骨關節(jié)炎與骨質疏松癥二病合一的動物模型研究進展*

黃海衛(wèi) 王海波 李 佳

膝骨性關節(jié)炎(knee osteoarthritis，KOA)是骨性關節(jié)炎中常見的疾病之一，也是引起膝關節(jié)疼痛性疾病中最常見的病因，其發(fā)病特點以軟骨下骨質再生、關節(jié)軟骨變形和丟失為特征，其臨床表現(xiàn)特點為膝關節(jié)疼痛、畸形、活動受限以及骨質增生。

隨著現(xiàn)代社會進入老齡化，人群平均壽命增加，KOA的發(fā)病率及致殘率也隨之增加。據(jù)大量臨床調查數(shù)據(jù)證實：目前中國60歲以上人口已超過1億，估計骨關節(jié)炎患者約為5000萬。王奕丹等[1]對哈爾濱市社區(qū)中老年人患骨關節(jié)炎的流行病學調查結果顯示：KOA患者中男女發(fā)病率分別為7.23%和10.09%，女性明顯高于男性，且女性發(fā)病率隨年齡增加明顯升高。因此，積極防治KOA具有需求性和必要性，而中醫(yī)藥防治KOA具有良好療效，但療效機制尚不清楚。

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是一種老年常見疾病，是以骨量減少，骨小梁變細、斷裂及數(shù)量減少，以及皮質骨多孔和變薄為特征的全身性疾病，其臨床特點是疼痛(腰背部多見)、脊柱椎體變扁、脆性骨折發(fā)生率增高、吸收功能下降等。據(jù)2010-2016年中國老年人OP患病率高達36%，較既往文獻報道的患病率有所增高，同時老年女性OP患病率明顯高于男性，其主要原因與女性絕經(jīng)后雌激素水平明顯降低有關[2]。

在臨床實踐中發(fā)現(xiàn)，同時患有OP和骨關節(jié)炎的患者占有相當大的比例[3-4]。二者的共同點在于：臨床癥狀表現(xiàn)高度相似，均以疼痛為主要癥狀，并經(jīng)常相伴、重疊發(fā)生。同時，針對大量動物及人類標本發(fā)現(xiàn)，微觀表現(xiàn)上OP與骨關節(jié)炎(osteoarthritis，OA)也存在一定聯(lián)系[5-6]。鑒于臨床中發(fā)現(xiàn)的這些問題，同時具備OA與OP特點的動物模型，在解決臨床問題的前提下，綜述2008-2018年10年間關于OA+OP的動物模型，并進行分析整理。目前國內(nèi)外較為常用的造模方案包括去勢手術模型方案、去勢手術+運動模型方案、去勢+骨關節(jié)炎手術造模方案、藥物造模方案以及去勢手術+關節(jié)腔注射藥物造模方案，但造模方案各有優(yōu)點及不足，為此，總結各種造模方案的優(yōu)缺點，以期能為科研及臨床工作提供參考。

1 去勢手術模型方案

周君等[7]認為，OP與OA均是中老年人，尤其是絕經(jīng)后婦女常見的運動系統(tǒng)疾病，其臨床表現(xiàn)相近，均以疼痛為主要癥狀，同時OA主要以關節(jié)退變、破壞和軟骨下骨板、關節(jié)邊緣骨質增生為特征，OP主要表現(xiàn)為骨量減少、骨顯微結構紊亂脆性增加，無論臨床研究還是動物實驗均證實二者存在相關性，此相關性可能與雌激素受體α、β有關[8-9]。因此，提出單純應用去勢手術方案造成OA+OP動物模型。其前期結果證實，將Wistar大鼠行去勢手術后可得到OA+OP模型[10]。隨后將此技術應用于新西蘭大白兔也獲得成功，具體方案為腹腔注射5%水合氯醛(3 ml/kg)麻醉后，固定于新西蘭大白兔專用手術臺，備皮，0.5%碘伏消毒手術野，無菌紗布鋪巾，在腹正中線切開皮膚、肌肉，結扎卵巢動脈，行雙側卵巢切除，用無菌生理鹽水沖洗手術野，依次縫合肌肉、皮下組織及皮膚，0.5%碘伏消毒皮膚切口。術后每只實驗兔肌肉注射慶大霉素4×104U，1次/d，連續(xù)3 d以預防感染。術后大白兔飼養(yǎng)環(huán)境為：室溫20～26 ℃，濕度為60%～70%，定期紫外線消毒和通風、12 h間隔照明的條件下分籠飼養(yǎng)，自由攝取標準飼料和消毒蒸餾水[7]。去勢10周后，即得到OA+OP動物模型。其觀察指標為雌二醇測定、膝關節(jié)軟骨組織形態(tài)學觀察及軟骨改良Mankin評分。

OA+OP模型結果顯示，OP及軟骨退變可同時存在于一個實驗動物身上，表明OP與OA密切相關，具有較強的創(chuàng)新性。該理論也得到了楊再英等[11]、Roman-Blas等[12]關于臨床患者觀察結果的證實。

宋宇鋒等[13]在時間上提出：其將8月齡SD大鼠行去勢手術后，分別在術后2周、4周、8周及12周觀察Mankin’s評分、軟骨厚度測量，發(fā)現(xiàn)在8周、12周時兩項觀察指標與對照組相比均發(fā)生改變，且符合OA改變。

2 去勢手術+運動模型方案

去勢手術造模方案是目前公認的針對OP的經(jīng)典造模方案之一，周逸敏等[14]在去勢手術的基礎上，利用跑臺疲勞訓練方案成功建立OP+OA模型。具體方案為：①去勢手術OP模型制備，采用6月齡雌性大鼠，無菌條件下，10%水合氯醛腹腔麻醉，腹部正中線入路，摘除雙側卵巢、末端子宮以及周圍脂肪組織，結扎卵巢動脈；②KOA模型制備，在①的基礎上，大鼠術后休息一周，于跑步臺疲勞性訓練，速度為30 m/min，頻率為60 min/d，跑步臺坡度為16°，每周休息1 d，連續(xù)訓練4周。即得到OP+OA模型。

其觀察指標為大體標本觀察、力學測試及組織切片及染色，血清中雌二醇(Estadiol，E2)含量及尿液中II膠原羧基端前肽(C Terminalpropep-Tide of Collagen type II，CTX-II)含量測定，結果顯示OP+OA模型各項指標均優(yōu)于空白對照組及OP組[14]。此造模方案已經(jīng)得到科研工作者的普遍認可，但對于運動劑量、時間及方式的選擇存在爭議。

李楠等[15]在去勢造模的基礎上，將大鼠分為弱驅動組和強驅動組，并在卵巢切除術后3 d即進行跑輪(自行設計、制作)運動，分別為30 min/d和2 h/d。其特點是觀察大鼠右側髖關節(jié)股骨頭軟骨變化。參照李楠的觀察指標為大體標本觀察、組織切片染色及大鼠OA模型Mankin評分。造模結果顯示：弱驅動組及強驅動組均出現(xiàn)類似OA模型的改變，后者優(yōu)于前者[15]。

Holland等[16]利用綿羊[17]進行去勢手術，結果也證實去卵巢手術后綿羊模型膝關節(jié)也出現(xiàn)類似OA表現(xiàn)。其選擇5～9歲綿羊為動物模型，行雙側卵巢切除手術，自由草地活動并自由進食，術后12周處死綿羊并立即取標本于-20 ℃保存，同時對標本的骨密度、脛骨平臺軟骨高度、軟骨下骨分析、股轉換率測定、OA分期分級等指標進行觀察。綜合分析結果發(fā)現(xiàn)：卵巢切除術后綿羊膝關節(jié)出現(xiàn)OA表現(xiàn)，證明此OA+OP造模方案可行；但軟骨下骨與對照組相比，并無明顯改變，表明軟骨下骨改變與OA無直接關系。

3 去勢手術與關節(jié)腔注射藥物造模

3.1 去勢+OA手術

經(jīng)典Hulth造模手術。國內(nèi)外學者[18-19]多采用去勢手術結合經(jīng)典KOA手術造模方案，如盧勇等[20]選擇4月齡雌性SD大鼠行去卵巢手術(行背部雙側腰椎旁1.5 cm縱行切口入腹)，切除卵巢，結扎卵巢動脈，并于1個月后再行Hulth造模法：在左臏腱內(nèi)側做一長約1 cm直切口，依次切開皮膚、皮下組織、筋膜等，關節(jié)囊縱向切開，直視下切斷前交叉韌帶，摘除半月板，依次縫合皮下組織和皮膚，并驅趕1個月，1 h/d。造模術后SD大鼠于6月齡(即去勢手術后2月，Hulth手術后1月)觀察股骨髁關節(jié)軟骨光鏡、電鏡及左股骨近端骨密度檢測，結果顯示，模型組股骨髁關節(jié)軟骨符合OA改變。

李季青等[21]也通過去勢結合前交叉韌帶+內(nèi)側半月板切除術(ACLT+MMX)手術得到OP及創(chuàng)傷性關節(jié)炎動物模型。其選擇4月齡SD雌性大鼠，腹腔注射氯胺酮麻醉，手術摘除雙側卵巢，12周后再次運用ACLT+MMX手術建立骨關節(jié)炎模型，8周后即得到OA+OP模型。脛骨Micro-CT結果顯示：OP+OA組大鼠中OP促進軟骨下骨量減少；OP+OA組軟骨下骨損失和軟骨損傷較OA組增加，表明OP是OA發(fā)生的危險因素之一。

張佳慧等[22]則利用新西蘭大白兔行OA+OP造模后成功，其選擇6月齡普通級雌性新西蘭大白兔，體重控制在1.8～2.1 kg，去勢方案造模4周后，采用改良Hulth法建立OA模型，并于術后1周強迫鍛煉，30 min/d，連續(xù)4周，建立OA+OP動物模型。

國外學者也利用去勢手術結合激素注射后，再結合膝關節(jié)手術也可以得到OP+OA動物模型。

Bellido等[23]選擇8月齡新西蘭兔，體重控制在3.8～4.8 kg，現(xiàn)行去勢手術(卵巢切除術)后肌內(nèi)注射甲基強的松龍(1 mg/kg/d，4周)即得到OP模型，然后利用手術方案(切除內(nèi)側半月板，切除前交叉韌帶)后，動物自由活動，3周后即得到OA+OP動物模型。以OP誘導軟骨OP和OA復合兔模型的損傷[24]。

3.2 藥物造模

楊森林[25]選擇去勢大鼠模型、維甲酸大鼠模型(75 mg/kg/d，共15 d)，觀察指標為大體標本觀察、骨密度儀檢測及膝關節(jié)上下3 cm軟骨下骨密度檢測，結果發(fā)現(xiàn)8周、12周時維甲酸組的脛骨關節(jié)軟骨厚度均明顯低于去勢組，12周時軟骨肉眼觀察結果評分明顯高于去勢組，表明隨著軟骨下骨質疏松加重，OA也不斷加重。

3.3 去勢手術+關節(jié)腔注射藥物造模

彭冰等[26]選擇平均體重35 g的費城癌癥研究所(Institute of Cancer Research，ICR)健康雌性小鼠，水合氯醛麻醉后，選擇腹部正中切口摘除雙側卵巢，4周后以微量注射器關節(jié)腔內(nèi)注射碘乙酸30 μl。8周后即得到OA+OP模型：X射線影像、骨密度測定、組織病理學觀察等結果均符合OA及OP表現(xiàn)。關節(jié)腔注射碘乙酸造模方案具有時間段、效果明顯及損傷小等優(yōu)點，故臨床較為常用。

3.4 動物的選擇

針對動物的造模，較為公認的是大鼠造模及大耳白兔造模，其優(yōu)點是動物較大，行去勢造模時目標器官較容易切除，抗手術創(chuàng)傷能力較強，且價格相對較低。

4 結語

目前，針對OA或者OP的動物模型，已經(jīng)得到廣泛認可，但是二者合病的模型仍處于研究階段。如同一動物，OA或OP造模的先后順序，目前仍無定論；目前大多學者認為，OA造模后，通過運動可造成膝關節(jié)軟骨類OA的改變，因此OP+OA手術造模方案中，是否會對軟骨改變造成影響，仍有待進一步研究。