枯草芽孢桿菌和綠色木霉對(duì)落葉及草坪碎屑腐解的影響

王楠+劉鑌嫻+徐偉宸+高立支+李松松+崔悅+王帥

摘要：落葉及草坪碎屑是園林生態(tài)系統(tǒng)中最常見的有機(jī)固體廢棄物，通過腐解可轉(zhuǎn)化成優(yōu)質(zhì)有機(jī)物料供園林綠化使用?？莶菅挎邨U菌（Bacillus subtilis）、綠色木霉（Trichoderma viride）是堆肥腐解常用的有益菌群，在促進(jìn)腐殖化進(jìn)程方面有著不同的效果。采用室內(nèi)培養(yǎng)法，通過接種2類菌株懸液，揭示其在60 d培養(yǎng)期間對(duì)落葉及草坪碎屑混料腐解的動(dòng)態(tài)差異。結(jié)果表明：綠色木霉在礦化混料總有機(jī)碳方面的能力要強(qiáng)于枯草芽孢桿菌；混料經(jīng)綠色木霉腐解后，其P2O5含量可獲得較大程度提升，相反，枯草芽孢桿菌對(duì)于混料N及K2O含量的促進(jìn)作用更為明顯；綠色木霉對(duì)于混料可提取腐殖酸碳含量（CHE）的利用程度較差，但對(duì)胡敏素碳含量（CHu）的礦化能力更強(qiáng)；2類微生物皆有利于混料腐殖質(zhì)品質(zhì)的提升，其中枯草芽孢桿菌的作用更為明顯。本研究結(jié)果可為闡明落葉及草坪碎屑的腐解特征及篩選高效微生物菌群提供技術(shù)參考。

關(guān)鍵詞：落葉；草坪碎屑；腐解；枯草芽孢桿菌；綠色木霉

中圖分類號(hào)： S182文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2017）23-0258-04

畢延剛等指出，在堆肥進(jìn)程接種枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）可使堆料對(duì)枯萎病病原菌產(chǎn)生抑制作用[4]，此外，（Bacillus subtilis）也可加速物料的腐解進(jìn)程，且對(duì)其中的生物毒性物質(zhì)有降解作用[5]。李瑜等研究表明，由綠色木霉（Trichoderma viride）產(chǎn)生的纖維素酶活性較高，當(dāng)其與枯草芽孢桿菌組成復(fù)合菌劑時(shí)，通過兩者間比例的調(diào)整可有效縮短堆肥周期[6]。有學(xué)者利用微生物預(yù)處理手段，基于菌劑與混料基質(zhì)間的不同比例（1 ∶19、1 ∶9、1 ∶4），將蟲擬蠟菌（Ceriporiopsis subvermispora）接種于園林混料基質(zhì)中，并在 30 d 培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)探討混料木質(zhì)素、纖維素、半纖維素及干物質(zhì)的降解程度，并指出在此過程有甲烷氣體產(chǎn)生[7-8]。Awasthi等研究了由黃孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）、綠色木霉（T. viride）、綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa）所組成的混合菌劑在園林、農(nóng)業(yè)及城市固體廢棄物與木屑所組成混合物料中的堆肥效果，結(jié)果表明，在堆肥過程中，物料淀粉酶、纖維素酶、蛋白酶及脫氫酶等活性均有所提升，且堆肥過程可縮減至4周以內(nèi)[9]?？梢?，配伍適宜的混合微生物菌劑對(duì)堆肥品質(zhì)的提升有所幫助。

Bacillus subtilis和Trichoderma viride對(duì)于堆肥過程具有較好的促進(jìn)作用且功能不同。當(dāng)前研究中，腐解物料多以農(nóng)業(yè)廢棄物及城市污泥為主，對(duì)于落葉及草坪碎屑等園林廢棄物的堆腐研究尚缺乏系統(tǒng)性報(bào)道，而對(duì)于微生物菌劑的研究多集中于復(fù)合菌。本研究擬采用室內(nèi)培養(yǎng)法，將落葉與草坪碎屑按照2 ∶8的質(zhì)量比混合，通過Bacillus subtilis和Trichoderma viride接種，對(duì)其總有機(jī)碳、養(yǎng)分性狀及腐殖質(zhì)組成進(jìn)行動(dòng)態(tài)分析，并揭示2類微生物在園林廢棄物腐解特征上的差異，旨在為園林固體廢棄物的資源化利用及高效菌劑的篩選提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

落葉于2015年10月取自吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院校內(nèi)園林綠地，所屬區(qū)域以栽植銀中楊、垂柳及玉簪等地被植物為主。將收集好的袋裝落葉帶回實(shí)驗(yàn)室，剔除多余枯枝、保留落葉，105 ℃ 下作殺青處理，再在55 ℃下烘干至恒質(zhì)量，粉碎過 1 mm 篩。經(jīng)測定，落葉粉末中的總有機(jī)碳（TOC）、全氮（N）、全磷（P2O5）及全鉀（K2O）含量分別為58.3%、2.24%、1.00%、0.77%。

草坪碎屑于2015年9月取自吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院A座教學(xué)樓前草坪綠地，草種由狗牙根、早熟禾屬及羊茅屬組成。將經(jīng)旋刀式剪草機(jī)剔除的碎草屑帶回實(shí)驗(yàn)室，重復(fù)上述步驟，但不作粉碎處理，僅用剪刀將碎草屑繼續(xù)剪碎至0.20～0.25 cm 小段，隨后將其保存于玻璃干燥器中。經(jīng)測定，草坪碎屑中TOC、N、P2O5、K2O含量分別為58.4%、2.68%、120%、2.09%。

綠色木霉（Trichoderma viride，Tv），水谷欣品牌，江蘇省鹽城市神微生物菌種科技有限公司，原粉粉劑，50億活孢子/g；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis，Bs），水谷欣品牌，江蘇省鹽城市神微生物菌種科技有限公司，粉劑，300億/g。菌株懸液的制備方法：稱取菌粉5.0 g置于100 mL離心管中，注入 100 mL 無菌水后以3 500 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，將固液分離，收集菌株懸液，無菌條件下保存，以防染雜菌。

1.2方法

將落葉粉末按照2 ∶8的質(zhì)量比與草坪碎屑進(jìn)行混合，稱取20 g混料于100 mL錐形瓶中，隨后用（NH4）2SO4溶液調(diào)節(jié)瓶裝混料，使其C/N比為22.5 ∶1、含水量為50%，蓋好自制防菌棉塞，高壓蒸汽滅菌（121 ℃，20 min）、自然冷卻后，分別接種5 mL綠色木霉或5 mL枯草芽孢桿菌懸液，隨后用塑料薄膜封口，28 ℃條件下恒濕培養(yǎng)60 d，其間分別于0、15、30、60 d取樣，每個(gè)處理重復(fù)3次。

采用H2SO4-H2O2消化、凱氏蒸餾法測定混料N含量，采用H2SO4-H2O2消化、釩鉬黃比色法測定P2O5含量，采用H2SO4-H2O2消化、火焰光度法測定K2O含量，采用重鉻酸鉀氧化法測定TOC含量，具體過程參照NY 525—2012《有機(jī)肥料》農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。

采用腐殖質(zhì)組成修改法對(duì)腐殖質(zhì)各組分進(jìn)行分離、測定。首先用70 ℃蒸餾水浸提混料中的水溶性有機(jī)碳（WSOC），隨后用0.1 mol/L NaOH和0.1 mol/L Na4P2O7的混合堿溶液浸提可提取腐殖酸（HE），再用0.5 mol/L H2SO4從中分離胡敏酸（HA）和富里酸（FA），兩者碳含量比值即為腐殖化系數(shù)。將提取HE后的沉淀物質(zhì)用蒸餾水多次洗滌，直至洗出液近中性為止，將沉淀置于55 ℃鼓風(fēng)干燥48 h，該殘?jiān)镔|(zhì)即為胡敏素（Hu）。HE、HA、FA、Hu組分的碳含量分別用CHE、CHA、CFA、CHu表示，均用重鉻酸鉀氧化法測定。endprint

采用T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)（北京譜析通用有限公司）對(duì)HA堿溶液的吸光度（D400 nm、D465 nm、D600 nm、D665 nm）進(jìn)行測定，并由此計(jì)算出光密度值（E4/E6）和色調(diào)系數(shù)（ΔlgK），具體計(jì)算方法如下：

E4/E6=D465 nm/D665 nm；（1）

ΔlgK=lgD400 nm-lgD600 nm。（2）

1.3數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2003及SPSS 18.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異性分析。

2結(jié)果與分析

2.1綠色木霉和枯草芽孢桿菌對(duì)混料總有機(jī)碳含量的動(dòng)態(tài)影響

由圖1可見，綠色木霉（Tv）和枯草芽孢桿菌（Bs）接種后，前者使混料初始總有機(jī)碳（TOC）含量大于后者。培養(yǎng)期間，受Tv、Bs影響，混料TOC含量均呈先增加后下降的規(guī)律，培養(yǎng)結(jié)束后，TOC含量皆有所損失，Tv處理下的降低幅度更為明顯，達(dá)到8.6%。上述規(guī)律表明，與枯草芽孢桿菌相比，綠色木霉菌株懸液中含有更多的有機(jī)碳成分，歷經(jīng)15 d培養(yǎng)，物料失重幅度大于TOC的礦化程度，因此，物料中TOC含量反而呈上升趨勢(shì)，表現(xiàn)為濃縮效應(yīng)，隨著培養(yǎng)進(jìn)行，有機(jī)碳礦化程度加劇直至培養(yǎng)結(jié)束，綠色木霉對(duì)于物料TOC的礦化程度要大于枯草芽孢桿菌。

2.2綠色木霉和枯草芽孢桿菌對(duì)混料全量養(yǎng)分的動(dòng)態(tài)影響

由表1可見，接種Tv和Bs可對(duì)堆腐過程混料的全量養(yǎng)分產(chǎn)生較為顯著的動(dòng)態(tài)影響。Tv菌株懸液中含有比Bs更多的N和K2O，反之，Bs菌株懸液則含有更多的P2O5。隨著培養(yǎng)的進(jìn)行，混料N、P2O5、K2O含量均呈增加趨勢(shì)。經(jīng)過 60 d 培養(yǎng)，Tv和Bs處理下混料N含量的增幅分別為10.6%、32.0%，P2O5含量增幅為101.6%、15.1%，K2O含量增幅為39.6%、72.8%。由此可見，混料在培養(yǎng)過程中質(zhì)量的缺失，即減重效應(yīng)，會(huì)變相增加全量養(yǎng)分的含量，Tv菌株懸液中含有更多的N和K2O，而P2O5含量稍遜于Bs。培養(yǎng)結(jié)束后，綠色木霉對(duì)于混料P2O5含量的增加幅度較大，而后者歸屬細(xì)菌在培養(yǎng)過程中繁殖速率較快[10]，因此更有益于混料N和K2O的含量增加。

2.3綠色木霉和枯草芽孢桿菌對(duì)混料腐殖質(zhì)組成的動(dòng)態(tài)影響

如圖2-A所示，盡管Tv和Bs的培養(yǎng)對(duì)于混料WSOC含量有所促進(jìn)，但影響規(guī)律不同，具體來看，培養(yǎng)15 d期間，Tv對(duì)于混料WSOC組分的利用程度較高，使其含量有所降低，而后隨Tv對(duì)腐殖質(zhì)其他組分降解以及物料失重的影響，WSOC含量再度提高，增幅達(dá)42.3%。在添加Bs條件下，盡管Bs必然會(huì)對(duì)WSOC組分加以利用，但對(duì)于物料失重的影響更為顯著，間接使得WSOC含量增加，歷經(jīng)60 d培養(yǎng)，最終該組分碳含量增加幅度達(dá)41.3%。由圖2-B可知，無論接種Tv還是Bs，混料CHE均呈先增加后降低的變化規(guī)律，培養(yǎng)結(jié)束后，CHE均遭致?lián)p失，在Tv和Bs處理下，CHE的降低幅度分別達(dá)到8.6%和15.7%，可推斷，微生物首先利用WSOC組分并展開對(duì)腐殖質(zhì)組分的降解，加之混料失重，兩過程均促使CHE增加，而后隨著培養(yǎng)進(jìn)行，部分CHE組分亦可被微生物降解，使其碳含量有所下降，在此過程，枯草芽孢桿菌的作用更為明顯。圖2-C描述了混料CHA變化，在此之前，筆者已經(jīng)明確CHE（CHA+CFA）在培養(yǎng)結(jié)束后會(huì)有所下降的規(guī)律，而其中的CHA卻被提升，可見，接種Tv和Bs均對(duì)落葉及草坪碎屑混料CHA的形成有促進(jìn)作用。

培養(yǎng)條件下歷經(jīng)不同變化規(guī)律：Tv處理下該組分碳含量漸趨降低，Bs處理下該組分碳含量先增后減。培養(yǎng)結(jié)束后，混料CHu均遭受損失，可見，綠色木霉對(duì)于落葉及草坪碎屑混料中惰性腐殖質(zhì)組分的降解能力要優(yōu)于枯草芽孢桿菌。

2.4綠色木霉和枯草芽孢桿菌對(duì)混料腐殖化系數(shù)（CHA/CFA）的影響

如圖3所示，無論接種Tv還是Bs，60 d培養(yǎng)結(jié)束后，混料CHA/CFA均有不同程度增加，從增加幅度來看，Bs處理有著更大優(yōu)勢(shì)，CHA/CFA增幅達(dá)到67.4%，而在Tv處理下的增幅僅為25.9%。上述規(guī)律表明，：綠色木霉和枯草芽孢桿菌在培養(yǎng) 60 d 內(nèi)均可提高混料腐殖化系數(shù)，使得落葉及草坪碎屑混料富里酸向胡敏酸轉(zhuǎn)化，盡管腐殖質(zhì)活性有所減弱，但在此過程中腐殖質(zhì)品質(zhì)可獲得提升，其中枯草芽孢桿菌的優(yōu)勢(shì)更為明顯。

2.5綠色木霉和枯草芽孢桿菌對(duì)混料胡敏酸堿溶液光學(xué)性質(zhì)（E4/E6、ΔlgK）的影響

由圖4-A可知，接種Tv處理下，混料HA堿溶液的 E4/E6 經(jīng)歷了先增后減的變化，與其相反，接種Bs后，E4/E6先減后增，總體看來，2個(gè)處理均可促使E4/E6增加，相較而言，Tv對(duì)其促進(jìn)作用更為明顯，增幅達(dá)20.9%。由圖4-B可知，在Bs處理下ΔlgK的變化規(guī)律與E4/E6相同，而Tv處理下的ΔlgK則歷經(jīng)漸趨增高的趨勢(shì)，培養(yǎng)結(jié)束后， 2個(gè)處理下

ΔlgK值均有所增加。

一般來講，HA堿溶液的E4/E6和ΔlgK越高，表明其數(shù)均分子量越小，分子結(jié)構(gòu)越簡單，反之，則其腐殖質(zhì)分子量越高，縮合度和芳構(gòu)化程度愈高[11]。依據(jù)該原理可作推斷，Tv和Bs均有助于混料HA分子的簡單化，其中Tv的優(yōu)勢(shì)更為明顯。

3結(jié)論與討論

綠色木霉為半知菌類，產(chǎn)孢量大、環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，其在生長過程不斷向胞外分泌蛋白酶類物質(zhì)，該酶活性的強(qiáng)弱反映了菌絲體生長過程中對(duì)外界復(fù)雜有機(jī)物的分解能力[12]，此外還能產(chǎn)生3種纖維素酶且均為胞外酶， 對(duì)纖維素的降解能力

更強(qiáng)[13]。因此，在本試驗(yàn)條件下，綠色木霉在充分供應(yīng)氮素情況下，在礦化混料TOC方面的能力要比枯草芽孢桿菌更有優(yōu)勢(shì)。接種綠色木霉后混料的TOC含量大于同條件下接種枯草芽孢桿菌的處理結(jié)果，這表明前者菌株懸液中含有更多的微生物量碳，使得起始TOC含量略大。接種2類菌株懸液后，混料TOC含量的變化趨勢(shì)相似，均表現(xiàn)為先升高后降低的規(guī)律，最終TOC含量均有不同程度損失，這與徐慶賢等的研究結(jié)論[14]有相似之處。經(jīng)過2類菌株的培養(yǎng)，15 d后混料失重程度大于TOC的礦化程度，因濃縮效應(yīng)的產(chǎn)生使TOC含量有所增高。隨著培養(yǎng)時(shí)間延長，TOC礦化程度加劇，比照培養(yǎng)前后混料TOC的差異可知，綠色木霉對(duì)混料的礦化、分解能力要大于枯草芽孢桿菌。endprint

混料經(jīng)綠色木霉腐解后，其P2O5含量有所增加，而枯草芽孢桿菌對(duì)混料N及K2O含量的促進(jìn)作用更為明顯。接種后，菌株在新培養(yǎng)環(huán)境下消耗營養(yǎng)物質(zhì)來完成生命活動(dòng)，致使物料失重，當(dāng)失重速率超過養(yǎng)分降低速率時(shí)會(huì)出現(xiàn)營養(yǎng)物質(zhì)濃縮的現(xiàn)象，最終使其含量增加[7-8]。綠色木霉懸液中含有更多N和K2O，對(duì)P2O5的利用程度相對(duì)較弱，因此，失重后更有利于P2O5含量的增加，同理，枯草芽孢桿菌含有更多P2O5，在繁殖過程對(duì)N和K2O的利用程度較弱，最終使物料中2種養(yǎng)分得以濃縮[15]。

綠色木霉對(duì)于混料CHE的利用程度較差，僅為 8.6%，但其對(duì)CHu的降解能力更強(qiáng)。在2類菌株培養(yǎng)條件下，混料CHE先略有增加而后大幅度降低，相比之下，枯草芽孢桿菌對(duì)于堆料CHE的利用程度更強(qiáng)，但對(duì)于CHu的降解效果并不明顯，這與朱偉寧等研究結(jié)論[16]相似。

胡敏酸和富里酸是腐殖酸的兩大核心組分，兩者皆為生物學(xué)穩(wěn)定性物質(zhì)[17]，兩者之比即腐殖化系數(shù)，在很大程度上決定了腐殖質(zhì)的品質(zhì)[18]。經(jīng)過60 d培養(yǎng)，混料胡敏酸有向富里酸縮合的趨勢(shì)，在此過程中，枯草芽孢桿菌接種培養(yǎng)下CHA/CFA增加了67.4%，而綠色木霉培養(yǎng)下的CHA/CFA增加幅度僅為25.9%?？梢?，2類菌株皆有助于落葉及草坪碎屑混料腐殖質(zhì)品質(zhì)的改善，其中枯草芽孢桿菌的作用效果更佳。

從HA堿溶液E4/E6和ΔlgK的變化趨勢(shì)可知，2類菌株均有助于混料HA分子的簡單化，通過對(duì)HA組分實(shí)施降解而使其芳構(gòu)化程度減弱、脂族碳含量增加，在此過程中，綠色木霉的優(yōu)勢(shì)更大，這與趙愷凝等的報(bào)道結(jié)果[15]一致。受到枯草芽孢桿菌影響，混料HA分子結(jié)構(gòu)先復(fù)雜而后漸變簡單，在此過程中，混料WSOC含量、CHE、CHA、CHu均有所增加，綜合考慮是因?yàn)槲锪鲜е?、水浮物（用水浸提WSOC組分時(shí)被濾紙阻隔在外的、尚未完全降解的植株殘?bào)w）降解導(dǎo)致HA分子復(fù)雜化，而后隨WSOC縮合以及HA降解，最終使該分子結(jié)構(gòu)向簡單化方向發(fā)展。而在綠色木霉影響下，混料WSOC組分可發(fā)生部分縮合[19]，加之對(duì)HA的礦化，盡管對(duì)Hu組分也有所降解，但所得有機(jī)分子片段并沒有扭轉(zhuǎn)HA分子向簡單化方向發(fā)展的趨勢(shì)。

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