發(fā)酵蔬菜中乳酸菌降解亞硝酸鹽的研究進展

姚 荷，譚興和*，張春艷，王 鋒，李清明，王欄樹，成才良

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學 食品科技學院，湖南 長沙 410128；2.食品科學與生物技術(shù)湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128；3.湖南佳宴食品有限公司，湖南 長沙 410000）

亞硝酸鹽（nitrite，NIT）廣泛存在于食品中，因其發(fā)色、保持風味、抗氧化和抑制致病菌生長等特性，經(jīng)常被用作食品添加劑。但過量攝入亞硝酸鹽會引發(fā)機體中毒、高鐵血紅蛋白癥和癌變等[1]。據(jù)調(diào)查，超過80%的硝酸鹽和亞硝酸鹽攝入與蔬菜及其相關(guān)制品有關(guān)，其中發(fā)酵蔬菜尤甚[2-3]。蔬菜發(fā)酵是以蔬菜為原料、利用有益微生物活動，并控制一定生產(chǎn)條件進行蔬菜保藏的一種方式，在我國已有上千年的歷史。其制品品種多樣、風味獨特、營養(yǎng)豐富，具有促消化、抑菌、抗老化等功效[4-5]。傳統(tǒng)蔬菜發(fā)酵多為自然發(fā)酵，利用蔬菜、水、發(fā)酵材料自身所帶乳酸菌進行發(fā)酵[6]。但自然發(fā)酵品質(zhì)不一、發(fā)酵周期長、雜菌較多，存在亞硝酸鹽含量超標的現(xiàn)象，嚴重危害人體健康。為解決這些問題，目前多采用人工接種乳酸菌進行蔬菜發(fā)酵。乳酸菌在蔬菜發(fā)酵中起主導作用，因其不帶有硝酸還原酶，被認為是無毒、無害的益生菌。通過乳酸菌發(fā)酵，不僅可以改善發(fā)酵環(huán)境、縮短發(fā)酵周期、抑制雜菌生長、促進腸道蠕動以及營養(yǎng)吸收[7-8]，還可顯著降低發(fā)酵蔬菜中亞硝酸鹽含量，彌補自然發(fā)酵的缺陷[9-10]。JI F D等[11]研究表明，接種乳酸菌發(fā)酵白菜相比自然發(fā)酵，亞硝酸鹽含量及其峰值明顯降低。本文就發(fā)酵蔬菜中亞硝酸鹽的來源、乳酸菌降解亞硝酸鹽的途徑以及影響發(fā)酵蔬菜中乳酸菌降解亞硝酸鹽的因素進行了探討，并對今后實際生產(chǎn)中，利用發(fā)酵蔬菜中乳酸菌降解亞硝酸鹽研究趨勢進行了展望。

1 發(fā)酵蔬菜中亞硝酸鹽的來源及危害

蔬菜經(jīng)自身氮循環(huán)、過量施用氮肥、田間采收貯藏等累積了大量的硝酸鹽。硝酸根離子具有較低的急性毒性，但在長期貯藏和發(fā)酵過程中，經(jīng)硝酸還原菌的作用，可轉(zhuǎn)化為具有較高急性毒性的亞硝酸鹽[12-13]。人體在食用剛腌制或不新鮮的蔬菜時，會導致亞硝酸鹽攝入過量，繼而引發(fā)機體中毒，出現(xiàn)頭暈無力、胸悶氣短、惡心腹瀉等癥狀，嚴重者會呼吸衰竭，危及生命[14]。且大量具有強氧化性的亞硝酸鹽進入血液后會改變血紅蛋白正常形態(tài)，造成高鐵血紅蛋白癥；也會干擾人體對維生素A的吸收，導致血脂下降，心跳過速等；并在人體內(nèi)經(jīng)一系列代謝活動生成致癌性極強的亞硝基化合物[15]，增加了胃癌、嬰兒畸型的風險[16-17]。成人攝入0.3～0.5g亞硝酸鹽即可引起中毒，攝入3g會導致死亡。操作不規(guī)范、衛(wèi)生條件差的發(fā)酵蔬菜中多存在亞硝酸鹽含量超標的現(xiàn)象，這嚴重制約了發(fā)酵蔬菜行業(yè)的發(fā)展。2012年，世界衛(wèi)生組織（world health organization，WHO）已將發(fā)酵蔬菜列入致癌物質(zhì)清單中[18]。2017年，世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)在二類致癌物清單中公布，在導致內(nèi)源性亞硝化條件下攝入的硝酸鹽或亞硝酸鹽屬2A類致癌物。國標GB 2762—2017《食品中污染物限量》規(guī)定，蔬菜及其制品中腌漬蔬菜所含亞硝酸鹽的限量不得超過20 mg/kg[19]。

2 發(fā)酵蔬菜中乳酸菌降解亞硝酸鹽的機理

發(fā)酵初期，發(fā)酵液中含有的氧使雜菌迅速生長繁殖，產(chǎn)生的硝酸還原酶將發(fā)酵蔬菜中的硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，致使亞硝酸鹽含量急劇增加[20]。乳酸菌在蔬菜發(fā)酵過程中會代謝產(chǎn)生乳酸、酒石酸和亞硝酸還原酶等[21]，使發(fā)酵環(huán)境的pH下降，從而抑制酶活和雜菌生長[22-23]。亞硝酸還原酶和酸性環(huán)境（pH＜4.0）是發(fā)酵蔬菜中亞硝酸鹽降解的主要原因，此外，乳酸菌產(chǎn)生的細菌素也在其中起著重要作用。

2.1 酶降解

乳酸菌在蔬菜發(fā)酵的過程中會產(chǎn)生大量的代謝產(chǎn)物，其中就包括亞硝酸還原酶。研究表明，亞硝酸還原酶可有效的降解亞硝酸鹽。張慶芳等[24]對乳酸菌降解亞硝酸鹽機理進行了研究，得知在發(fā)酵前期，發(fā)酵液的pH＞4.5時，乳酸菌對亞硝酸鹽的降解以亞硝酸鹽還原酶降解為主。張馨月等[25]用電子捕獲-氣相色譜（electron capture-gas chromatography，EC-GC）法和靛酚藍染色法確定亞硝酸鹽的降解途徑，并通過測定干酪乳桿菌鼠李糖亞種（Lactobacillus caseisubsp.rhamnosus）6013細胞中不同組分的酶活研究了亞硝酸鹽還原酶的定位。實驗中，隨著NaNO2的降解，產(chǎn)物中產(chǎn)生N2O氣體，沒有NH4+。表明LCR 6013能有效降解亞硝酸鹽是源于細胞內(nèi)亞硝酸鹽還原酶的作用，最可能通過反硝化路徑NO2-→NO→N2O→N2進行降解，而非銨化作用。亞硝酸還原酶大多是胞間酶，其降解亞硝酸鹽的效果極易受到溫度和pH的影響。龔鋼明等[26]在研究乳酸桿菌（Lactobacillus）C2亞硝酸鹽還原酶制備時，對酶學性質(zhì)的分析表明，亞硝酸鹽還原酶最適溫度30℃，最適pH 5.5，在低于30℃和酸性環(huán)境中，酶活受到抑制，但仍保留活性，但在50℃以及堿性環(huán)境中時，酶活性消失。盧海強等[27]從自然發(fā)酵的酸菜樣品中獲得1株高產(chǎn)亞硝酸還原酶的冷明串珠菌（Leuconostoc gelidum）R11，并經(jīng)過發(fā)酵特性的初步研究表明，該菌最適生長溫度為20℃，且能夠在較低的溫度條件下正常生長，能夠滿足酸菜低溫發(fā)酵需求。此外，其還擁有較好的產(chǎn)酸能力。蔬菜發(fā)酵環(huán)境的多變會影響乳酸菌和亞硝酸鹽還原酶的活性，繼而影響發(fā)酵前期亞硝酸鹽降解效果，因此篩選抗逆性強的產(chǎn)亞硝酸鹽還原酶的乳酸菌對蔬菜發(fā)酵產(chǎn)業(yè)至關(guān)重要。

2.2 酸降解

蔬菜發(fā)酵過程中，乳酸菌利用糖類代謝產(chǎn)生大量酸，發(fā)酵環(huán)境的pH不斷降低[28]，使得亞硝酸鹽還原酶的活力下降，亞硝酸鹽的降解由酶降解轉(zhuǎn)為酸降解。YANG H等[29]研究表明，酸菜發(fā)酵12 d后pH值由7.3降至4.0，之后保持在pH4.1左右；發(fā)酵第6天出現(xiàn)亞硝峰，之后亞硝鹽含量不斷降低，其中6～18 d尤甚。因此可知，當pH降至5.5（第6天）后，亞硝酸鹽降解以酸降解為主。林浩[30]利用不同pH的乳酸溶液，觀察植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）對亞硝酸鹽的降解效果。發(fā)現(xiàn)當溶液初始pH值＞5.0時，亞硝酸鹽降解率在24 h內(nèi)＜20%，降解效果不顯著。當溶液初始pH≤4.0時，亞硝酸鹽含量下降明顯，其中初始pH為3.0時，亞硝酸鹽含量下降速率很快，在24 h后降解率可達87.29%，降解效果良好。此結(jié)果表明，當培養(yǎng)液中pH≤4.0時，植物乳桿菌對亞硝酸鹽的降解以酸降解為主。李春等[31]分析乳酸菌降解亞稍酸鹽的可能機制，觀察到乳酸桿菌發(fā)酵至pH≤4.0時，亞硝酸鹽含量下降急劇加快，當達到發(fā)酵終pH 3.6時，亞硝酸鹽降解率接近100%。從此結(jié)果可初步判定，乳酸菌降解亞硝酸鹽過程中，酸可能是引起亞硝酸鹽降解的主要因素，且當pH≤4.0時，酸降解效果尤為明顯。酸性發(fā)酵環(huán)境抑制了雜菌的生長繁殖和硝酸還原酶的活力，且H+與亞硝酸鹽發(fā)生非酶歧化反應(yīng)，這些都促使了亞硝酸鹽含量的降低。因此，在滿足發(fā)酵蔬菜色、香、味的前提下，適當降低發(fā)酵初期pH是減少亞硝酸鹽含量的有效方式。

2.3 乳酸菌素

乳酸菌素是由乳酸菌核糖體產(chǎn)生并分泌到胞外的一類抗菌肽，能抑制一些親緣關(guān)系相近的細菌，其可防止食品腐敗和致病菌的生長，繼而降低蔬菜發(fā)酵過程中硝酸還原酶活性和亞硝酸鹽含量[32]。乳酸菌素被認為是食品的天然保護劑[33-34]，目前，乳酸鏈球菌素（nisin）是應(yīng)用最廣泛的乳酸菌素[35]。JIANG J等[36]從中國傳統(tǒng)發(fā)酵蘿卜中分離到一株產(chǎn)細菌素的新菌株清酒乳桿菌（Lactobacillus sakei）LSJ618，其產(chǎn)生的一種脂蛋白可抑制食品腐敗菌和食源性致病菌的生長，包括革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌（Staphlococcus aureus）、李斯特氏菌（Listeria）和革蘭氏陰性菌變形桿菌（Proteus）、大腸桿菌（Escherichia coli），但并沒有抑制大多數(shù)乳酸菌。此細菌素耐酸、耐低溫，且在發(fā)酵過程中降解較少，可用作生物防腐劑。韓新鋒等[37]以產(chǎn)細菌素植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）P158純種半固態(tài)發(fā)酵制作什錦泡菜，并與傳統(tǒng)自然發(fā)酵泡菜對比發(fā)現(xiàn)，接種發(fā)酵泡菜中細菌數(shù)、霉菌、大腸菌群數(shù)量均顯著低于自然發(fā)酵泡菜，乳酸菌活菌數(shù)量明顯高于自然發(fā)酵泡菜，其中，接種發(fā)酵泡菜發(fā)酵過程中pH值下降最迅速、亞硝酸鹽含量低于自然發(fā)酵，且無明顯亞硝酸鹽高峰。由此可知，乳酸菌素可抑制發(fā)酵蔬菜中有害菌生長，并間接降低了發(fā)酵過程中亞硝酸鹽含量。LIU W L等[38]對接種產(chǎn)細菌素Y31的屎腸球菌（Enterococcus faecium）Y31發(fā)酵白菜和自然發(fā)酵白菜進行分析發(fā)現(xiàn)，接種Y31的白菜發(fā)酵速度更快、乳酸菌群數(shù)量更多、細菌素Y31產(chǎn)量更高、雜菌數(shù)量更少，且發(fā)酵液中亞硝酸根一直保持較低含量。因此，產(chǎn)細菌素Y31的屎腸球菌Y31作為一株安全菌株，與自然發(fā)酵相比，可有效地控制腐敗和病原微生物，降低亞硝酸鹽濃度，維持發(fā)酵蔬菜安全。

3 影響發(fā)酵蔬菜中乳酸菌降解亞硝酸鹽的因素

蔬菜在發(fā)酵過程中，乳酸菌對亞硝酸鹽降解情況受諸多因素影響，因此，可通過調(diào)節(jié)這些影響因素來控制亞硝酸鹽降解率，以得到安全美味的發(fā)酵蔬菜。

3.1 原材料

發(fā)酵開始前，體系中原材料及添加物會影響蔬菜發(fā)酵過程中亞硝酸鹽含量。閆亞梅等[39]以大白菜為主料，測定了不同蔬菜組合（白蘿卜、胡蘿卜、黃瓜、豇豆）自然發(fā)酵過程中亞硝酸鹽含量變化，發(fā)現(xiàn)亞硝峰的變化范圍為12～60 mg/kg，蔬菜種類越多，亞硝峰越低，即大白菜＋豇豆＋白蘿卜＋胡蘿卜＋黃瓜組合，亞硝峰最低是13mg/kg。食鹽可以調(diào)節(jié)發(fā)酵蔬菜口感、抑制細菌生長。熊濤等[40]以添加了2g/100mL、5g/100mL、8g/100mL食鹽的自然發(fā)酵泡菜為研究對象，比較了不同食鹽添加量的泡菜中優(yōu)勢菌系結(jié)構(gòu)和亞硝酸鹽含量的變化，發(fā)現(xiàn)乳酸菌是泡菜發(fā)酵的優(yōu)勢菌種，2 g/100 mL食鹽的泡菜中乳酸菌的繁殖最快；5 g/100 mL食鹽能較好地抑制有害微生物的繁殖，最快出現(xiàn)亞硝峰，1 d即可穩(wěn)定；而8 g/100 mL食鹽抑制了泡菜中乳酸菌的繁殖，延遲了泡菜的成熟期。糖類的加入為乳酸菌發(fā)酵蔬菜提供碳源，同時也可成就發(fā)酵蔬菜的風味。高潔榮等[41]研究了不同濃度綿白糖（0、2%、4%、6%、8%）對白菜自然發(fā)酵過程中亞硝酸鹽含量的影響。結(jié)果表明，當添加4%的綿白糖時發(fā)酵白菜的亞硝峰最早出現(xiàn)、最快達到穩(wěn)定且亞硝酸鹽含量最低，感官品質(zhì)最佳。

3.2 發(fā)酵條件

乳酸菌最適溫度為30～40℃，最適pH為5.5～6.5，因此發(fā)酵溫度和pH都影響乳酸菌降解亞硝酸鹽情況。田陳聃等[42]以甘藍為原料，研究不同發(fā)酵溫度（10℃、20℃、30℃）對自然發(fā)酵過程中亞硝酸鹽含量的影響，發(fā)現(xiàn)30℃時，亞硝峰出現(xiàn)的最早且峰值大，然后下降至3個發(fā)酵溫度中最低。蘇肖晶[43]在MRS培養(yǎng)基中研究了溫度、pH值、乳酸菌接種量對乳酸菌降解亞硝酸鹽含量的影響，發(fā)現(xiàn)隨著溫度升高，亞硝酸鹽的降解率逐漸增加，35℃降解效果最好，之后溫度升高降解率開始下降；pH值在5.5時，亞硝酸鹽降解效果最好，pH＜4.5條件下，對亞硝酸鹽的降解作用降低，說明此pH下，乳酸菌活性受到抑制；隨接菌量的增加，亞硝酸鹽降解率也逐漸增加，說明增加發(fā)酵體系中乳酸菌量可以提高亞硝酸鹽的降解量。柴政等[44]研究了添加不同濃度食醋（0、0.3%、0.6%、0.9%、1.2%）對泡白菜中微生物數(shù)量和亞硝酸鹽含量的影響。結(jié)果表明，相比不加食醋的泡白菜，加入食醋的泡白菜中乳酸菌數(shù)較高，腸道菌數(shù)低且總體呈下降趨勢，至第6天基本消失，亞硝峰低且變化不明顯。說明食醋能抑制亞硝酸鹽生成菌的生長繁殖，并加快乳酸菌降解亞硝酸鹽速度，促進泡白菜的成熟。

4 展望

亞硝酸鹽廣泛存在于發(fā)酵蔬菜中，對人體健康危害極大，乳酸菌降解亞硝酸鹽是一種安全的生物降解法。因此，尋找能夠快速降解亞硝酸鹽、加速發(fā)酵蔬菜成熟且抗逆性強的乳酸菌是一個重要的研究方向。使用更快速、準確的新設(shè)備追蹤蔬菜發(fā)酵過程中乳酸菌與亞硝酸鹽降解具體聯(lián)系及代謝產(chǎn)物對發(fā)酵體系的具體影響，如更多種乳酸菌素的研究發(fā)現(xiàn)。目前對于發(fā)酵蔬菜中乳酸菌降解亞硝酸鹽的研究只是實驗室小規(guī)模化研究，應(yīng)逐漸將其轉(zhuǎn)變成大型工廠化生產(chǎn)，滿足生產(chǎn)需求。