赤皮青岡離體花枝培養(yǎng)及花粉活力研究

吳水平，李 琳，王利寶

赤皮青岡（Cyclobalanopsis gilva (Blume)Oerst）又名紅綢，屬殼斗科青岡櫟屬植物，主要分布在我國南部湖南、福建、貴州和浙江等省，其生長較快、分布廣、適應(yīng)性強(qiáng)，心材暗紅褐色，木材堅(jiān)硬且有彈性，是歷史上有名的珍貴材樹種［1］。加強(qiáng)赤皮青岡良種培育是壯大珍貴用材樹種產(chǎn)業(yè)和擴(kuò)大珍貴材資源的主要環(huán)節(jié)。通過控制授粉開展良種選育是獲得植物優(yōu)良品系的重要途徑，對于高大的喬木樹種通過花枝室內(nèi)培養(yǎng)獲取花粉對于其人工授粉至關(guān)重要［1］。目前有關(guān)赤皮青岡的研究主要集中在分類、地理分布、種子生理、無性繁殖、群落特征、種群更新、播種育苗、水分脅迫等領(lǐng)域［2-10］，有關(guān)其花枝離體培養(yǎng)及花粉活力的研究幾乎沒有報(bào)道。該方面的研究可解決異地授粉和花期不遇的問題，也為通過人工控制授粉選育良種奠定基礎(chǔ)。本研究可為開展赤皮青岡人工控制授粉、選育優(yōu)良新品種提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

花枝取自中南林業(yè)科技大學(xué)植物園僅存的 1 株母樹。母樹高 20 m，胸徑 18 cm，平均冠幅 5 m，枝繁葉茂，生長旺盛。該樹種在湖南長沙地區(qū)自然散粉時(shí)間是 4 月上旬，清明節(jié)前后 3～4 天是散粉集中期。

1.2 方法

1.2.1 花枝室內(nèi)培養(yǎng) 以自然條件下樹上花粉集中散粉時(shí)間為基準(zhǔn)，分別提前 15、10、5 天，利用高枝剪截取待散粉的花枝進(jìn)行室內(nèi)花枝培養(yǎng)。培養(yǎng)溶液為 0.5% 的蔗糖液和多元素營養(yǎng)液（尿素 2.5 g/L，氯化鉀 2.5 g/L，過磷酸鈣 1.5 g/L）（在文獻(xiàn)［10］基礎(chǔ)上略作修改而得），并以自來水作為對照。培養(yǎng)期間，每隔 2 天更換 1 次新鮮培養(yǎng)液，培養(yǎng)液加入量以浸沒花枝下端 10 cm 為宜，每天觀察葉（尤其是嫩葉）、花序及花苞生長發(fā)育和散粉狀況。

1.2.2 花粉收集

（1）室內(nèi)培養(yǎng)的花枝花粉收集。待花苞開裂后將花序剪下，在干凈的紙上輕彈花序，花粉即可散出。

（2）野外自然散粉母樹花粉收集。于上午9 : 00 前采集母樹上即將要散粉的花穗裝入硫酸紙袋中，放在 25～30 ℃ 室內(nèi)陰干，待次日花藥大量爆裂之后，用手指輕彈花序，花粉即可散出。

（3）將收集的花粉裝入加有干燥硅膠的棕色玻璃瓶中，蓋上蓋，室溫下貯藏待用。

1.2.3 花粉活力測定 采用氯代三苯基四氮唑（簡稱紅四氮唑，即 TTC）染色法測定花粉活力［11-12］。在 10 ml 蒸餾水中加 0.5 g TTC，待完全溶解后定容至 100 ml；將配好的染色液貯存在棕色瓶中待用。用潔凈的毛筆分別粘取經(jīng) 0、5、10、15 天貯藏的花粉置于具凹槽載玻片上，滴加 1 滴配制好的 TTC 染液，蓋好蓋玻片后放置在 35 ℃ 培養(yǎng)箱中，30 min 后取出于顯微鏡下觀察染色結(jié)果。每個(gè)載玻片均觀察 3 個(gè)視野，被染成紅色的為活力較強(qiáng)的花粉粒，呈棕褐色的為發(fā)育不良的花粉粒，無色的為死亡的花粉粒。

1.2.4 花粉萌發(fā) 對野外采集的新鮮花粉和室內(nèi)培養(yǎng)獲得的花粉不經(jīng)儲藏測定其花粉在瓊脂固態(tài)培養(yǎng)基上的萌發(fā)狀況。分別采取單因素試驗(yàn)，在瓊脂培養(yǎng)基中加入蔗糖，設(shè) 3 種處理濃度，分別是 50、100、150 g/L；在瓊脂培養(yǎng)基中加入硼酸，設(shè) 3 種處理，分別是 100、300、500 mg/L。在最適蔗糖和硼酸濃度的培養(yǎng)基上［13］，于 3 種培養(yǎng)溫度（22、25、28 ℃），下培育花粉。在培養(yǎng) 2、4、6、8、10、12、24 h 后分別通過顯微鏡（20 倍）觀察培養(yǎng)的花粉，每個(gè)培養(yǎng)皿觀察 3 個(gè)視野，取平均值。萌發(fā)的花粉其花粉管長度超過 1 倍花粉粒長度為萌芽依據(jù)?；ǚ酃荛L度計(jì)數(shù)單位：1D＝1 倍的花粉粒長度。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 觀察統(tǒng)計(jì)每個(gè)視野花粉萌發(fā)率、花粉管長度、染色花粉粒數(shù)；使用 Excel、SPSS19.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和方差分析，并以最小顯著差數(shù)法（LSD）進(jìn)行多重比較分析?；ǚ刍盍εc花粉萌發(fā)率計(jì)算公式如下：

花粉活力（%）＝平均每個(gè)視野染色的花粉數(shù)÷平均每視野花粉總數(shù)×100；

花粉萌發(fā)率（%）＝平均每視野萌發(fā)的花粉數(shù)÷平均每視野花粉總數(shù)×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)液對不同離體時(shí)間的花枝散粉的影響

觀察結(jié)果（表 1 僅列出部分結(jié)果）表明：室內(nèi)條件下用 0.5% 的蔗糖溶液培養(yǎng)比野外自然散粉提早 15 天采集的離體赤皮青岡花枝，培養(yǎng) 13 天以上才能收集到花粉，雖然在培養(yǎng) 12 天后葉稍有萎蔫且嫩葉早于老葉萎蔫，但并未影響花粉囊的開裂和散粉；用自來水（對照）培養(yǎng)的第 4 天開始枯萎，第 6 天枯死，花粉囊未開裂；用多元素營養(yǎng)液培養(yǎng)的在第 9 天開始枯死，花序萎縮，花粉囊不能開裂，無花粉散出。培養(yǎng)比野外提前 10 天采集的離體花枝，則蔗糖溶液和多元素營養(yǎng)液培養(yǎng)的均可收集到花粉，蔗糖溶液培養(yǎng)的離體花枝葉色較多元素營養(yǎng)液培養(yǎng)的深，葉緣較舒展；自來水培養(yǎng)的離體花枝葉片提早萎蔫，花序干枯緊閉，未能收集到花粉。培養(yǎng)比野外提前 5 天采集的離體花枝，3 種培養(yǎng)液均可收集到花粉，且 3 種培養(yǎng)液培養(yǎng)的花枝形態(tài)上差異不大。

表1 培養(yǎng)液對離體時(shí)間不同的赤皮青岡花枝散粉的影響Tab.1 The effects on the dispersing pollens of Cylobalanopsis gilv of nutrition in different isolated time

2.2 貯藏時(shí)間對赤皮青岡花粉活力的影響

從表 2 看出：野外自然散粉獲得的花粉和離體枝室內(nèi)培養(yǎng)獲得的花粉，于室溫貯藏時(shí)間在 5 天之內(nèi)，花粉活力都達(dá) 90% 及以上；保存 10天的花粉活力均低于 50%，但離體花枝培養(yǎng)獲得的花粉活力明顯高于野外自然散粉獲得的花粉活力；保存 15 天，自然散粉花粉和離體花枝培養(yǎng)獲得的花粉均無活力。在保存 0～5 天，離體花枝培養(yǎng)對花粉活力無顯著影響，保存時(shí)間在 5～10 天，離體花枝獲得的花粉較自然散粉的花粉耐儲藏。室溫下保存赤皮青岡花粉不宜超過 15 天。

表2 2種途徑獲得的花粉不同貯藏時(shí)間的活力Tab.2 The pollen vigour in different store time by 2 kinds of collection(%)

2.3 培養(yǎng)溫度對赤皮青岡花粉離體萌發(fā)的影響

從表 3 看出：花粉在 25 ℃ 下培養(yǎng)，其花粉平均萌發(fā)率最高，為 74.0%；花粉管平均長度較長，為 5.1 D。在 22 ℃ 和 28 ℃ 下培養(yǎng)，不利于花粉萌發(fā)。可見，赤皮青岡花粉萌發(fā)的最適溫度是 25 ℃。

表3 赤皮青岡離體花粉在不同溫度下的萌發(fā)狀況Tab.3 The germination status of pollen of isolated branch of Cylobalanopsis gilv in different temperature

2.4 蔗糖濃度對赤皮青岡花粉萌發(fā)的影響

從表 4 看出：花粉在添加 100 g/L 蔗糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其花粉平均萌發(fā)率最高，為 79.2%；花粉管平均長度最長，為 3.5 D。在添加 50 g/L 和150 g/L 的蔗糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，不利于花粉萌發(fā)?？梢?，赤皮青岡花粉萌發(fā)培養(yǎng)基的最適蔗糖濃度是 100 g/L。

表4 花粉在不同蔗糖濃度下的萌發(fā)狀況Tab.4 Germination status of pollen at different sucrose concentrations

2.5 硼酸濃度對赤皮青岡花粉萌發(fā)的影響

從表 5 看出，花粉在添加 300 mg/L 硼酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其花粉平均萌發(fā)率最高，為 68.0%；花粉管平均長度最長，為 4.6 D。在添加 100 mg/L和 500 mg/L 的培養(yǎng)基中培養(yǎng)均不利于花粉萌發(fā)?？梢?，赤皮青岡花粉萌發(fā)培養(yǎng)基的最適硼酸濃度是 300 mg/L。

表5 赤皮青岡離體花粉在不同硼酸濃度下的萌發(fā)狀況Tab.5 Germination status of pollen of isolated branch of Cylobalanopsis gilv in different boric acid concentration

2.6 不同因素對赤皮青岡花粉萌發(fā)率以及花粉管長度影響的差異

從表 6 看出：赤皮青岡花粉萌發(fā)過程中，培養(yǎng)基中蔗糖濃度是影響花粉萌發(fā)率最重要的因素，其次是培養(yǎng)溫度，最后是培養(yǎng)基中硼酸濃度；對于花粉管生長來說，培養(yǎng)溫度是最重要的影響因素，培養(yǎng)基中硼酸濃度其次，最后是培養(yǎng)基中蔗糖濃度。

表6 不同因素對赤皮青岡花粉萌發(fā)率和花粉管長度的影響Tab.6 The correlation analysis between factors of germination culture of pollen of Cylobalanopsis gilv

3 結(jié)論與討論

室內(nèi)離體培養(yǎng)比自然散粉前 15 天采集的赤皮青岡花枝，通過 0.5% 的蔗糖溶液培養(yǎng) 13 天獲得的花粉與自然散粉的花粉萌發(fā)率和花粉活力差異不顯著，用添加 N、P、K 的營養(yǎng)液和自來水培養(yǎng)均不能獲得花粉。提前 10 天采集的待散粉花枝，用 0.5% 的蔗糖溶液和添加 N、P、K 的營養(yǎng)液培養(yǎng)均可獲得花粉；提前 5 天采集的待散粉花枝，用蔗糖、添加 N、P、K 的營養(yǎng)液和自來水培養(yǎng)均可獲得花粉。貯藏 5 天后，離體花枝培養(yǎng)獲得的花粉和自然散粉獲得的花粉的活力均達(dá) 90% 及以上；貯藏 10 天后，兩種途徑獲得的花粉的活力均低于 50%，但離體花枝培養(yǎng)獲得的花粉較自然散粉獲得的花粉更耐貯藏；貯藏 15 天后，兩種途徑獲得的花粉均無活力。赤皮青岡花粉室溫貯藏時(shí)間不能超過 2 周。據(jù)孫超等［14］報(bào)道，采取低溫貯藏花粉可以延長貯藏時(shí)間，低溫貯藏赤皮青岡花粉待進(jìn)一步研究。

促進(jìn)赤皮青岡花粉萌發(fā)和花粉管生長的培養(yǎng)基的最適蔗糖濃度是 100 g/L，最適硼酸濃度是 300 mg/L，最適溫度是 25 ℃；蔗糖濃度對于花粉萌發(fā)最重要，其次是溫度，最后是硼酸濃度；溫度對花粉管伸長最重要，其次是硼酸濃度，蔗糖濃度對花粉管生長的影響最小。不同植物花粉萌發(fā)需要的蔗糖和硼酸濃度不同，但蔗糖和硼酸濃度是室內(nèi)花粉萌發(fā)的基本條件［15-16］，培養(yǎng)溫度一般在 25 ℃。培養(yǎng)赤皮青岡離體花枝獲得的花粉，其授粉效果如何，還待作進(jìn)一步研究。

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