PD-1基因多態(tài)性與EOC易感性及預(yù)后的關(guān)系

， ，，

(山東省日照市中醫(yī)醫(yī)院婦科，山東 日照 276800)

卵巢癌具有易擴(kuò)散浸潤、早期無臨床癥狀等特點(diǎn)，因此需要早診斷、早治療。有研究發(fā)現(xiàn)卵巢癌中有絕大多數(shù)患者病理類型為卵巢上皮癌(epithelial ovarian cancer，EOC)[1]。目卵巢癌具有免疫原性已被越來越多的實(shí)驗(yàn)證明。近年發(fā)現(xiàn)與免疫逃逸有關(guān)的熱點(diǎn)基因程序性細(xì)胞凋亡蛋白1(programmed apoptosis protein 1，PD-1)在腫瘤免疫逃逸中起到了重要作用。PD-1是一種分子量為50左右的Ⅰ型跨膜蛋白，可以與其配體程序性死亡受體-配體1結(jié)合后，顯著抑制機(jī)體內(nèi)T淋巴細(xì)胞的活性，進(jìn)一步抑制身體內(nèi)的免疫應(yīng)答，從而協(xié)助腫瘤細(xì)胞，尤其是惡性腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)“免疫逃逸”。PD-1基因多態(tài)性可造成不同個體間PD-1基因表達(dá)差異，進(jìn)而影響蛋白表達(dá)，導(dǎo)致疾病的發(fā)生和發(fā)展。目前國內(nèi)張會蘭[2]對PD-1基因多態(tài)性與EOC的關(guān)系進(jìn)行了相關(guān)報道，但是不同地區(qū)、不同環(huán)境下PD-1基因多態(tài)性與EOC關(guān)系有待進(jìn)一步研究。本研究旨在探討PD-1.1和PD-1.5單核苷酸多態(tài)(SNPs)與EOC患者發(fā)病風(fēng)險及3年預(yù)后的關(guān)系。

1資料與方法

1.1一般臨床資料

選取2009年4月至2012年5月就診于山東省日照市中醫(yī)醫(yī)院的116例卵巢上皮癌患者，術(shù)中行快速冰凍切片，最終術(shù)后病理確診為EOC的女性為本次研究卵巢癌組(Case組)?；颊叩哪挲g為23～73歲，平均年齡為(54.36±6.83)歲。其中確診時年齡<50歲者42例(36.2%)，≥50歲者74例(63.8%)。根據(jù)國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，對EOC患者行臨床分期，其中Ⅰ～Ⅱ期患者有33例(28.4%)，Ⅲ～Ⅳ期患者83例(71.6%)；分化程度：高分化卵巢癌8例(6.9%)，中分化79例(68.1%)，低分化29例(25.0%)。116例患者中無失訪病例，所有患者均隨訪至截止時間或者死亡。疾病復(fù)發(fā)指標(biāo)為無疾病進(jìn)展生存時間(progressives free survival，PFS)，即手術(shù)切除病灶后復(fù)查時出現(xiàn)卵巢癌腫瘤標(biāo)記物(CA125)升高、影像學(xué)檢查異常、腹水等復(fù)發(fā)指征；評價生存預(yù)后的指標(biāo)為總生存時間(over-all survival，OS)，時間跨度為從手術(shù)切除病灶后至死亡或者隨訪截止時間。

另收集同期來本院體檢正常的110例女性為健康對照組(Control組)，其年齡在27～81歲，平均年齡(53.91±7.16)歲，其中年齡<50歲人員有38例(34.5%)，≥50歲人員72例(65.5%)。Control組需排除卵巢出現(xiàn)病變患者，包含有健康體檢者及輸卵管積液、子宮脫垂等患者。

Case組和Control組的所有對象均在完全自愿的基礎(chǔ)上參與本研究，并簽訂知情同意書。兩組的平均年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2獲取DNA樣本

研究人員用含有EDTA+枸櫞酸鈉(0.85mL)的采血管在無菌操作下采取兩組受試對象的外周血5mL，輕輕搖勻，并且置于-4℃冰箱保存?zhèn)溆茫没蚪MDNA快速提純試劑盒(美國Promega生物試劑公司)提取DNA，保存于-40℃冰箱中備用。

1.3 PD-1基因SNP分型測序

實(shí)驗(yàn)中使用的引物由上海英駿生物科技有限公司設(shè)計(jì)提供，PD-1.1上游引物：GCCATCCACAAGGTGGAAGCT，下游引物：CTCAACCCCACTCCCATTCTG。PD-1.5上游引物：CACCCTGCCTGCTTCTCCTG，下游引物：GAGCAGA￣CGGAGTATGCCACC。

采用RT-PCR法對所有受試對象行PD-1基因多態(tài)位點(diǎn)的基因型檢測。PCR產(chǎn)物擴(kuò)增反應(yīng)所采用的實(shí)驗(yàn)條件為：95℃預(yù)變性1min，緊接94℃變性30s，而后64℃退火15s，進(jìn)而72℃延伸25s，共計(jì)行35個循環(huán)后，最終在72℃下延伸2.5min。將所得到的PCR產(chǎn)物2μL及1μL引物序列，與10μL上樣buffer(已混入Mark)混合，置于總體系為25μL，在含有2%瓊脂糖凝膠上電泳，經(jīng)95℃變性3min，并立即在冰水浴，獲得終產(chǎn)物。根據(jù)ABI3100型測序分析儀對全部基因型進(jìn)行測序。檢測每個基因位點(diǎn)的準(zhǔn)確性時，需要隨機(jī)選取10%的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序判斷。具體電泳凝膠圖見圖1和圖2。

注：通道1、4為AA基因；通道2為GG基因；通道3為AG基因。

圖1 PD-1.1基因位點(diǎn)電泳圖

Fig.1 Electrophorogram of different PD-1.1 genotypes

注：通道1、4為CC基因；通道2、3、5為CT基因；通道6為TT基因。

圖2 PD-1.5基因位點(diǎn)電泳圖

Fig.2 Electrophorogram of different PD-1.5 genotypes

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。采用Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)對兩種PD-1基因分型及等位基因頻率分布進(jìn)行檢驗(yàn)，采用行×列表的χ2檢驗(yàn)卵巢上皮癌患者與健康者的等位基因和基因型頻率分布，采用非條件Logistic回歸分析PD-1.1、PD-1.5基因多態(tài)性與卵巢上皮癌發(fā)病的關(guān)系。采用Kaplan-Meier法分析PD-1基因中不同基因分型患者3年的生存情況，并采用Log-rank檢驗(yàn)基因分型及等位基因之間的差異，采用Cox風(fēng)險比例模型分析患者預(yù)后生存的相關(guān)基因分型及等位基因。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1兩組的一般臨床資料

研究結(jié)果顯示，Control組在平均年齡、初潮年齡、孕次及產(chǎn)次與Case組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，見表1。

表1 兩組的一般臨床資料比較結(jié)果[χ±S，n(%)]

2.2 PD-1.1和PD-1.5在不同組別中的分布

Case組PD-1.1基因型分布及等位基因頻率與Control組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；Case組PD-1.5基因型分布與Control組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而等位基因頻率之間兩組差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 PD-1.1和PD-1.5基因型及等位基因在不同組別中的分布比較結(jié)果[n(%)]

注：Reference表示參考。

2.3卵巢上皮癌患者臨床相關(guān)因素與基因型的關(guān)系

PD-1.1基因分型與EOC患者臨床分期和腫瘤分化程度有關(guān)系(均P<0.05)；PD-1.5基因分型與EOC患者年齡、臨床分期、分化程度和病理類型均無關(guān)聯(lián)(均P>0.05)，見表3。

表3 EOC患者臨床相關(guān)因素與基因型的關(guān)系n(%)

Table 3 Correlation of clinical factors of EOC patients and genotypesn(%)

表3 EOC患者臨床相關(guān)因素與基因型的關(guān)系n(%)

變量 PD?1．1 AAAGGGχ2P PD?1．5 CCCTTTχ2P年齡(歲)1．8940．3710．2460．884 <5010(23．81)23(54．76)9(21．43)24(57．14)16(38．10)2(4．76) ≥5027(34．49)34(45．94)13(17．57)43(58．11)26(35．13)5(6．74)臨床分期7．7440．0211．0980．179 Ⅰ～Ⅱ6(18．18)16(48．49)11(33．33)20(60．61)11(33．33)2(6．06) Ⅲ～Ⅳ31(37．35)41(49．40)11(13．25)47(56．63)31(37．35)5(6．02)分化程度10．2290．0062．8910．082 高中分化22(25．29)50(57．47)15(17．24)51(58．62)30(34．48)6(6．90) 低分化15(51．72)7(24．14)7(24．14)16(55．17)12(41．38)1(3．45)病理類型2．6230．1182．9360．076 漿液性19(32．76)28(48．28)11(18．96)34(58．62)20(34．48)4(6．90) 黏液性6(35．29)8(47．06)3(17．65)9(52．94)7(41．18)1(5．88) 子宮內(nèi)膜樣12(36．59)21(51．22)8(12．19)24(58．54)15(36．58)2(4．88)

2.4基因多態(tài)性與術(shù)后3年和5年復(fù)發(fā)率的關(guān)系

PD-1.1基因AA型、AG型及GG型3年和5年復(fù)發(fā)率分別為70.27%、68.42%、36.36%和86.49%、80.70%、63.64%，三種基因型3年和5年的復(fù)發(fā)率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；PD-1.5基因CC型、CT+TT型3年和5年的復(fù)發(fā)率分別為62.69%、63.27%和80.60%、77.55%，各基因分型在3年和5年的復(fù)發(fā)率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，見表4。

表4 基因多態(tài)性與術(shù)后3年和5年復(fù)發(fā)率的關(guān)系 n(%)

Table 4 Relationship between gene polymorphism and 3-year and 5-year recurrence raten(%)

表4 基因多態(tài)性與術(shù)后3年和5年復(fù)發(fā)率的關(guān)系 n(%)

基因型 3年復(fù)發(fā)率 是(n=73)否(n=43)χ2PHRa(95%CI) 5年復(fù)發(fā)率 是(n=92)否(n=24)χ2PHRa(95%CI)PD?1．1 AA26(70．27)11(29．73)11．6340．003reference32(86．49)5(13．51)8．2180．015reference AG39(68．42)18(31．58)0．478(0．209～1．322)46(80．70)11(19．30)0．488(0．219～0．910) GG8(36．36)14(63．64)0．567(0．364～0．824)14(63．64)8(36．36)0．653(0．465～0．992)PD?1．5 CC42(62．69)25(37．31)0．0040．949reference54(80．60)1319．40)0．1600．689reference CT+TT31(63．27)18(36．73)1．210(0．553～2．645)38(77．55)11(22．45)1．202(0．487～2．969)

注：Reference表示參考，HRa表示危害比。

2.5基因多態(tài)性與術(shù)后3年和5年生存率的關(guān)系

PD-1.1基因AA型、AG型及GG型5年總生存率分別為18.92%、43.86%和54.55%，經(jīng)Kaplan-Meier分析，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；PD-1.5基因CC、CT+TT基因型患者5年總生存率分別為38.81%和36.73%，經(jīng)Kaplan-Meier分析，其差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表5、圖3。

糾正Case組中患者的年齡、臨床分期及初次手術(shù)后殘存灶的大小，經(jīng)Cox回歸多因素分析結(jié)果顯示，PD-1.1基因分型為卵巢上皮癌患者的5年復(fù)發(fā)率和死亡率的危險因素(HR=2.709，95%CI：1.127～4.892，P=0.004)。

表5基因多態(tài)性與術(shù)后3年和5年生存率的關(guān)系n(%)

Table 5 Relationship between gene polymorphism and postoperative 3-year and 5-year survival raten(%)

基因型 3年生存率 生存(n=59)死亡(n=57)χ2PHRa(95%CI) 5年生存率 生存(n=44)死亡(n=72)χ2PHRa(95%CI)PD?1．1AA17(45．95)20(54．05)4．2230．089reference7(18．92)30(81．08)9．1110．011reference AG27(47．37)30(52．63)0．531(0．124～0．822)25(43．86)32(56．14)0．628(0．234～0．983) GG15(63．64)7(36．36)0．467(0．264～0．724)12(54．55)10(45．45)0．573(0．365～0．916)PD?1．5V CC33(49．25)34(50．75)0．1640．685reference26(38．81)41(61．19)0．0520．820reference CT+TT26(53．06)23(46．94)1．165(0．557～2．435)18(36．73)31(63．27)1．092(0．510～2．337)

注：Reference表示參考，HRa表示危害比。

注：圖A、B為PD-1.1基因，A為總生存率，B為疾病無進(jìn)展生存率；圖C、D為PD-1.5基因，C為總生存率，D為疾病無進(jìn)展生存率。

圖3 Kaplan-Meier法分析PD-1.1、PD-1.5不同基因位點(diǎn)5年內(nèi)總生存、疾病無進(jìn)展生存率

Fig.3 Analysis of 5-year overall survival rate and progression free survival rate of different gene loci in PD-1.1 and PD-1.5 by Kaplan-Meier method

3討論

3.1 PD-1.1基因多態(tài)性與卵巢上皮癌發(fā)病的關(guān)系

PD-1作為CD28免疫球蛋白超家族中的一員，是近年來新發(fā)現(xiàn)的與惡性腫瘤細(xì)胞免疫逃逸有關(guān)的關(guān)鍵基因，其位于人染色體2q37.3上，能夠編碼某些跨膜糖蛋白，已經(jīng)證實(shí)其在腫瘤免疫逃逸中起重要作用。以往國內(nèi)外關(guān)于PD-1基因多態(tài)性與疾病關(guān)系的研究中發(fā)現(xiàn)PD-1.1多態(tài)性與不同疾病的發(fā)病風(fēng)險關(guān)系不盡相同。有研究結(jié)果顯示PD-1基因多態(tài)性與乳腺癌發(fā)病風(fēng)險有關(guān)，并且GG型具有降低乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險，C等位基因具有增加乳腺癌發(fā)病風(fēng)險[3]。一項(xiàng)國外研究顯示，PD-1.1基因分型中的AA基因型人員發(fā)生類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的可能性明顯小于AG、GG型[4]，同時有研究認(rèn)為PD-1.1多態(tài)性與乙型肝炎的發(fā)病風(fēng)險有關(guān)[5]。目前對于PD-1.1基因多態(tài)性與卵巢癌，尤其是卵巢上皮癌的發(fā)病風(fēng)險的關(guān)系研究報道較少。本研究與張會蘭[2]的研究報道不盡一致，其研究顯示PD-1.1、PD-1.5基因多態(tài)性與卵巢上皮癌的發(fā)病，尤其術(shù)后復(fù)發(fā)及生存率之間無明顯相關(guān)性，但本研究中卻發(fā)現(xiàn)，卵巢上皮癌患者中等位基因A和G頻率分布與對照組人員有顯著性差異。本研究結(jié)果顯示G等位基因攜帶者患卵巢上皮癌的風(fēng)險是A基因攜帶者的0.837倍。進(jìn)一步對所有患者進(jìn)行隨訪發(fā)現(xiàn)，攜帶AA基因型的卵巢上皮癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)率顯著高于AG或GG基因型，而生存率低于AG、GG型。因此認(rèn)為導(dǎo)致本研究與張會蘭研究結(jié)果不相一致的原因可能有：①入選的卵巢上皮癌患者存在地域、環(huán)境差異，環(huán)境及地域等對基因型的分布存在一定的差異；②張會蘭的研究在隨訪時出現(xiàn)較多的失訪，因此認(rèn)為在一定程度上可能會導(dǎo)致誤差。此外需要指出的是，本研究與其研究均證實(shí)，卵巢上皮癌患者AA型比例較AG、GG型有顯著性差異，而本研究在隨訪過程中未出現(xiàn)失訪患者。

3.2 PD-1.5基因多態(tài)性與卵巢上皮癌的關(guān)系

關(guān)于PD-1.5基因位點(diǎn)與疾病相關(guān)的研究，目前發(fā)現(xiàn)CT+TT基因型相比于CC基因型能使非小細(xì)胞肺癌患者發(fā)病風(fēng)險增高，C等位基因與非小細(xì)胞肺癌發(fā)病風(fēng)險有關(guān)[6-7]。有研究發(fā)現(xiàn)，胃腺癌及胃潰瘍患者體內(nèi)CT基因型頻率顯著高于正常人[8-10]。

總之，對PD-1基因多態(tài)性與疾病的關(guān)系研究較多，包括乳腺癌、黑色素瘤等[11-14]。需要指出的是，在本研究中未發(fā)現(xiàn)Case組和Control組的CC、CT+TT基因型及等位基因頻率分布差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此認(rèn)為PD-1.5多態(tài)位點(diǎn)的C和T基因可能與卵巢上皮癌發(fā)病無關(guān)。

3.3小結(jié)

目前關(guān)于PD-1.1和PD-1.5多態(tài)性與惡性腫瘤臨床預(yù)后關(guān)系的研究較少。本研究結(jié)果表明卵巢上皮癌患者3年、5年的術(shù)后復(fù)發(fā)率及生存率與PD-1.1基因型頻率分布有關(guān)，而與PD-1.5無關(guān)。綜合以上分析，本研究結(jié)果可用于預(yù)測女性卵巢上皮癌的發(fā)病風(fēng)險，輔助臨床對卵巢上皮癌的早期診斷，同時對患者的預(yù)后治療提供參考依據(jù)。通過早期診斷女性PD-1.1基因型分布，可為預(yù)防卵巢上皮癌提供依據(jù)。

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