木霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基響應(yīng)面優(yōu)化

丁志雯+胡永紅+楊文革

摘要：為了優(yōu)化木霉菌YHWG5102發(fā)酵培養(yǎng)基，以對(duì)水稻紋枯病的抑菌圈直徑大小為優(yōu)化的指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行Plackett-Burman試驗(yàn)和中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用響應(yīng)面法建立發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化模型。結(jié)果表明，得到最優(yōu)培養(yǎng)基配方：23.44 g/L葡萄糖、26.07 g/L玉米漿、0.81 g/L K2HPO4。經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，在此培養(yǎng)基條件下，木霉菌YHWG5102抑菌圈直徑達(dá)27.19 mm，比優(yōu)化前提高約42%。

關(guān)鍵詞：木霉菌；發(fā)酵培養(yǎng)基；最優(yōu)培養(yǎng)基配方；水稻紋枯??；響應(yīng)面法

中圖分類號(hào)： S188+.4文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2017）23-0275-04

1材料與方法

1.1菌種

木霉菌YHWG5102、水稻紋枯病病菌，均由筆者所在課題組保藏。

1.2培養(yǎng)基

活化培養(yǎng)基：200 g/L馬鈴薯，20 g/L蔗糖，15～20 g/L瓊脂，pH值自然。

種子培養(yǎng)基：20 g/L蔗糖，11.16 g/L酵母浸粉，0.5 g/L K2HPO4，1 g/L MgSO4，pH值6.5。

發(fā)酵培養(yǎng)基：20 g/L蔗糖，11.16 g/L酵母浸粉，0.5 g/L K2HPO4，1 g/L MgSO4，pH值6.5。

1.3主要試劑與儀器

瓊脂粉、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、肌醇、蛋白胨、酵母浸粉、尿素，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；（NH4）2SO4、NaCl、CaCl2、FeSO4、MgSO4、K2HPO4，購(gòu)自廣東省汕頭市西隴化工廠；工業(yè)用玉米漿與馬鈴薯，市售。

電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；滅菌鍋，廣州市華粵行儀器有限公司；醫(yī)用凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；鼓風(fēng)電熱恒溫干燥箱，上海試驗(yàn)儀器廠有限公司；真空抽濾機(jī)，河南省予華儀器有限公司；電子天平，瑞士梅特勒-托利多儀器（中國(guó)）有限公司；基礎(chǔ)分析型純水機(jī)，青島富勒姆科技有限公司。

1.4試驗(yàn)方法

1.4.1菌種培養(yǎng)（1）平板活化：從甘油管中將菌種接到活化培養(yǎng)基上，26 ℃恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)6～7 d；（2）種子液培養(yǎng)：在500 mL錐形瓶中裝100 mL種子培養(yǎng)基，從平板上挑取菌落接種于搖瓶中，培養(yǎng)溫度26 ℃，搖床轉(zhuǎn)速120 r/min，培養(yǎng)3 d后進(jìn)行接種發(fā)酵；（3）搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)：在500 mL錐形瓶中裝100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，向培養(yǎng)基中接種2 mL種子液，培養(yǎng)溫度26 ℃，搖床轉(zhuǎn)速120 r/min。

1.4.2木霉菌抑菌圈直徑的測(cè)定采用牛津杯法進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，將發(fā)酵液經(jīng)抽濾、微濾（0.45 μm）后取濾液，對(duì)水稻紋枯病進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，根據(jù)抑菌圈直徑確定抑菌能力。

1.4.3單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)分別對(duì)不同種類的碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽進(jìn)行優(yōu)化，配制發(fā)酵培養(yǎng)基，26 ℃發(fā)酵培養(yǎng)4.5 d，測(cè)定每種因素對(duì)抑菌圈直徑的影響，選擇最佳培養(yǎng)基成分。

1.4.4響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)（1）Plackett-Burman（PB）設(shè)計(jì)試驗(yàn)：利用Plackett-Burman試驗(yàn)從多個(gè)單因素中篩選出對(duì)抑菌直徑影響最顯著的幾個(gè)因素，使用Design Expert軟件設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案，包括11個(gè)變量（n=11），其中9個(gè)為主要變量（葡萄糖含量、麥芽糖含量、蔗糖含量、蛋白胨含量、玉米漿含量、酵母浸粉含量、K2HPO4含量、MgSO4含量、FeSO4含量），2個(gè)為虛擬變量，分別用A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K代表以上變量，每個(gè)變量有高（+）、低（-）2個(gè)水平（表1）。

（2）最陡爬坡試驗(yàn)：最陡爬坡試驗(yàn)在PB試驗(yàn)中得到影響較為顯著的3類因素，并且根據(jù)PB設(shè)計(jì)得出的一次項(xiàng)擬合方程中相應(yīng)變量的系數(shù)，從而確定變化梯度、爬坡方向。若變量系數(shù)為負(fù)，則該變量水平以梯度遞減的方向進(jìn)行爬坡試驗(yàn)。

（3）響應(yīng)面法分析：經(jīng)過(guò)最陡爬坡試驗(yàn)，逼近抑菌圈直徑最大化區(qū)域，根據(jù)Box-Bellnken原理，對(duì)經(jīng)過(guò)PB和爬坡試驗(yàn)的變量進(jìn)行5水平試驗(yàn)（-1.68、-1、0、+1、-1.68），共20組試驗(yàn)，使用Design-Expert軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，研究木霉菌YHWG5102次級(jí)代謝產(chǎn)物中抑菌物質(zhì)量含量最高的發(fā)酵培養(yǎng)基配方。

2結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1不同種類的碳源對(duì)抑菌圈大小的影響碳源是構(gòu)成菌體的基本骨架，是菌體生長(zhǎng)的能量來(lái)源，通過(guò)影響菌體的呼吸、能量供給、生長(zhǎng)及相關(guān)代謝最終影響抗生素等次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量[7]。由圖1可知，在選擇的5種碳源中，葡萄糖、蔗糖和麥芽糖對(duì)木霉菌抑菌效果的影響較為明顯，其中葡萄糖效果最好。因此，在下個(gè)階段的PB設(shè)計(jì)中，將葡萄糖、蔗糖及麥芽糖作為考察因素。

2.1.2不同種類的氮源對(duì)抑菌圈大小的影響氮源在合成菌體各種初級(jí)、次級(jí)代謝產(chǎn)物等含氮物質(zhì)的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，同時(shí)在發(fā)酵生產(chǎn)中氮源起著調(diào)節(jié)菌體的生長(zhǎng)及生物量的作用[8]。以上一步試驗(yàn)得出的最優(yōu)碳源葡萄糖作為本步試驗(yàn)的初始碳源。由圖2可知，木霉菌不僅可以利用有機(jī)氮源，也可利用無(wú)機(jī)氮源，玉米漿、蛋白胨和（NH4）2SO4對(duì)抑菌圈直徑影響較大，其中玉米漿效果最佳。

2.1.3不同種類的無(wú)機(jī)鹽對(duì)抑菌圈大小的影響無(wú)機(jī)鹽是微生物生命活動(dòng)中必不可少的一類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，它們?cè)跈C(jī)體中的生理功能主要是作為酶的活性中心的組成部分、維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性等。以上述試驗(yàn)得出的最優(yōu)碳源葡萄糖及最優(yōu)氮源玉米漿作為本步試驗(yàn)的初始碳源與氮源。由圖3可知，K2HPO4對(duì)抑菌圈直徑影響最為明顯，這可能由于鉀是合成次級(jí)代謝產(chǎn)物中具有抑菌活性物質(zhì)的關(guān)鍵元素，MgSO4、FeSO4的抑菌圈直徑次之。

2.2響應(yīng)面設(shè)計(jì)

2.2.1Plackett-Burman設(shè)計(jì)試驗(yàn)通過(guò)單因素試驗(yàn)表明，在木霉菌抑菌試驗(yàn)中，對(duì)其影響較大的9個(gè)變量為葡萄糖含量、蔗糖含量、麥芽糖含量、玉米漿含量、蛋白胨含量、（NH4）2SO4含量、K2HPO4含量、MgSO4含量和FeSO4含量，再加上2個(gè)虛擬變量，每個(gè)變量有高（+）、低（-）2個(gè)水平，采用Design-Expert軟件設(shè)計(jì)試驗(yàn)，共計(jì)12組試驗(yàn)（表2）。使用Design-Expert對(duì)表2進(jìn)行分析，得到Plackett-Burman設(shè)計(jì)方差分析結(jié)果。由表3可知，上述9個(gè)因素對(duì)抑菌圈大小的影響程度排序?yàn)槠咸烟呛?蔗糖含量>麥芽糖含量>玉米漿含量>K2HPO4含量>MgSO4含量>FeSO4含量>蛋白胨含量>酵母浸粉含量，其中葡萄糖含量為顯著因素。該模型R2=0.999 7，表示99.97%的試驗(yàn)數(shù)據(jù)可用該模型來(lái)解釋；從9個(gè)因素中選出對(duì)抑菌圈直徑影響顯著（P<0.05）的3類因素（葡萄糖含量、玉米漿含量、K2HPO4含量）進(jìn)行下一步優(yōu)化。endprint

2.2.2最陡爬坡試驗(yàn)根據(jù)PB試驗(yàn)結(jié)果，葡萄糖含量、玉米漿含量、K2HPO4含量的模型方程系數(shù)為正值，進(jìn)行正爬坡。由表4可知，第4組試驗(yàn)方案對(duì)應(yīng)的抑菌圈直徑達(dá)到最大值，以此值為中心進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，這樣響應(yīng)面方程才能充分逼近真實(shí)值。

2.2.3響應(yīng)面法分析經(jīng)過(guò)Plackett-Burman試驗(yàn)和爬坡試驗(yàn)，確定葡萄糖含量、玉米漿含量、K2HPO4含量的水平（表5），利用Design-Expert軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，結(jié)果見表6。

3結(jié)論與展望

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，經(jīng)Plackett-Burman試驗(yàn)確定了葡萄糖、玉米漿和K2HPO4為主要影響因素，在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)，確定最佳響應(yīng)面區(qū)域，然后采用中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)和Design Expert軟件分析計(jì)算，得到這3種因素的最佳添加量：23.44 g/L葡萄糖、26.07 g/L玉米漿、0.81 g/L K2HPO4。在此發(fā)酵培養(yǎng)基下重復(fù)進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果表明，木霉菌YHWG5102對(duì)水稻紋枯病的抑菌圈直徑實(shí)測(cè)平均值為27.19 mm，與未優(yōu)化的培養(yǎng)基初始抑菌圈直徑（約為19.1 mm）相比增加約42%。

然而此研究?jī)H限于搖瓶發(fā)酵， 很多因素（如溶氧、通氣量表7回歸方程方差分析結(jié)果

等）難以有效控制，下一步可以上罐分批發(fā)酵，進(jìn)一步優(yōu)化木霉菌的培養(yǎng)條件，盡可能提高木霉菌次級(jí)代謝產(chǎn)物中具有抑菌作用的物質(zhì)含量，然后通過(guò)硫酸銨分級(jí)沉淀、凝膠過(guò)濾層析以及十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）初步確定具有抑菌作用的物質(zhì)[9-10]，以期得到更穩(wěn)定、高效的新型木霉菌制劑。

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