馬尾藻多糖對PCV—2體外感染3D4/2細(xì)胞活性及炎癥相關(guān)因子的影響

譚紅連+楊劍+尹丹+郝祝兵+韋英益+胡庭俊

摘要：首先通過MTT法檢測馬尾藻多糖對3D4/2細(xì)胞活性的影響，然后用ELISA法檢測炎癥相關(guān)因子。試驗(yàn)結(jié)果，PCV-2感染3D4/2細(xì)胞后明顯降低細(xì)胞活性，馬尾藻多糖25、50、100、200、400 μg/mL處理后，均能提高感染細(xì)胞的活性；PCV-2感染3D4/2細(xì)胞后均能顯著提高TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、MCP-1等炎癥因子的水平，馬尾藻多糖處理后，25、50、100、200、400 μg/mL均能在一定程度上降低TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-10、MCP-1的分泌水平，且其中25、50 μg/mL的效果最明顯。結(jié)果表明，馬尾藻多糖具有較好的體外抗炎作用，且其抗炎作用機(jī)制可能與其抑制炎癥因子IL-1β、IL-8、IL-10、TNF-α、MCP-1等的分泌有關(guān)。

關(guān)鍵詞：馬尾藻多糖；PCV-2；3D4/2細(xì)胞；炎癥因子

中圖分類號： S853.74文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2017）23-0166-03

收稿日期：2016-06-29

豬圓環(huán)病毒Ⅱ型（porcine circovirus type Ⅱ，PCV-Ⅱ）是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（postweaning mutisystenic wasting syndrome，PMWS）的主要致病原，已成為影響全球養(yǎng)豬業(yè)的重大疾病，導(dǎo)致巨大的經(jīng)濟(jì)損失。PCV-Ⅱ病毒復(fù)制的主要場所是機(jī)體的單核-巨噬細(xì)胞和抗原遞呈細(xì)胞，PCV-Ⅱ感染后，病豬體內(nèi)肺、肝、腎、扁桃體、胸腺、外周血單核細(xì)胞、支氣管淋巴結(jié)、腹股溝淋巴結(jié)中均能檢測到PCV-Ⅱ病毒核酸[4]，PCV-Ⅱ感染主要表現(xiàn)為淋巴細(xì)胞缺失和單核細(xì)胞浸潤等。本試驗(yàn)就馬尾藻多糖對感染PCV-Ⅱ的3D4/2細(xì)胞增殖活性及炎癥相關(guān)細(xì)胞因子分泌的影響進(jìn)行觀察，探討馬尾藻多糖抗炎作用分子機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1病毒和細(xì)胞豬圓環(huán)病毒Ⅱ型（SH株）（PCVⅡ）為南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部動物疫病診斷與免疫重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室分離保存，經(jīng)PK-15細(xì)胞增殖后測得病毒滴度為104 TCID50/0.1 mL。豬肺泡巨噬細(xì)胞系3D4/2細(xì)胞由廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)教研室提供。

1.1.2試驗(yàn)藥物馬尾藻多糖，廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院藥理實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3主要儀器和試劑Multimode Plate Reader多功能酶標(biāo)儀（TECAN）；RPMI 1640培養(yǎng)液（Gibc）；胎牛血清（Gibco）；噻唑藍(lán)MTT（索萊寶）；小鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）、白介素-8（IL-8）、白介素-10（IL-10）、巨噬細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）ELISA檢測試劑盒（欣博盛）。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1馬尾藻多糖對PCV-2體外感染3D4/2細(xì)胞活性的影響分別設(shè)置細(xì)胞對照組、病毒對照組和6個不同藥物濃度組（25、50、100、200、400、800 μg/mL），當(dāng)細(xì)胞密度至1×106 cell/mL時，接至96孔板，每孔100 μL，37 ℃、5% CO2條件下過夜使其貼壁。細(xì)胞對照組加入無血清1640培養(yǎng)液 200 μL，病毒組及藥物組加入等量10-1PCV-2病毒液，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中吸附2 h，棄去病毒液，PBS緩沖液清洗3次后，細(xì)胞對照組、病毒對照組每孔加入100 μL含5% FBS-1640培養(yǎng)液，藥物組加入等量不同濃度SP繼續(xù)培養(yǎng) 8 h，用于檢測細(xì)胞活性。

1.2.2馬尾藻多糖對PCV-2體外感染3D4/2細(xì)胞炎癥相關(guān)因子的影響分別設(shè)置細(xì)胞對照組、病毒對照組和5個不同藥物濃度組（25、50、100、200、400 μg/mL），調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×106 cell/mL鋪于24孔板中，1 000 μL/孔，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)使細(xì)胞貼壁。棄上清，細(xì)胞對照組加入1 000 μL/孔培養(yǎng)液，病毒組、藥物組加入10-1 PCV-2病毒液1 000 μL/孔，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)2 h，棄上清，細(xì)胞對照組、LPS組、病毒對照組加入1 000 μL/孔培養(yǎng)液，藥物組分別加入不同濃度馬尾藻多糖，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)12 h，收集細(xì)胞上清液，用于 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、MCP-1等炎癥相關(guān)因子的檢測。

1.2.3MTT法檢測細(xì)胞活性按上述處理細(xì)胞培養(yǎng)3D4/2細(xì)胞8 h后，每孔吸棄10 μL上清，各組細(xì)胞每孔加入10 μL MTT（5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)結(jié)束后，棄掉孔內(nèi)液體，每孔加入100 μL DMSO，搖勻，靜置10 min，置酶標(biāo)儀上測定D570 nm值。

1.2.4ELISA法測定炎癥相關(guān)因子分泌水平按照上述處理后收集細(xì)胞上清，根據(jù)ELISA法檢測炎癥因子（IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α、MCP-1）分泌水平，嚴(yán)格按照炎癥因子（IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α、MCP-1）測定試劑盒說明進(jìn)行操作。

1.3數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SSPS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANOVA）。

2結(jié)果與分析

2.1不同濃度馬尾藻多糖對PCV-2體外感染3D4/2細(xì)胞12 h存活率的影響

由圖1可見，PCV-2感染3D4/2細(xì)胞明顯降低細(xì)胞活性，與細(xì)胞對照組相比差異極顯著（P<0.01）；加入馬尾藻多糖處理后，50、100、200、400 μg/mL馬尾藻多糖能提高感染3D4/2細(xì)胞活性，與病毒對照組相比差異極顯著（P<0.01）。表明馬尾藻多糖能顯著提高PCV-2感染3D4/2細(xì)胞活性。endprint

2.2不同濃度馬尾藻多糖對PCV-2體外感染3D4/2細(xì)胞TNF-α分泌的影響

由圖2可見，PCV-2感染3D4/2細(xì)胞后升高細(xì)胞TNF-α水平，與空白對照組相比差異極顯著（P<0.01）；加入馬尾藻多糖處理后，與病毒對照組相比，25、50、100 μg/mL馬尾藻多糖能極顯著降低TNF-α水平（P<0.01）；200 μg/mL馬尾藻多糖能顯著降低TNF-α水平（P<0.05）；400 μg/mL馬尾藻多糖能降低TNF-α水平，但差異不顯著（P>0.05）。

2.3不同濃度馬尾藻多糖對PCV-2體外感染3D4/2細(xì)胞IL-1β分泌的影響

由圖3可見，PCV-2感染3D4/2細(xì)胞后升高細(xì)胞IL-1β水平，與空白對照組相比差異極顯著（P<0.01）；加入馬尾藻多糖處理后，與病毒對照組相比，25、50 μg/mL馬尾藻多糖能極顯著降低IL-1β水平（P<0.01），100、400 μg/mL馬尾藻多糖能降低IL-1β水平，但差異不顯著（P>0.05）。

2.4不同濃度SP對PCV-2體外感染3D4/2細(xì)胞IL-6分泌的影響

由圖4可見，PCV-2感染3D4/2細(xì)胞后升高細(xì)胞IL-6水平，與空白對照組相比差異顯著（P<0.05）；加入馬尾藻多糖處理后，與病毒對照組相比，25 μg/mL馬尾藻多糖降低 IL-6水平，但差異不顯著（P>0.05）；50、100、200、400 μg/mL 馬尾藻多糖均能顯著或極顯著升高IL-6水平（P<0.05，P<0.01）。

2.5不同濃度馬尾藻多糖對PCV-2體外感染3D4/2細(xì)胞IL-8分泌的影響

由圖5可見，PCV-2感染3D4/2細(xì)胞后升高細(xì)胞IL-8水平，與空白對照組相比差異極顯著（P<0.01）；加入馬尾藻多糖處理后，與病毒對照組相比，25、50、100 μg/mL馬尾藻多糖能極顯著降低IL-8水平（P<0.01）；200 μg/mL SP能顯著降低IL-8水平（P<0.05）；400 μg/mL馬尾藻多糖能降低IL-8水平，但差異不顯著（P>0.05）。

2.6不同濃度馬尾藻多糖對PCV-2體外感染3D4/2細(xì)胞IL-10分泌的影響

由圖6可見，PCV-2感染3D4/2細(xì)胞后升高細(xì)胞IL-10水平，與空白對照組相比差異極顯著（P<0.01）；加入馬尾藻多糖處理后，與病毒對照組相比，25、50 μg/mL馬尾藻多糖能極顯著或顯著降低IL-10水平（P<0.01，P<0.05），100、200、400 μg/mL馬尾藻多糖能降低IL-10水平，但差異不顯著（P>0.05）。

2.7不同濃度馬尾藻多糖對PCV-2體外感染3D4/2細(xì)胞MCP-1分泌的影響

由圖7可見，PCV-2感染3D4/2細(xì)胞后升高細(xì)胞 MCP-1水平，與空白對照組相比差異不顯著（P>0.05）；加入馬尾藻多糖處理后，與病毒對照組相比，25、50、100、200 μg/mL 馬尾藻多糖能降低MCP-1水平但差異不顯著（P>0.05）。

3討論

多糖、皂苷類和黃酮等是中藥的有效成分，具有促進(jìn)細(xì)胞生長、參與免疫調(diào)節(jié)等功效。炎癥是機(jī)體受到各種致炎因素的刺激和損傷后，為滅活及移除這些致炎因素并為組織修復(fù)創(chuàng)造環(huán)境而產(chǎn)生的防御性反應(yīng)，是一種十分常見而又重要的基本病理過程，是許多疾病的癥狀或并發(fā)癥，可引起局部或全身性反應(yīng)。炎癥主要由細(xì)菌和病毒引起，也可因物理、化學(xué)、外傷等刺激而產(chǎn)生[5-7]。在炎癥反應(yīng)中，巨噬細(xì)胞起著重要作用，是體內(nèi)啟動炎癥介質(zhì)產(chǎn)生的中心細(xì)胞，活化的巨噬細(xì)胞是參與炎癥反應(yīng)的TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、MCP-1等細(xì)胞因子的重要來源[8-9]，為調(diào)控炎癥反應(yīng)的主要細(xì)胞，由炎癥反應(yīng)所致免疫防御和免疫功能紊亂過程中，巨噬細(xì)胞是一個關(guān)鍵的參與者。

在本試驗(yàn)中，PCV-2感染3D4/2細(xì)胞后顯著促進(jìn)了TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、MCP-1等炎癥因子的分泌，而用馬尾藻多糖處理后，25、50、100、200、400 μg/mL馬尾藻多糖均在一定程度上抑制了TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-10、MCP-1等炎癥因子的分泌，其中20、50 μg/mL效果較明顯。

4結(jié)論

馬尾藻多糖能顯著提高PCV-2感染的3D4/2細(xì)胞活性，具有較好的體外抗炎作用，且其抗炎作用機(jī)制可能與其抑制炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-10、MCP-1等的分泌有關(guān)。

參考文獻(xiàn)：

[1]梁世忠，李興芳，陳靜，等. 馬尾藻多糖的抗腫瘤作用及其免疫功能的研究田[J]. 海洋科學(xué)，2009，33（3）：49-52.

[2]Sinha S，Astani A，Ghosh T，et al. Polysaccharides from Sargassum tenerrimum：structural features，chemical modification and anti-viral activity[J]. Phytochemistry，2010，71（2/3）：235-242.

[3]劉洪麗，胡庭俊，何穎，等. 馬尾藻多糖分離提取及抗氧化活性初步觀察[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009（6）：337-339.

[4]Yu S，Opriessnig T，Kitikoon P，et al. Porcine circovirus type 2 （PCV2） distribution and replication in tissues and immune cells in early infected pigs[J]. Veterinary Immunology and Immunopathology，2007，115（3/4）：261-272.

[5]倪志宇. CCK-8對炎癥反應(yīng)中促炎及抗炎性細(xì)胞因子表達(dá)的調(diào)控機(jī)制研究[D]. 石家莊：河北醫(yī)科大學(xué)，2005：168-196.

[6]汪秀，李菲，黃利輝. 油茶籽殼總黃酮對黃曲霉毒素B1致肝細(xì)胞氧化應(yīng)激的保護(hù)作用及機(jī)制[J]江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（4）：308-311，577.

[7]范志宇，魏后軍，胡波，等. 兔出血癥病毒桿狀病毒載體滅活疫苗安全性及效力試驗(yàn)[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（11）：272-275.

[8]Wulster M C，Ajuwon K M，Wang J，et al. Adiponectin differentially regulates cytokines in porcine macrophages[J]. Biochem Biophys Res Commun，2004，316：924-929.

[9]邱海波. 多器官功能衰竭綜合征與全身炎癥反應(yīng)綜合征[J]. 遼寧醫(yī)學(xué)雜志，2002（16）：113-115.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)2017年第45卷第23期鐘小仙，劉智微，張建麗，等. 蘇丹草-擬高粱雜交種鮮草飼喂獺兔的效果[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（23）：169-171.endprint