FSHβ錨定的外泌體制備及其對卵巢癌細(xì)胞誘導(dǎo)殺傷作用

岳 艷，王小波，李 進(jìn)，周 希，黃光榮

(1.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院婦科，湖北 十堰 442000；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院，湖北 十堰 442000； 3.湖北隨州市中心醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，湖北 隨州 442000)

外泌體(exosomes)是由多種細(xì)胞以胞吐的形式向細(xì)胞外基質(zhì)釋放的一種小囊泡，exosomes可以參與多種細(xì)胞間的信息傳遞、免疫應(yīng)答等[1]。不同細(xì)胞來源的exosomes均能夠特異性表達(dá)分子，如黏附分子1、組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)-Ⅰ及MHC-Ⅱ、CD86等，認(rèn)為其可以作為一種外源性免疫原性顆粒從而誘導(dǎo)T細(xì)胞分化和促發(fā)T細(xì)胞反應(yīng)，從而激發(fā)CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)。卵巢癌是危害女性生命健康的常見腫瘤之一，大多數(shù)患者確診時已到晚期，徹底的腫瘤減滅輔以一線聯(lián)合化療方案對初治大多數(shù)卵巢癌患者有一定臨床療效，但其中絕大多數(shù)會在初治后復(fù)發(fā)。卵泡刺激素受體-β(follicle stimulating hormone receptor，F(xiàn)SHβ)在人體中的分布比較有限，多集中于生殖系統(tǒng)，在其他器官組織中幾乎未見分布[2]。目前已經(jīng)有學(xué)者將FSH肽用于卵巢癌的細(xì)胞識別[3]。但是目前將FSH肽修飾至exosomes上，進(jìn)而誘導(dǎo)T細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)的研究報(bào)道較少。本研究旨在FSHβ修飾至HEK293細(xì)胞來源的exosomes上，從而進(jìn)一步觀察其免疫原性，是否能夠產(chǎn)生更強(qiáng)的誘導(dǎo)殺傷卵巢癌細(xì)胞，為臨床靶向治療卵巢癌細(xì)胞提供一定的理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

材料包括：pDisplay質(zhì)粒，LipofectamineTM2000(美國Invitrogen公司)，HEK293細(xì)胞及人卵巢癌細(xì)胞SKOV-3細(xì)胞(購自上海細(xì)胞庫)，大腸桿菌(escherichia coli，E.Coli.)、Top10、含有FSHβ基因全長的克隆載體pB-hbsp(廣州輝駿生物科技有限公司)，DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清(美國Gibco公司)，BgIⅡ、AccⅠ限制性內(nèi)切酶，Taq DNA聚合酶，T4連接酶(北京合生基因科技有限公司)，DL2000 DNA Marker以及DS5000 DNA Marker(購自北京博凌科為生物科技有限公司)。

1.2主要儀器設(shè)備

核酸凝膠電泳分析儀(美國Bio-Rad公司)，低溫離心機(jī)(美國Sigma公司)。PE 2400型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)分析儀(美國PE公司)，RNA/DNA calculator(購自Phammacia Biotech公司)，蛋白凝膠電泳分析儀、轉(zhuǎn)膜儀(美國Beckman Coulter公司)，IX70-143型倒置相差熒光顯微鏡，Olympus光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.3方法

1.3.1 pDisplay-FSHβ載體的構(gòu)建

采用哺乳動物細(xì)胞分泌型表達(dá)質(zhì)粒pDisplay。參考相關(guān)文獻(xiàn)[1-2]，選擇對FSHβ具有高度親和力的FSHβ 鏈第33～53個氨基酸殘基的多肽片段，序列為YTRDLVYKDPARP￣KIQKTCTF。設(shè)計(jì)如下兩條互補(bǔ)的編碼上述肽鏈的單鏈DNA片段：序列1的5'末端含有Bgl Ⅱ酶切后的黏性末端，序列如下：5'-GATCTTACACCAGGGATCTGGTGTATAAGG￣ACCCAGCCAGGCCCAAAATCCAGAAAACATGTACCTT￣CGT-3'；序列2的5'末端含有AccⅠ酶切后的黏性末端，序列如下：3'- AATGTGGTCCCTAGACCACATATTCCTGG￣GTCGGTCCGGGTTTTAGGTCTTTTGTACATGGAAGCA￣GC-5'，將上述兩條寡核苷酸鏈等摩爾混合，加熱至95℃，10min，室溫放置1h復(fù)性，以形成編碼FSHβ 鏈第33～53個氨基酸殘基的雙鏈DNA，將此雙鏈DNA插入到經(jīng)Bgl Ⅱ和AccⅠ雙酶切后的pDisplay上，連接構(gòu)成pDisplay-FSHβ重組質(zhì)粒。PCR驗(yàn)證后再經(jīng)序列分析鑒定，確認(rèn)無誤后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的建立

將HEK293細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)液中(含有10%的胎牛血清、62.5mg/L青霉素及100mg/L鏈霉素)，待細(xì)胞貼壁生長后，進(jìn)行換液、傳代培養(yǎng)。將處于對數(shù)生長期的HEK293細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，制備成3×105個/mL，接種于6孔板中，采用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000將pDisplay-FSHβ重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞中。采用遺傳霉素(geneticin，G418)(濃度從700μg/mL開始)篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)目的基因的細(xì)胞系，觀察細(xì)胞死亡情況，調(diào)節(jié)G418的濃度至450μg/mL并在此濃度下將細(xì)胞傳代5次左右，直到細(xì)胞不再出現(xiàn)死亡為止，表明得到穩(wěn)定表達(dá)的HEK293-FSHβ細(xì)胞模型。分別建立轉(zhuǎn)染成功的HEK293細(xì)胞(HEK293-FSHβ)和未轉(zhuǎn)染成功的HEK293-N1細(xì)胞系。采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)術(shù)檢測目的基因是否表達(dá)，蛋白免疫印跡法(Western Blotting)檢測目的蛋白FSHβ是否表達(dá)及倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)情況。

1.3.3 pDisplay-FSHβ洗脫實(shí)驗(yàn)

選取對數(shù)生長的HEK293-FSHβ細(xì)胞系、HEK293-N1細(xì)胞系及HEK293細(xì)胞系，采用磷酸緩沖液洗滌3次，棄去上清液，采用磷酸腺肌醇特異性磷脂酶C(phosphoinositide specific phospholipase C，PI-PLC，濃度為8U/mL，200μL)與上述三種細(xì)胞系共同孵育(37℃)2h。收集細(xì)胞上清液，采用酶聯(lián)免疫試劑盒檢測FSHβ蛋白表達(dá)情況。

1.3.4 Exosome的提取鑒定及分組

采用超速離心技術(shù)及蔗糖梯度密度離心技術(shù)提取HEK293-FSHβ細(xì)胞系、HEK293-N1細(xì)胞系及HEK293細(xì)胞系的exosome，并將所提取的exosomes分別標(biāo)注為Ex/FSHβ、Ex/N1及Ex，按照是否加入FSHβ分為Ex/FSHβ組、Ex/N1組及Ex組。通過掃描電鏡觀察純化的exosome，動態(tài)光散射技術(shù)(DLS)測量exosome的粒度大小及分布。采用蛋白免疫印跡法檢測黏附分子1(ICAM-1)、CD86及人類白細(xì)胞抗原-DR(HLA-DR)，其中ICAM-1一抗為鼠抗人單克隆抗體(稀釋比為1∶10 000)，CD86及HLA-DR為兔抗人多克隆抗體(稀釋比為1∶5 000)。

1.3.5樹突狀細(xì)胞的體外誘導(dǎo)擴(kuò)增與鑒定分析

選取健康志愿者(女性)外周血共計(jì)60mL，加入Ficoll分離液分離獲取單個核細(xì)胞。將混合有分離液的血液靜置2h后分層，選取中間白色細(xì)胞層，置于培養(yǎng)瓶中貼壁培養(yǎng)3h，收集懸浮細(xì)胞，用含有10%人AB血清(注釋：就是人AB型血中分離得到的血清，其中不含有抗A和抗B，較為安全)、1 000U/mL的重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、500U/mL的重組人白介素(rhIL-4)的DMEM培養(yǎng)基，每2天需要進(jìn)行換液，同時需要補(bǔ)充細(xì)胞因子。將第7天懸浮細(xì)胞收集，即為樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DC)，同時在倒置相差顯微鏡及掃描電鏡下觀察DC細(xì)胞形態(tài)。

1.3.6水溶性四唑鹽-1法誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞增殖效應(yīng)

將“樹突狀細(xì)胞的體外誘導(dǎo)擴(kuò)增與鑒定分析”步驟中剩余的外周血通過分離獲取非貼壁細(xì)胞(步驟同“樹突狀細(xì)胞的體外誘導(dǎo)擴(kuò)增與鑒定分析”)作為T淋巴細(xì)胞，培養(yǎng)于含有10%人AB血清的DMEM完全培養(yǎng)基中。將培養(yǎng)7天的DC細(xì)胞收集后，重新懸浮成5×105個/mL，取200μL DC細(xì)胞與相同體積的Ex/FSHβ、Ex/N1及Ex分別在500μL的DMEM完全培養(yǎng)基中孵育3h，使DC細(xì)胞負(fù)載Ex/FSHβ、Ex/N1及Ex，同時記為DC-Ex/FSHβ組、DC-Ex/N1組及DC-Ex組，加入適量的DMEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2天，采用濃度為15μg/mL絲裂霉素C增殖半小時，采用大量的培養(yǎng)基將絲裂霉素C洗去，將3×105個T淋巴細(xì)胞分別與負(fù)載Ex/FSHβ、Ex/N1及Ex的DC細(xì)胞按照3:1的比例混合培養(yǎng)，行常規(guī)培養(yǎng)3天。培養(yǎng)結(jié)束后，加入20μL水溶性四唑鹽-1(water soluble tetrazolium-1，WST-1)。另單獨(dú)設(shè)置一組空白組(只有單純DC細(xì)胞培養(yǎng)液及WST-1)及對照組(培養(yǎng)液培養(yǎng)的T淋巴細(xì)胞及WST-1)。采用酶標(biāo)儀在450nm處檢測各組的吸光度值(OD值)。T淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)(stimulation index，SI)=(實(shí)驗(yàn)組OD值-對照組OD值)/(對照組-空白組)×100%。

1.3.7卵巢癌細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

將“水溶性四唑鹽-1法誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞增殖效應(yīng)”步驟中的DC-Ex/FSHβ、DC-Ex/N1、DC-Ex及DC細(xì)胞與T淋巴細(xì)胞按照3:1混合培養(yǎng)，刺激T淋巴細(xì)胞，每周1次，一共進(jìn)行2次刺激，培養(yǎng)后需要隔半日換液。收集刺激活化后的T淋巴細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，以卵巢癌SKOV-3細(xì)胞為靶細(xì)胞，按照效應(yīng)細(xì)胞-靶向細(xì)胞比值(60:1，30:1，15:1)混合培養(yǎng)24h。在培養(yǎng)結(jié)束前6h內(nèi)處理各組共培養(yǎng)細(xì)胞，采用Alamarblue法檢測細(xì)胞毒性的T淋巴細(xì)胞活性。采用毒性淋巴細(xì)胞殺傷率=(靶細(xì)胞孔熒光強(qiáng)度+效應(yīng)細(xì)胞孔熒光強(qiáng)度-混合細(xì)胞培養(yǎng)孔熒光強(qiáng)度)/靶細(xì)胞孔熒光強(qiáng)度×100%。

1.3.8混合培養(yǎng)后上清中細(xì)胞因子含量檢測

將效應(yīng)細(xì)胞與卵巢癌SKOV-3細(xì)胞靶細(xì)胞混合培養(yǎng)24h后，洗去上清液100μL，采用酶聯(lián)免疫法檢測各組別培養(yǎng)孔液中上清液的干擾素-γ(interferon-γ，INF-γ)水平、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)。

1.3.9 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

將卵巢細(xì)胞重懸于無血清的培養(yǎng)液中，種在Transwell小室的上層，分別將“水溶性四唑鹽-1法誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞增殖效應(yīng)”步驟中DC-Ex/FSHβ、DC-Ex/N1、DC-Ex及DC細(xì)胞與T淋巴細(xì)胞按照3:1混合培養(yǎng)，刺激T淋巴細(xì)胞。24h后采用結(jié)晶紫染色多孔膜，顯微鏡下觀察遷移的細(xì)胞并計(jì)數(shù)，每個小室至少觀察5個視野。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0軟件包處理所得數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以“χ±S”表示，數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組內(nèi)兩兩比較用Bonferroni’ post test，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 pDisplay-FSHβ載體的鑒定及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的建立

pDisplay-FSHβ載體質(zhì)粒通過DNA測序，基因融合序列與預(yù)期的結(jié)果基本一致，通過BgIⅡ、AccⅠ限制性內(nèi)切酶雙酶切及電泳后，可以酶切出預(yù)期的7 500bp及1 300bp兩個片段，見圖1A、圖1B。采用G418篩選以后，轉(zhuǎn)染后的HEK293細(xì)胞系能夠穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光。通過倒置熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染成功的HEK293細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染成功的HEK293-N1細(xì)胞系。研究結(jié)果顯示，pDisplay-FSHβ質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞，見圖2。

2.2 pDisplay-FSHβ洗脫實(shí)驗(yàn)結(jié)果

研究結(jié)果顯示，經(jīng)PI-PLC洗脫后，HEK293-FSHβ組洗脫液中FSHβ水平顯著高于PBS洗脫液(t=15.631，P=0.000)。經(jīng)PI-PLC洗脫后，HEK293-FSHβ組洗脫液中FSHβ水平顯著高于HEK293組、HEK293-N1組(t值分別為17.221、19.583，均P=0.000)，見表1。

注：A為PCR檢測pDisplay-FSHβ載體質(zhì)?；虮磉_(dá)情況，其中M2：DS5000 DNA Marker，通道1：陰性對照，通道2～4：隨機(jī)挑選的pDisplay-FSHβ載體質(zhì)粒；B為pDisplay-FSHβ載體質(zhì)粒的酶切鑒定，其中M1：DL2000 DNA Marker，通道1：載體質(zhì)粒經(jīng)BgIⅡ、AccⅠ酶切鑒定。

圖1 pDisplay-FSHβ載體質(zhì)粒PCR檢驗(yàn)以及酶切鑒定

Fig.1 PDisplay-FSHβ vector plasmid PCR and enzyme digestion identification

注：A為轉(zhuǎn)染pDisplay-FSHβ質(zhì)粒的HEK293細(xì)胞；B為未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的HEK293細(xì)胞。

圖2倒置熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染后陽性細(xì)胞表達(dá)情況(×200)

Fig.2 Expression of positive cells after transfection observed through inverted fluorescence microscope (×200)

表1 pDisplay-FSHβ洗脫實(shí)驗(yàn)FSHβ表達(dá)情況(pg/mL,χ±S)

Table 1 Expression of FSHβ in pDisplay-FSHβ elution assay (pg/mL,χ±S)

項(xiàng)目HEK293HEK293?N1HEK293?FSHβFPPBS洗脫6．84±1．247．22±1．358．04±1．462．0130．114PI?PLC洗脫7．29±1．41#7．02±1．29#29．58±3．49?7．9080．011

注：與PBS洗脫組比較，*P<0.05；與HEK293-FSHβ組比較，#P<0.05。

2.3 exosomes的大小、形態(tài)鑒定及相關(guān)蛋白表達(dá)

掃描電鏡下顯示， Ex/FSHβ與Ex/N1、Ex在大小及形態(tài)比較無顯著性差異，直徑在30～90nm且密度均勻一致，見圖3。Western Blotting檢測顯示，Ex/FSHβ組ICAM-1、CD86及HLA-DR相對表達(dá)量與Ex/N1組、Ex組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.147～7.886，均P<0.05)，見圖4、表2。

圖3掃描電鏡下exosomes的大小、形態(tài)鑒定

Fig.3 Exosomes size and morphological identification under scanning electron microscope

圖4 Western Blot檢測不同組別CD86、HLA-DR、 ICAM-1表達(dá)的電泳圖

Fig.4 Electrophor CD86,HLA-DR and ICAM-1 in different groups-ogram of detected by westein Blot

表2 Western Blotting檢測不同組別ICAM-1、CD86及HLA-DR的相對表達(dá)量(χ±S)

Table 2 Relative expression of ICAM-1, CD86 and HLA-DR detected by western blotting in different groups(χ±S)

組別ICAM?1CD86HLA?DREx組0．321±0．0650．401±0．0810．339±0．059Ex/N1組0．341±0．0720．425±0．0790．298±0．063Ex/FSHβ組0．339±0．0590．397±0．0810．318±0．091F7．1097．0367．552P0．0110．0110．010

2.4樹突狀細(xì)胞的形態(tài)鑒定

外周血單個核細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后第3天(見圖5A)，單個核細(xì)胞表面伸出毛刺狀偽足、細(xì)胞明顯增大，培養(yǎng)第6天后細(xì)胞表面出現(xiàn)典型的毛刺狀突起(見圖5B)。通過電鏡掃描顯示，細(xì)胞表面出現(xiàn)不規(guī)則褶皺及樹枝樣突起(見圖5C)。

圖5倒置相差顯微鏡及掃描電鏡對DC的鑒定

Fig.5 Identification of DC by inverted phase contrast microscope and scanning electron microscope

2.5 WST-1法誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞的增殖效應(yīng)

研究結(jié)果顯示，混合淋巴細(xì)胞3天后，不同組別負(fù)載exosomes的DC均能夠誘導(dǎo)外周血T淋巴細(xì)胞的增殖效果，其中DC-Ex/FSHβ組SI為(2.79±0.68)，與DC-Ex/N1組(1.84±0.49)、DC-Ex組(1.74±0.46)及DC組(1.38±0.41)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為8.634、9.773、11.264，均P<0.05)。DC-Ex/N1組、DC-Ex組與DC組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為6.221、5.803，均P<0.05)。

2.6細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

研究結(jié)果顯示，各效靶比時，DC-Ex/FSHβ組殺傷率均顯著高于DC-Ex/N1組、DC-Ex組及DC組(t=4.296～21.413，均P<0.05)。當(dāng)效靶比在60∶1時，DC-Ex/FSHβ組殺傷率最高，見表6。

注：*與DC組比較，P<0.05；#與DC-Ex組、DC-Ex/N1組比較，P<0.05；▲與效靶比15∶1比較，P<0.05；△與效靶比30∶1比較，P<0.05。

圖6不同效靶比下混合T淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)殺傷卵巢癌細(xì)胞的效果

Fig.6 Induced killing effect of mixed T cells on ovarian cancer cell under different effect target ratio

2.7 DC-Ex/FSHβ對細(xì)胞因子的影響

當(dāng)效靶比在60:1時，DC-Ex/FSHβ組INF-γ、IL-6及TNF-α含量與DC-Ex/N1組、DC-Ex組及DC組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=17.627～39.854，均P<0.05)。DC-Ex/N1組、DC-Ex組與DC組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為14.071、13.219，均P<0.05)，見表3。

表3 DC-Ex/FSHβ對上清細(xì)胞因子的影響

Table 3 Effect of DC-Ex/FSHβ on cytokines in supernatant

組別INF?γ(pg/mL)IL?6(ng/L)TNF?α(ng/L)DC組332．01±51．4561．25±15．13178．92±36．87DC?Ex組971．86±73．60?104．31±24．32?304．58±61．27?DC?Ex/N1組989．93±76．55?109．25±26．18?307．88±63．82?DC?Ex/FSHβ組1762．35±133．79?#▲457．63±76．08?#▲683．46±104．32?#▲

注：*與DC組比較，P<0.05；#與DC-Ex組比較，P<0.05；▲與DC-Ex/N1組比較，P<0.05。

2.8細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，DC-Ex/FSHβ組細(xì)胞穿過聚碳質(zhì)膜微孔的細(xì)胞數(shù)(63.7±7.4)，顯著低于DC-Ex/N1組(181.3±9.2)、DC-Ex組(188.7±9.7)及DC組(299.72±19.32)，(t值分別為17.396、16.517，34.892，均P<0.05)，見圖7。

注：圖A～D分別為DC組、DC-Ex組、DC-Ex/N1組及DC-Ex/FSHβ組。

圖7遷移實(shí)驗(yàn)

Fig.7 Migration experiment

3討論

3.1卵巢癌對女性健康的影響

卵巢癌是危害女性生命健康的常見腫瘤之一，死亡率高居?jì)D科癌癥首位。傳統(tǒng)的手術(shù)、放化療效果不佳。同時，化療藥的非靶向性及骨髓抑制、腎功能不全、過敏反應(yīng)、心臟毒性、腎功能不全等諸多不良反應(yīng)，使患者生活質(zhì)量嚴(yán)重下降[4]，甚至，還有一些患者因無法耐受毒性反應(yīng)而終止化療，導(dǎo)致卵巢癌進(jìn)展迅速甚至死亡。因此，提高化療療效的同時降低毒副作用是當(dāng)前卵巢癌治療中亟待解決的問題。

3.2 exosome在癌癥靶向治療中的作用

靶向治療藥物能夠特異性地針對腫瘤的某些特定分子，在增強(qiáng)藥物對腫瘤細(xì)胞殺傷的同時，盡可能地減少對其它組織的毒副作用。exosome是由活細(xì)胞分泌的直徑為50～100nm的膜結(jié)構(gòu)囊泡。細(xì)胞內(nèi)吞泡膜向內(nèi)凹陷形成含有多個小囊泡的多泡內(nèi)涵體后，與細(xì)胞膜融合，釋放其中的小囊泡，即為exosome。作為一種天然的物質(zhì)運(yùn)輸載體，exosome已經(jīng)被開發(fā)運(yùn)用于核酸類藥物、化療藥物等的靶向運(yùn)輸，并運(yùn)用于阿爾茨海默病、心臟病及腫瘤等疾病的治療研究[5-6]，顯示出強(qiáng)大的應(yīng)用能力和廣闊的應(yīng)用前景。目前已經(jīng)有報(bào)道指出，由DC來源的exosomes能夠負(fù)載多種免疫因子，從而有效誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖，引起毒性T淋巴細(xì)胞抗腫瘤的免疫應(yīng)答[7]。有研究指出，T-exosomes因攜帶豐富的腫瘤特異性抗原，同時本身具有細(xì)胞靶向性相關(guān)的功能蛋白，能夠?qū)⒛[瘤抗原轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞，從而對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生排斥反應(yīng)[8]。目前，已有報(bào)道指出，癌癥細(xì)胞來源的exosomes聯(lián)合免疫佐劑能在一定程度上增強(qiáng)抗腫瘤效應(yīng)[9]。

3.3 FSHβ在卵巢癌靶向治療中的作用

FSHβ在人體中的分布比較有限，多集中于生殖系統(tǒng)，在其他器官組織中幾乎未見分布。絕大多數(shù)卵巢癌組織表達(dá)FSHβ，且表達(dá)水平高于正常卵巢組織，是理想的卵巢癌腫瘤治療的靶標(biāo)?；贔SHβ介導(dǎo)的主動靶向納米給藥系統(tǒng)曾被報(bào)道用于卵巢癌的治療[10-11]。FSHβ在人體中的分布比較有限，多集中于生殖系統(tǒng)，在其他器官組織中幾乎未見分布。絕大多數(shù)卵巢癌組織表達(dá)FSHβ且表達(dá)水平高于正常卵巢組織，是理想的卵巢癌腫瘤治療的靶標(biāo)[12]。復(fù)旦大學(xué)徐從劍教授課題組報(bào)道FSHβ鏈第33～53，81～95氨基酸片段能夠特異性的識別FSHβ陽性的卵巢癌細(xì)胞，且對其生長無影響，F(xiàn)SH肽修飾納米粒子后顯示出卵巢癌靶向治療效應(yīng)[13]。本研究顯示，F(xiàn)SHβ能夠很好的負(fù)載在exosomes上。多項(xiàng)研究均已證實(shí)，不同來源的exosomes均含有特異性蛋白成分，在體內(nèi)可以產(chǎn)生有效的免疫刺激，尤其是細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)[14-15]。

3.4 exosomes錨定的T淋巴細(xì)胞毒性反應(yīng)

本研究通過HEK293細(xì)胞系來源的exosomes也能夠明顯表達(dá)ICAM-1、CD86及HLA-DR，而這些分子具有較強(qiáng)的外源性抗原能力以及靶向刺激效應(yīng)細(xì)胞的作用。 目前有研究認(rèn)為，exosomes對T細(xì)胞產(chǎn)生的刺激效果較弱，需要負(fù)載DC后才能產(chǎn)生較強(qiáng)的抗腫瘤效應(yīng)[16]。本研究主要是將exosomes負(fù)載卵巢癌靶標(biāo)分子FSHβ，進(jìn)一步與DC細(xì)胞混合從而刺激細(xì)胞產(chǎn)生豐富的特異性免疫因子(ICAM-1、CD86及HLA-DR)。通過本研究的Western Blotting已經(jīng)得到證實(shí)。研究指出，exosomes及DC細(xì)胞具有一定程度的誘導(dǎo)刺激T細(xì)胞增殖的效應(yīng)，從而產(chǎn)生細(xì)胞毒性細(xì)胞效應(yīng)[17]。通過本研究發(fā)現(xiàn)，DC-Ex/FSHβ能顯著活化細(xì)胞毒性T細(xì)胞的增殖效果，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)其對靶細(xì)胞卵巢癌細(xì)胞具有明顯的殺傷作用及促進(jìn)INF-γ的作用。

3.5小結(jié)

綜上，通過基因重組技術(shù)，可以將FSHβ修飾到HEK293細(xì)胞來源的exosomes上，獲得的DC-Ex/FSHβ能夠誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞對卵巢癌細(xì)胞產(chǎn)生較強(qiáng)的誘導(dǎo)殺傷作用，這一作用為臨床以exosomes為基礎(chǔ)的腫瘤免疫治療提供了一定的理論依據(jù)。

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