葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78在非酒精性脂肪性肝病發(fā)病中的作用*

王蘭綜述，楊云梅審校

非酒精性脂肪性肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）發(fā)病率逐年上升,已成為包括我國(guó)在內(nèi)全球慢性肝病的首要原因，嚴(yán)重危害人民生命健康。非酒精性單純性脂肪肝預(yù)后一般比較好，進(jìn)展很慢，隨訪10～20年肝硬化發(fā)生率低（0.6%～3%）。而非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH)卻可進(jìn)一步發(fā)展、惡化成為終末期肝病，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡[1]。目前NAFLD的發(fā)生發(fā)展機(jī)制至今仍尚不清楚，認(rèn)為與氧化應(yīng)激的增加、線粒體損傷、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和脂肪因子等因素相關(guān)[2，3]，但對(duì)導(dǎo)致進(jìn)行性肝細(xì)胞損傷的機(jī)制有待于進(jìn)一步探討。肝細(xì)胞內(nèi)含有豐富的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，是蛋白質(zhì)合成與翻譯后修飾，多肽鏈正確折疊與裝配的重要場(chǎng)所。在一些病理生理情況下，如肥胖、營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩導(dǎo)致未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白大量蓄積在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，為了維持ER穩(wěn)態(tài)，細(xì)胞激活未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）。UPR是一種保守性細(xì)胞自我保護(hù)性措施,通過(guò)促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對(duì)蓄積在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)的錯(cuò)誤折疊或未折疊蛋白質(zhì)的處理,使細(xì)胞功能恢復(fù)正常并使之存活。但是過(guò)強(qiáng)或者持續(xù)時(shí)間過(guò)久的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可引起細(xì)胞凋亡[4]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在NAFLD發(fā)病機(jī)制中的地位越來(lái)越受到重視[5]。

葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose regulated protein 78，GRP78）又名免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白（the immunoglobulin heavy chain binding protein，Bip），與熱休克蛋白70（Hsp70）家族具有高度同源性，是Hsp70家族的成員之一。GRP78主要分布在細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，其生物學(xué)功能主要有：阻止內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)新生肽聚集；參與UPR調(diào)控；啟動(dòng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)性細(xì)胞凋亡；參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)[6]。GRP78作為一個(gè)重要的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白，其在NAFLD的發(fā)生發(fā)展中的作用也不容忽視,現(xiàn)綜述如下。

1 GRP78的結(jié)構(gòu)

GRP78定位于9號(hào)染色體長(zhǎng)臂33區(qū)3帶，由654個(gè)氨基酸組成，具有高度保守的 EEVD氨基酸序列，與熱休克蛋白70（Hsp70）家族有高度同源性，是Hsp70家族的成員之一。 Hsp70的結(jié)構(gòu)可分為：①44 kD部分（N端）。由4個(gè)α-螺旋形成 1個(gè)裂縫，裂縫底部帶有 ATP結(jié)合位點(diǎn)，是結(jié)合ATP的結(jié)構(gòu)域，有ATPase活性；②18kD部分。由4個(gè)反相平行的β-折疊和1個(gè)α-螺旋構(gòu)成，是多膚的結(jié)合部位；③10 kD部分（C端）。主要由α-螺旋構(gòu)成，是活性調(diào)節(jié)區(qū)域，具有高度保守的EEVD氨基酸序列[7]。

GRP78主要作為ER伴侶及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，很多研究表明，當(dāng)腫瘤細(xì)胞的葡萄糖代謝改變等內(nèi)在因素改變，及或腫瘤細(xì)胞體外因素（如糖剝奪、缺氧、酸中毒）等微環(huán)境因素改變后，GRP78的表達(dá)明顯增加，從而從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞表面，作為細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的受體發(fā)揮作用。同時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激也可以提高了GRP78基因1內(nèi)含子保留，導(dǎo)致一種新的GRP78亞型表達(dá)的翻譯（grp78va），由于新亞型缺乏ER信號(hào)肽而定位在細(xì)胞漿中，調(diào)節(jié)UPR信號(hào)起到細(xì)胞保護(hù)的作用。在有些小鼠中，GRP78也存在于線粒體中，調(diào)節(jié)細(xì)胞增值和凋亡[8]。因此，GRP78可以出現(xiàn)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以外的部位，如線粒體，細(xì)胞核，移位到細(xì)胞表面，甚至能被特定的細(xì)胞系主動(dòng)分泌[9]。

2 GRP78的生物學(xué)功能

2.1 分子伴侶功能，維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)定 在生理情況下，GRP78在真核生物內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上通過(guò)與新生多肽以非共價(jià)鍵形式短暫地結(jié)合，隨后松開(kāi)，從而促進(jìn)蛋白質(zhì)的正確折疊和裝配，并協(xié)助蛋白質(zhì)跨內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜轉(zhuǎn)運(yùn)，降解錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)，維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。GRP78在應(yīng)激反應(yīng)調(diào)節(jié)時(shí)其基因的轉(zhuǎn)錄活性可提高10～25倍，表達(dá)量顯著增高，從而維持了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣穩(wěn)態(tài)及內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。饑餓的時(shí)候，GRP78通過(guò)ADP-核糖基化作用保存細(xì)胞內(nèi)有限的營(yíng)養(yǎng)。GRP78還能降低細(xì)胞對(duì)殺傷性T細(xì)胞的敏感性，阻止細(xì)胞凋亡。因此，近年來(lái)認(rèn)為細(xì)胞受刺激時(shí)GRP78呈高表達(dá)并合成Bip/GRP78的反應(yīng)，可能是細(xì)胞的一種重要的防御機(jī)制，該機(jī)制對(duì)細(xì)胞有保護(hù)作用，從而延長(zhǎng)在各種不利因素刺激下的細(xì)胞生存期[10]。同時(shí)，GRP78還具有潛在的抑制細(xì)胞凋亡的作用，它主要通過(guò)抑制促凋亡分子BIK和caspase 7的活化從而發(fā)揮抗凋亡的作用。腫瘤細(xì)胞也存在GRP78的保護(hù)作用：GRP78可降低細(xì)胞毒性 T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷力，促進(jìn)腫瘤的生成和抗藥性產(chǎn)生，防止腫瘤細(xì)胞凋亡。GRP78缺乏可導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹，無(wú)法形成自噬體，因此抑制了應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬[11]。

2.2 腫瘤細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)器 GRP78存在于腫瘤細(xì)胞的表面，可以作為腫瘤細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和生存能力的重要調(diào)節(jié)器，通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖[12]。1997年GRP78被發(fā)現(xiàn)存在于惡性淋巴瘤的淋巴細(xì)胞和白血病細(xì)胞的表面。陸續(xù)也有報(bào)道，GRP78存在于NG 108-15（一種神經(jīng)母細(xì)胞瘤與膠質(zhì)細(xì)胞瘤雜交的細(xì)胞），肺腺癌（A549）、結(jié)腸癌（LoVo）、黑色素瘤細(xì)胞（Me6652/4）、骨肉瘤細(xì)胞（SJSA-1）和肝癌細(xì)胞（HepG2）和胃癌細(xì)胞（23132/87）等腫瘤細(xì)胞的表面，通過(guò)與其他蛋白在細(xì)胞表面形成復(fù)合體，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[13]。

2.3 調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的生存 GRP78在增值的內(nèi)皮細(xì)胞和單核細(xì)胞的細(xì)胞表面表達(dá)，與這些細(xì)胞的的主要組織相容復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）I形成復(fù)合體，調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的生存。由于腫瘤的進(jìn)展通常需要腫瘤血管生成，從而保證腫瘤細(xì)胞的的營(yíng)養(yǎng)和氧氣供應(yīng)，抗血管生成可以阻止腫瘤生長(zhǎng)[14]。人纖溶酶原Kringle 5已被證明可以結(jié)合增殖的內(nèi)皮細(xì)胞表面GRP78，形成重組Kringle 5（recombinant Kringle 5；rK5），增強(qiáng) caspase-7 活性，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的凋亡[15]。更有研究報(bào)道，GRP78存在于動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)皮表面，負(fù)調(diào)控組織因子介導(dǎo)的凝血級(jí)聯(lián)啟動(dòng)[16]。

2.4 GRP78可以作為病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞受體 有研究報(bào)道，柯薩奇病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞需要主要組織相容性復(fù)合體I類(lèi)分子。GRP78后來(lái)被證明作為共受體與MHC I類(lèi)分子在細(xì)胞表面形成復(fù)合體有助于病毒內(nèi)化[17]。GRP78表達(dá)于肝癌細(xì)胞表面，可以作為2型登革病毒進(jìn)入肝癌細(xì)胞的受體，登革病毒也可直接作用于GRP78的N端和C端，從而影響病毒的傳染性[18]。

2.5 分泌型的GRP8 在研究蛋白酶體抑制劑-硼替佐米抑制腫瘤血管形成的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，一些腫瘤細(xì)胞系可以分泌高滴度的GRP78在腫瘤的微環(huán)境中[19]。在胃癌的蛋白質(zhì)組學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)，與正常人群相比，胃癌患者血清中GRP78的陽(yáng)性率為28%。重要的是，在胃癌和肝癌的患者血清中檢測(cè)出GRP78自身抗體[20]。因此，分泌性GRP78能夠調(diào)節(jié)多種病理和生理中的生物學(xué)過(guò)程。

2.6 細(xì)胞漿GRP78 GRP78被發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞漿中，主要調(diào)節(jié)UPR的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，病毒蛋白的組裝，通過(guò)修飾UPR信號(hào)，從而影響腫瘤細(xì)胞的生存[21]。最近的一項(xiàng)研究表明，GRP78蛋白可能通過(guò)掩飾其C-末端KDEL信號(hào)存在于胞漿的裝配室中[22]。

2.7 線粒體GRP78 最近研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激過(guò)程中，線粒體中的GRP78過(guò)表達(dá)可以保護(hù)星形膠質(zhì)細(xì)胞的缺血損傷，降低了Ca2+從ER到線粒體，增加線粒體對(duì)Ca2+的吸收能力，減少自由基的產(chǎn)生，并保護(hù)呼吸鏈活性和線粒體膜電位穩(wěn)定，提示GRP78可調(diào)節(jié)線粒體功能，如平衡能量消耗和維持線粒體穩(wěn)態(tài)[23]。

2.8 細(xì)胞核GRP78 一個(gè)蛋白質(zhì)組學(xué)的研究顯示，用γ線照射哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核中的GRP78與DNA相互交聯(lián)，說(shuō)明GRP78可以抵抗DNA損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[24]

3 GRP78在NAFLD發(fā)病中的作用

肝臟是維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)平衡的重要器官，參與機(jī)體糖代謝、糖原儲(chǔ)存、氨基酸和核苷酸的合成、血漿蛋白和激素的生物合成和脂質(zhì)代謝。肝臟甘油三酯的產(chǎn)生受多種機(jī)制的調(diào)節(jié)，包括體內(nèi)脂肪的合成，脂肪酵解，飲食脂肪的攝入和脂蛋白顆粒的運(yùn)輸和分泌。氧應(yīng)激、化學(xué)物質(zhì)毒性、肝臟病毒感染、代謝紊亂，藥物的濫用和酒精的過(guò)多攝入均可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，損傷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能，脂肪穩(wěn)態(tài)失衡，導(dǎo)致脂肪肝。目前有關(guān)GRP78在NAFLD的發(fā)生發(fā)展中的研究的報(bào)道逐年上升。有研究報(bào)道，特異性敲除肝臟Grp78基因?qū)е螺p度脂肪肝和肝臟的損傷，而且會(huì)加重酒精、高脂飲食、藥物和毒素對(duì)肝臟的損傷，從而提示GRP78總的來(lái)說(shuō)對(duì)肝臟起保護(hù)作用[25]。但同樣，閔敏[26]等人觀察了高脂飲食誘導(dǎo)大鼠NASH發(fā)病過(guò)程中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物GRP78的表達(dá)變化,結(jié)果表明，NASH組大鼠血清ALT、AST、FFA、TG和肝組織MDA水平均較對(duì)照組有不同程度的升高。肝組織GRP78基因和蛋白表達(dá)也隨 NASH 加重而增強(qiáng),16周時(shí)升高最為顯著（P＜0.01）。因此，提示GRP78有可能通過(guò)啟動(dòng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,導(dǎo)致脂質(zhì)異常沉積,參與了NASH的發(fā)生發(fā)展。拜明軍[27]等人探討了油酸（不飽和脂肪酸）和軟脂酸（飽和脂肪酸）對(duì)脂肪變性L02肝細(xì)胞凋亡和葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）表達(dá)的影響。結(jié)果顯示不同性質(zhì)的脂肪酸均可導(dǎo)致L02細(xì)胞發(fā)生以甘油三酯升高為特點(diǎn)的脂肪變性，均可引起不同程度的肝細(xì)胞凋亡，軟脂酸組在48和72h的細(xì)胞凋亡率顯著高于對(duì)照組、DMSO組以及油酸組，同時(shí)伴有GRP78蛋白及mRNA表達(dá)的明顯增加。說(shuō)明油酸不能影響GRP78的表達(dá)，飽和脂肪酸可能通過(guò)上調(diào)葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78的表達(dá)誘導(dǎo)脂肪變性肝細(xì)胞的凋亡。說(shuō)明GRP78通過(guò)啟動(dòng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)肝細(xì)胞的凋亡。Li et al[28]研究顯示，大黃素對(duì)大鼠非酒精性脂肪肝有治療作用，可以降低非酒精性脂肪肝大鼠的體重、肝指數(shù)、血清TG，其主要機(jī)制是大黃素通過(guò)抑制GRP78，降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，通過(guò)ERS-SREBP1c通路在果糖誘導(dǎo)的非酒精性脂肪肝的過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。林勝利[29]等人通過(guò)對(duì)成年大鼠持續(xù)腹腔注射CCL4，發(fā)現(xiàn)大鼠肝組織中有大量的脂肪空泡形成，同時(shí)MDA水平和GRP78蛋白表達(dá)顯著升高，而?；撬岷虲CL4聯(lián)合作用的大鼠肝組織中，甘油三酯和膽固醇含量較單純用CCL4組明顯降低，且肝組織中MDA和GRP78含量顯著下降。結(jié)果表明，調(diào)節(jié)GRP78表達(dá)可抑制細(xì)胞內(nèi)脂肪合成，CCL4刺激脂肪形成時(shí)GRP78升高也是一種內(nèi)在的抗肝細(xì)胞脂肪堆積的保護(hù)機(jī)制。Wei et al在培養(yǎng)鼠H4IIE肝癌細(xì)胞時(shí)也發(fā)現(xiàn)，飽和脂肪酸（軟脂酸）能誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激GRP78表達(dá)，激活caspase系列；不飽和脂肪酸（油酸 ）則不能[30]。在吳逸園[31]等人的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究中，通過(guò)RNAi特異沉默人肝癌HepG2內(nèi)源性GRP78或過(guò)表達(dá)外源性GRP78，結(jié)果表明GRP78具有抑制生脂相關(guān)酶基因和SREBP-1轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，降低HepG2細(xì)胞內(nèi)的脂肪堆積的作用。

因此，我們可以推斷，在非酒精性脂肪性肝病的不同疾病譜階段，GRP78發(fā)揮著不同的作用。在單純性脂肪肝階段，GRP78表達(dá)升高，激活了未折疊蛋白反應(yīng)，參與了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣穩(wěn)態(tài)的平衡，維持著內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，抑制肝細(xì)胞內(nèi)的脂肪蓄積。在非酒精性脂肪肝性肝炎階段，隨著內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的不斷加強(qiáng)，GRP78表達(dá)升高，不足以抵抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的細(xì)胞凋亡，隨著肝臟炎癥因子的不斷釋放，促使了NAFLD的進(jìn)展。

近來(lái)研究表明，很少數(shù)NAFLD患者可進(jìn)展為肝細(xì)胞性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）[32]。目前關(guān)于 NAFLD 導(dǎo)致HCC的確切機(jī)制尚不明確。但NASH-隱源性肝硬化-HCC的發(fā)病模式已被眾多學(xué)者所認(rèn)可[33，34]。White et al[35]回顧了一些縱向研究結(jié)果，探討了HCC在NAFLD/NASH的流行情況，結(jié)果表明，隨訪了NAFLD患者21年，HCC的患病率為0%～3%，其中最早一例發(fā)生在NAFLD診斷后5.6年。而且HCC在NAFLD-肝硬化中的發(fā)生率為2.4%，平均隨訪時(shí)間為7.2年。一項(xiàng)日本的臨床回顧性研究表明，既往大多數(shù)日本HCC的患者是在慢性丙型肝炎的基礎(chǔ)上發(fā)生的。近來(lái)，由于抗病毒治療和丙肝發(fā)病率的降低，非乙非丙型肝炎相關(guān)的HCC的發(fā)病率有所上升，有資料顯示大約10%的NAFLD患者進(jìn)展為NASH，3%NASH患者進(jìn)展為肝細(xì)胞肝癌。NASH相關(guān)的HCC的高危因素包括進(jìn)展性肝纖維化、高齡、遺傳因素和飲食模式[36]。Arase et al隨訪了1600例≥60歲的NAFLD患者8.2年，NASH相關(guān)的HCC的發(fā)病率為0.63%[37]。因此，NASH相關(guān)HCC越來(lái)越受到研究者們的關(guān)注。然而，目前尚無(wú)簡(jiǎn)單、快速和特異性檢測(cè)NAFLD/NASH相關(guān)HCC的腫瘤標(biāo)志物。已有結(jié)果表明，Grp78f/f；Alb-Cre雄性小鼠隨著年齡增長(zhǎng)肝臟不會(huì)出現(xiàn)惡性病灶，而Grp78f/f;Alb-Cre雌性小鼠在長(zhǎng)期酒精喂養(yǎng)后會(huì)出現(xiàn)DNA甲基化的改變和ERAD基因的表達(dá)，標(biāo)志著肝臟出現(xiàn)腫瘤樣包塊。與單純敲除腫瘤抑制因子PTEN基因相比，同時(shí)敲除肝臟GRP78和PTEN基因，小鼠會(huì)出現(xiàn)肝腫大，脂肪肝，肝損傷和肝細(xì)胞增殖，形成肝細(xì)胞肝癌和膽管細(xì)胞癌，說(shuō)明GRP78促進(jìn)腫瘤的生成[38]。我們知道，GRP78不僅維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)定，還可以存在腫瘤細(xì)胞表面，調(diào)節(jié)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增值。因此，GRP78在NAFLD相關(guān)肝癌的發(fā)生中是否發(fā)揮重要的作用，目前尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，我們相信隨著對(duì)GRP78蛋白的深入研究，將有助于探討NASH相關(guān)HCC發(fā)病機(jī)制，為HCC的早期預(yù)防和早期發(fā)現(xiàn)提供理論依據(jù)。

4 GRP78的研究展望

近來(lái)研究表明，GRP78可以定位在細(xì)胞內(nèi)的多個(gè)細(xì)胞器與細(xì)胞應(yīng)對(duì)各種應(yīng)激的適應(yīng)性生存密切相關(guān)[39]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是如何促進(jìn)GRP78從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)移位到細(xì)胞表面、細(xì)胞漿和線粒體的機(jī)制有哪些？細(xì)胞胞漿中的GRP78的相互作用伴侶有哪些？影響了哪些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路？GRP78在NAFLD/NASH相關(guān)HCC中是否及如何發(fā)揮作用？我們相信，隨著對(duì)GRP78蛋白的更深入研究，有助于我們挖掘出NAFLD的新的發(fā)病機(jī)制，為NASH的早期阻斷，預(yù)防NAFLD相關(guān)肝癌的發(fā)生提供理論依據(jù)。

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