脾氣虛證大鼠尿液生物標(biāo)記物的識別及其生物學(xué)意義

劉武平+李嬋藝+黃晶+廖婧竹+馬文杰+陳宏遠(yuǎn)+芮雯

[摘要] 考察脾氣虛證大鼠尿液小分子代謝組成分，尋找脾氣虛證的標(biāo)記物，闡明其與代謝通路之間的聯(lián)系。采用勞倦傷脾加限制飲食的方法構(gòu)建大鼠脾氣虛證動物模型，分別進(jìn)行D-木糖吸收實驗及血常規(guī)檢測。收集的尿液采用超高效液相色譜-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用（UPLC-Q-TOF-MS）分析，尿液代謝指紋圖譜數(shù)據(jù)集進(jìn)行主成分分析（PCA）和正交偏最小-判別分析（OPLS-DA）等統(tǒng)計學(xué)分析，篩選脾氣虛證的生物標(biāo)記物。D-木糖和血常規(guī)測定結(jié)果表明脾氣虛證大鼠造模成功。正、負(fù)離子模式下的PCA，OPLS-DA得分圖顯著區(qū)分模型組和空白組。根據(jù)OPLS-DA分析的S-plot圖、VIP值、t檢驗及受試者特征曲線ROC下的面積（AUC），篩選并鑒定出苯丙氨酸、琥珀酸、烏頭酸、異檸檬酸、甜菜堿、犬尿酸、吲哚、肌酸、肌酸酐、乳清酸、黃嘌呤、黃嘌呤酸等24個脾氣虛證相關(guān)的生物標(biāo)記物，主要涉及能量代謝、氨基酸代謝、色氨酸代謝、嘌呤代謝、嘧啶代謝。尿液代謝組學(xué)方法結(jié)合在線軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理解析代謝通路，可為脾氣虛證及其他中醫(yī)證候的研究提供新的方法和思路。

[關(guān)鍵詞] 脾氣虛證； 代謝組學(xué)； 代謝指紋圖譜； 超高效液相色譜-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用； 生物標(biāo)記物

[Abstract] To identify biomarkers for spleen Qi deficiency by analyzing small molecule metabolites in urine， in order to expound the relationship between biomarkers and metabolic pathways. The spleen Qi deficiency model was established through dietary restriction and overstrain. All of the rats received D-xylose absorption experiment and blood routine test. Urine samples were collected in the next day. The urine samples were analyzed using UPLC-Q-TOF-MS to obtain the dataset of urine metabolic group. Principal component analysis （PCA）， orthogonal partialleast squares-discriminant analysis （OPLS-DA） and other multivariate statistical methods were employed to evaluate the quality of the dataset and screen out potential biomarkers of spleen Qi deficiency. The results of D-xylose absorption and blood routine demonstrated that the spleen Qi deficiency model was successfully established. In positive ion mode and negative ion mode， PCA and OPLS-DA score plots could clearly distinguish model group and blank group. According to S-plot of OPLS-DA， VIP value， t-test and area under receiver operating characteristic curve （ROC）， 24 biomarkers， including phenylalanine， succinic acid， aconitic acid， isocitrate acid， betaine， kynurenine， indole， creatine， creatinine， orotic acid， xanthine， and xanthurenic acid， were identified as associated with the spleen Qi deficiency， mainly involving energy metabolism， amino acid metabolism， tryptophan metabolism， purine metabolism and pyrimidine metabolism. Urine metabolomics method combined with online software package for data processing and analysis metabolic pathway can provide new methods and ideas for studies for spleen Qi deficiency and other traditional Chinese medicine symptoms.

[Key words] spleen Qi deficiency； metabolomics； metabolic fingerprint； UPLC-Q-TOF-MS； biomarker

代謝組學(xué)是測定生物體受病理生理刺激和基因修飾所產(chǎn)生的與時間相關(guān)的多元代謝產(chǎn)物的一門新學(xué)科[1]。通過分析生物體液和組織中內(nèi)源性代謝物，可以尋找代謝物變化與整體生物學(xué)狀況的關(guān)系。近年來，代謝組學(xué)發(fā)展迅速，已經(jīng)在植物學(xué)、毒理學(xué)、臨床診斷、藥物研發(fā)、營養(yǎng)科學(xué)等研究領(lǐng)域都得到了廣泛的應(yīng)用[2]。代謝組學(xué)技術(shù)對于建立中醫(yī)病癥和機(jī)制的關(guān)系發(fā)揮重要的作用。endprint

脾氣虛證是臨床常見的中醫(yī)病癥之一，是因脾氣不足，運(yùn)化失職所表現(xiàn)的虛弱證候[3]。脾氣虛證導(dǎo)致水谷精微運(yùn)化不良、水液停滯而引起體內(nèi)各種物質(zhì)代謝紊亂，出現(xiàn)腹脹食少，大便溏薄，肢體倦怠，神疲乏力，氣短懶言，形體消瘦等癥狀[4]。目前，脾氣虛證的診斷多采用血清胃泌素、尿D-木糖排泄率、動物體征等指標(biāo)，而這些指標(biāo)難以系統(tǒng)闡述脾氣虛證的本質(zhì)。脾氣虛證標(biāo)記物的研究多為找出差異代謝物，而對于代謝物與脾氣虛證的本質(zhì)的相關(guān)性卻報導(dǎo)較少。徐熒等[5]應(yīng)用代謝組學(xué)探討脾氣虛大鼠血清小分子的變化，得到了一些與能量代謝相關(guān)的脾氣虛證的標(biāo)記物。戰(zhàn)麗彬等[6]分析血漿小分子代謝組成分，發(fā)現(xiàn)了3個脾氣虛證代謝綜合癥的生物標(biāo)記物。尿液是代謝組學(xué)研究重要的樣本之一，其含有多種內(nèi)源性的小分子代謝物，能夠很好的反應(yīng)機(jī)體的變化。尿液具有非損傷性、樣品量大優(yōu)點，且尿液中蛋白含量低，前處理簡單。相比血清，尿液中共軛化合物的數(shù)量高于血清[7]。因此，本實驗從尿液代謝物入手，采用UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)進(jìn)行尿液代謝組學(xué)分析，通過R語言相關(guān)包進(jìn)行多元統(tǒng)計分析篩選脾氣虛證標(biāo)記物，并尋找與脾氣虛證相關(guān)的代謝通路，闡明代謝標(biāo)記物與脾氣虛本質(zhì)的聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 UPLC-Q-TOF-MS 分析儀（美國Waters公司），Masslynx V4.1軟件 （美國Waters公司），F(xiàn)RESCO17低溫高速離心機(jī)（Thermo公司），紫外分光光度計（美國Beckman公司），DL-360A超聲波清洗器（上海之信儀器有限公司），甲醇、乙腈（色譜純，德國Merck公司），甲酸（色譜純，德國CNW科技公司），亮氨酸-腦啡肽對照品（Sigma公司），超純水（屈臣氏）。

1.2 動物實驗和樣品收集 雄性SD大鼠22只，體質(zhì)量（200±20） g，購自廣東藥科大學(xué)動物實驗中心，健康證號44005900001668。脾氣虛模型的構(gòu)建按先前的研究方法進(jìn)行[8]。過程如下：所有動物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，供試動物分為2組，空白組（K）11只，模型組（M）11只?？瞻捉M常規(guī)方法飼養(yǎng)，模型組單日游泳加禁食，雙日限制飲食（75 g·kg-1）的方式造模15 d，第16天進(jìn)行大鼠血常規(guī)檢查和D-木糖吸收實驗。血常規(guī)檢測送于廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院。第17天收集各大鼠的24 h尿液，保存于-80 ℃冰箱中備用。

尿液樣品室溫解凍。200 μL尿液加入300 μL的乙腈，渦旋2 min，4 ℃，13 000 r·min-1離心15 min，吸取上清液加入進(jìn)樣瓶，待UHPLC-MS分析。吸取10 μL的各組尿液混合制成質(zhì)量控制（QC）樣品。

1.3 UPLC-Q-TOF/MS分析樣品 色譜條件：色譜柱Acquity UPLCTM HSS T3（2.1 mm×50 mm，1.7 μm，Waters公司）；預(yù)柱為Waters AQUITY UPLC HSS T3 Van Guard Pre-Column（2.1 mm×5 mm，1.8 μm，Waters公司）；進(jìn)樣量5 μL；流速0.3 mL·min-1，柱溫25 ℃；進(jìn)樣室溫8 ℃，流動相為乙腈（B）和0.1 %甲酸水（A）。梯度洗脫條件：0～3 min，5%～20% B；3～7 min，20% B；7～18 min，20%～50% B；18～19 min，50%～100% B，19～20 min，100% B；20～21 min，100%～5% B；21～23 min，5% B。

質(zhì)譜條件：采用ESI離子源，在正離子、負(fù)離子模式下分別采集數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)采集范圍m/z 100～1 500。離子源參數(shù)：毛細(xì)管電壓3 kV，錐孔電壓30 V，離子源溫度100 ℃，脫溶劑溫度300 ℃，霧化氣（N2）流速50 L·h-1，脫溶劑氣（N2）流速 500 L·h-1；碰撞能量（CE）10～40 eV。由于代謝物的濃度比較低，二級質(zhì)譜的解離電壓設(shè)為10～20 V，以保證每個離子能夠得到碎片離子。Lock Mass為腦啡肽，實時校正的質(zhì)量數(shù)：正離子模式[M+H]+為m/z 556.277 1，負(fù)離子模式[M-H]-為 m/z 554.261 5。流速為 0.02 mL·min-1，電噴霧的頻率為10 s。所有上訴的參數(shù)設(shè)置均采用Masslynx軟件控制，并進(jìn)行數(shù)據(jù)的收集。

進(jìn)樣程序：實驗首先進(jìn)QC樣品5次以平衡色譜柱和系統(tǒng)，然后分析樣品。每5個樣品插入1個QC樣品，所有樣品隨機(jī)進(jìn)樣，同批次進(jìn)行，消除進(jìn)樣次序和批次對分析結(jié)果的影響。正、負(fù)離子模式均采用上述進(jìn)樣方式。

1.4 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)處理所用到的相關(guān)軟件為：Masslynx軟件，MSconvent軟件，R語言（3.2.3版本），R相關(guān)軟件包（xcms[9]，ropls[10]，metabolomics，pROC，pheatmap）。具體過程：液質(zhì)數(shù)據(jù)文件（.Raw）通過MSconvent軟件轉(zhuǎn)換為（.cdf）文件，轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)通過xcms包進(jìn)行峰識別，峰匹配，峰校正，峰積分，最終得到一個保留時間、質(zhì)荷比和峰強(qiáng)度的三維數(shù)據(jù)矩陣。xcms包所用函數(shù)分別為xcmsSet，retcor，group，fillPeaks，這些函數(shù)的相關(guān)參數(shù)設(shè)定為fwhm=10，bw=10，sn=5，mzrange=100～1 500。用metabolomics包中的Normalise函數(shù)對數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行歸一化，函數(shù)參數(shù)method設(shè)定為sum。ropls包中的opls函數(shù)對數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行PCA分析和OPLS-DA分析，PCA分析中opls函數(shù)的參數(shù)設(shè)定為scale="center"（中心化處理），其余參數(shù)用默認(rèn)參數(shù)；OPLS-DA分析opls函數(shù)參數(shù)設(shè)定為scale="center"、predI=1（預(yù)測的主成分個數(shù)）、permI=1 000（置換檢驗次數(shù)）、crossvalI=10（十折交叉驗證）。十折交叉驗證的R2Y和Q2Y和置換檢驗對OPLS-DA模型進(jìn)行質(zhì)量評判。OPLS-DA分析的樣品診斷圖剔除組內(nèi)差異大的樣本。剔除差異樣本后的數(shù)據(jù)進(jìn)行OPLS-DA分析，通過OPLS-DA模型中變量的VIP值（VIP>1）、S-plot圖（Pcorr [1]>0.1，P[1]>0.05），篩選潛在標(biāo)記物。metabolomics包中的TwoGroup函數(shù)對標(biāo)記物進(jìn)行獨立樣本的t-檢驗，刪除在空白組和模型組沒有顯著性的標(biāo)記物（P<0.05）。pROC包中的ROC函數(shù)對標(biāo)記物進(jìn)行ROC曲線分析[11]，根據(jù)曲線下的面積大于0.7篩選具有診斷效果的標(biāo)記物[12]。endprint

篩選出來的標(biāo)記物的m/z輸入Masslynx軟件，計算出可能的加和離子和分子式，匹配HMDB，KEGG，MMCD，METLIN數(shù)據(jù)庫，找出誤差<10的代謝物和相關(guān)的MS/MS信息。對比二級信息確定最終的代謝物，這些代謝物即為脾氣虛證的標(biāo)記物。Pheatmap包的pheatmap函數(shù)對標(biāo)記物進(jìn)行熱圖和聚類分析，評估標(biāo)記物對模型的分離效果。

2 結(jié)果

2.1 脾氣虛模型的確定 脾氣虛模型的確定可通過動物體征、D-木糖吸收、血常規(guī)的白細(xì)胞數(shù)（WBC），淋巴細(xì)胞數(shù)（LYMPH），血紅蛋白含量（HGB）及體質(zhì)量變化等方面考察。在體征方面，模型組大鼠出現(xiàn)躬身、扎堆、溫順、便軟等現(xiàn)象；模型組大鼠游泳時間隨著造模時間降低；正常組無上述體征。血常規(guī)、D-木糖吸收及體質(zhì)量變化見表1。結(jié)果顯示，模型組與正常組相比，模型組大鼠體質(zhì)量顯著性降低（P<0.01）、D-木糖吸收顯著降低（P<0.01）、白細(xì)胞數(shù)和淋巴細(xì)胞數(shù)顯著下降（P<0.01），血紅蛋白含量顯著降低（P<0.05），與前期研究結(jié)果相符[8]。D-木糖吸收降低表明脾氣虛證大鼠存在脾胃功能異常；WBC和LYMPH的下降說明脾氣虛證大鼠免疫功能降低。以上結(jié)果表明脾氣虛模型可用于后續(xù)的實驗。

2.2 尿液代謝指紋圖譜分析 采用UPLC-Q-TOF- MS技術(shù)對大鼠尿液進(jìn)行分離與數(shù)據(jù)的采集。正、負(fù)離子模式下的基峰離子色譜圖（BPI），見圖1。同一樣本的BPI圖在正、負(fù)離子模式下互補(bǔ)，尿液中的代謝物得到很好的分離，保留時間在23 min內(nèi)。本方法適用于全面的，完整性的代謝組學(xué)分析，有利于獲取更多的代謝物信息。

2.3 分析方法考察與數(shù)據(jù)質(zhì)量評估 隨機(jī)挑選6個尿液樣本，按1.2項下的尿液處理方法平行處理樣品，UPLC-Q-TOF-MS分析，考察分析方法的重現(xiàn)性。QC數(shù)據(jù)挑選部分m/z，分別計算保留時間和峰面積的RSD，考察分析方法的穩(wěn)定性，見表2。在正、負(fù)離子模式下，穩(wěn)定性和重復(fù)性的保留時間RSD均小于2.0%，峰面積RSD均小于8.0%。表明采用的分析方法穩(wěn)定性和重復(fù)性良好，可用于后續(xù)的樣品分析。

正負(fù)離子模式下的液質(zhì)數(shù)據(jù)經(jīng)峰匹配、歸一化、中心化等處理分別得到2 435個變量和1 794個變量。OPLS-DA是一種有監(jiān)督的分析，組內(nèi)差異會降低模型的預(yù)測能力。對變量進(jìn)行OPLS-DA分析，基于OPLS-DA模型的樣品診斷圖，剔除組內(nèi)的差異樣本[13]。由正負(fù)離子模式下的樣品診斷圖可以看出K8至K11和M10，M11不在樣本的聚類范圍內(nèi)，故剔除。對空白組、模型組及QC數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA分析，通過QC數(shù)據(jù)在PCA得分圖中的分布考察數(shù)據(jù)的可靠性。得分圖顯示正負(fù)離子模式下的QC樣品分布集中，表明數(shù)據(jù)可靠；同時，正負(fù)離子模式下，空白組和模型組在第一主成分下能夠區(qū)分，表明模型可靠，見圖2。

2.4 脾氣虛證生物標(biāo)記物的確定 正負(fù)離子模式下的數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行OPLS-DA分析，并對OPLS-DA模型進(jìn)行十折交叉驗證及置換檢驗，避免模型的過度擬合，確保模型的可靠性[14]，見圖3。

OPLS-DA得分圖顯示正常組和模型組能顯著區(qū)分。通常R2Y用來估計所構(gòu)建模型與Y數(shù)據(jù)的匹配程度，Q2Y則用來評判所構(gòu)建模型的預(yù)測能力[15]。R2Y和Q2Y的值越接近1，模型預(yù)測能力越高。正、負(fù)離子OPLS-DA模型的相關(guān)參數(shù)也列于圖3。正、負(fù)離子下OPLS-DA模型的R2X均大于0.6，R2Y，Q2Y均大于0.8，結(jié)果表明模型具有較高的解釋能力和預(yù)測能力。正、負(fù)離子下經(jīng)1 000次置換檢驗獲得的R2Y與Q2的值接近真實模型的概率均低于0.001，其大部分小于真實模型計算值[16]。上述結(jié)果表明，在正、負(fù)離子模式下，樣本的多變量數(shù)據(jù)模型符合參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)，可應(yīng)用于候選生物標(biāo)志物的篩選。基于OPLS-DA模型的VIP大于1和S-plot圖（Pcorr[1]>0.1，P[1]>0.05）及獨立樣本t檢驗（P<0.05），一共篩選了34個潛在標(biāo)記物，其中正負(fù)離子模式下相同的標(biāo)記物有5個。標(biāo)記物經(jīng)ROC分析，24個標(biāo)記物在ROC曲線下的面積（AUC）大于0.7，這些標(biāo)記物即為脾氣虛證的標(biāo)記物。標(biāo)記物的鑒定主要通過二級碎片信息和數(shù)據(jù)庫 匹配。具體鑒定過程為：如m/z 206.045 2的母離子，根據(jù)數(shù)據(jù)庫匹配誤差<10的代謝物，推測可能為黃嘌呤酸，在同樣的色譜條件下對尿液中的m/z 206.045 2 進(jìn)行MS/MS分析，得到206.045 2的碎片信息為188.027 0，178.035 6，162.083 5，149.021 8。結(jié)合網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫，碎片離子188.027 0認(rèn)為是分子脫去1個H2O分子，178.035 6認(rèn)為是分子脫去CH2O，162.083 5認(rèn)為是分子脫去HCOOH，以上3 個碎片能夠匹配二級數(shù)據(jù)庫中的碎片信息。而碎片離子149.021 8可能是分子脫去CH3COOH分子和H2O分子后加入NH4+而得到的子離子，因為在二級網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫中m/z 206.045 2 存在132.043 9的碎片離子（[M+H]+），131.043 9和149.021 8相差的相對分子質(zhì)量為18，所以可能為131.043 9分子加和了NH4+。所有標(biāo)記物的二級信息見表3。

2.5 標(biāo)記物的熱圖與聚類分析 將24個標(biāo)記物的相對色譜峰強(qiáng)度數(shù)據(jù)導(dǎo)入R軟件，經(jīng)scale轉(zhuǎn)化利用pheatmap包進(jìn)行HCA聚類分析生成相應(yīng)的熱圖，見圖4。圖中顏色變化可以清晰地看到，24個代謝物中吲哚、膽堿、高絲氨酸、苯丙氨酸、吲哚乳酸、琥珀酸、甜菜堿等11個標(biāo)記物在模型組中顯著的升高，肌酸、肌酸酐、犬尿酸、黃嘌呤、黃嘌呤酸、乳清酸、血清素、檸檬酸等13個標(biāo)記物顯著的降低；樣品的聚類結(jié)果表明空白樣品和模型樣品聚類明顯，說明這24個標(biāo)記物能夠?qū)⒛Ｐ徒M和正常組區(qū)分。

2.6 脾氣虛證生物標(biāo)記物的生物學(xué)意義 24個脾氣虛證潛在標(biāo)記物涉及的代謝通路主要為能量代謝、氨基酸代謝、嘌呤代謝及嘧啶代謝。參考KEGG數(shù)據(jù)庫的代謝通路圖，利用Cytoscape軟件制作脾氣虛證代謝標(biāo)記物的代謝通路圖，見圖5。結(jié)果表明，色氨酸代謝是脾氣虛大鼠改變最為顯著的代謝通路，多達(dá)9個代謝物與此通路相關(guān)。由此可知，脾氣虛證出現(xiàn)各種癥狀與色胺酸代謝紊亂有很大的聯(lián)系。脾氣虛證大鼠通常會有食欲降低和扎堆的癥狀并且食量下降，推測是受色氨酸代謝的影響。實驗結(jié)果還表明吲哚、吲哚乳酸、3-甲基羥吲哚在脾氣虛模型組中的含量顯著的升高，而這些標(biāo)記物均是色氨酸的代謝產(chǎn)物。其中犬尿酸、黃嘌呤酸、血清素等含量顯著的降低，其原因可能是色氨酸的犬尿酸代謝途徑和5-羥色胺代謝途徑被抑制。有研究表明，色氨酸的犬尿酸代謝途徑和5-羥色胺代謝途徑受免疫反應(yīng)的影響，免疫功能的降低會影響吲哚2，3-雙加氧酶（IDO）的活性，從而抑制其代謝途徑[17]。而色氨酸在色氨酸酶的作用下能夠代謝為吲哚等相endprint

關(guān)代謝物[18]。有研究顯示，脾氣虛證大鼠因腸道菌群失調(diào)，腸黏膜通透性增加導(dǎo)致免疫能力降低[19]。因此，脾氣虛證大鼠尿液中的犬尿酸、黃嘌呤酸、血清素、吲哚乳酸、吲哚等含量的異常提示色氨酸代謝紊亂參與了脾氣虛證的病理進(jìn)程。

烏頭酸、檸檬酸、琥珀酸是三羧酸循環(huán)中重要的中間產(chǎn)物，而三羧酸循環(huán)是糖酵解的主要通路，并且也是機(jī)體重要的能量供應(yīng)渠道。在本研究中，烏頭酸，琥珀酸在脾氣虛模型組中的含量顯著升高，檸檬酸在脾氣虛模型組中含量顯著降低。這可能與三羧酸循環(huán)中的相關(guān)酶的活性降低有關(guān)或者細(xì)胞線粒體功能的失常所致。有研究表明脾氣虛證大鼠中的琥珀酸脫氫酶的活性降低，抑制機(jī)體的三羧酸循環(huán)，導(dǎo)致琥珀酸在體內(nèi)的積累[20]。研究發(fā)現(xiàn)脾氣虛患者胃粘膜壁細(xì)胞單位面積內(nèi)線粒體均數(shù)明顯減少，并出現(xiàn)腫脹、嵴斷裂、膜缺損等癥狀[21]。表明脾氣虛證顯著抑制了三羧酸循環(huán)從而降低了機(jī)體的能量供應(yīng)，導(dǎo)致機(jī)體氣血生化不足，從而出現(xiàn)精神疲憊、乏力，扎堆等癥狀。

在甘氨酸和絲氨酸的代謝通路中膽堿、甜菜堿在模型中顯著的升高，肌酸和肌酸酐的含量下降。這可能與線粒體功能異常及肌球蛋白表達(dá)下降有關(guān)。膽堿和甜菜將是機(jī)體合成甘氨酸的原料，其代 謝主要是在肝和腎的線粒體內(nèi)進(jìn)行，僅有4%被吸收的甜菜堿經(jīng)腎臟排出，脾氣虛大鼠尿中甜菜堿的含量升高，說明體內(nèi)甘氨酸的合成受阻。在大量的運(yùn)動情況下，肌酸分解形成肌酸酐，為機(jī)體提供能量。周昕欣等[22]在補(bǔ)中益氣湯治療脾氣虛證大鼠肌無力的機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)脾氣虛組大鼠磷酸化肌球蛋白輕鏈的表達(dá)顯著下降，導(dǎo)致肌肉收縮能力下降，出現(xiàn)大鼠肌無力。本研究發(fā)現(xiàn)脾氣虛證游泳時間下降，由此說明絲氨酸和甘氨酸相關(guān)代謝物可以作為脾氣虛證的標(biāo)記物。本研究還發(fā)現(xiàn)，苯丙氨酸含量異常說明脾氣虛證顯著的影響了苯丙氨酸代謝。在脾氣虛模型中，當(dāng)苯丙氨酸代謝部分被阻斷后，苯丙氨酸含量在尿中排出量可能會增加。相關(guān)文獻(xiàn)報導(dǎo)了脾氣虛證血清也有苯丙氨酸代謝物[23]。由此推測脾氣虛證可能涉及苯丙氨酸代謝途徑的異常。本實驗還篩選出了其他代謝通路（如?；撬岽x，嘌呤代謝、嘧啶代謝），這3個代謝通路是本次研究首次提及的，與脾氣虛證的關(guān)系仍需進(jìn)一步的探究。

3 討論

本實驗共篩選鑒定出苯丙氨酸、琥珀酸、烏頭酸、檸檬酸、甜菜堿、犬尿酸、吲哚、肌酸、肌酸酐、乳清酸、黃嘌呤、黃嘌呤酸、膽堿等24個脾氣虛證大鼠生物標(biāo)記物；涉及的相關(guān)代謝通路主要為能量代謝，氨基酸代謝，嘌呤代謝和嘧啶代謝等。尿液代謝組學(xué)研究方法結(jié)合在線軟件包數(shù)據(jù)處理解析代謝通路，可以為脾氣虛證及其他中醫(yī)證候的研究提供新的方法和思路。

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[責(zé)任編輯 張燕]endprint