出的是，本資料未對所有的父母檢測外周血染色體，所以無法知曉父母是否為染色體異常相關(guān)患者，目前的研究也不能確定活性葉酸是否可以預(yù)防染色體病，這需要進一步的驗證。

綜上所述，葉酸代謝相關(guān)基因在不良妊娠史女性中突變率較高，此類人群應(yīng)進行葉酸代謝基因多態(tài)性檢測，并根據(jù)葉酸利用能力個體化補充葉酸，以降低出生缺陷的發(fā)生。

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