人參根際防病促生放線菌的篩選及其活性

王呈玉+張浩+崔俊濤+焉莉+王玉軍+王繼紅+王艷紅

摘要：為開發(fā)防病促生生物菌肥種質(zhì)資源，采用對峙培養(yǎng)法從人參根際土壤中分離具有拮抗植物病原真菌活性的放線菌，鑒別培養(yǎng)基篩選，結(jié)合分光光度計法，定性定量測定其產(chǎn)吲哚乙酸（IAA）、溶磷和產(chǎn)鐵載體等促生活性，并對該放線菌進(jìn)行生理生化和分子鑒定。結(jié)果表明，獲得1株具有較強(qiáng)植物病原真菌拮抗活性的放線菌菌株，與淡紫灰鏈霉菌（Streptomyces lavendulae）的親緣關(guān)系最近，將其命名為淡紫灰鏈霉菌菌株DC-A；同時該菌具有較強(qiáng)的產(chǎn)IAA、溶磷和產(chǎn)鐵載體促生活性，可以為后續(xù)防病促生菌劑的研制提供新的材料。

關(guān)鍵詞：植物根際促生菌；吲哚乙酸；溶磷作用；鐵載體；分子鑒定；拮抗活性

中圖分類號： S435.675文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2017）23-0103-04

植物根際促生菌是土壤中的重要組成部分，它們直接或間接地促進(jìn)植物的生長，參與土壤各種營養(yǎng)元素的生物地球化學(xué)循環(huán)和可持續(xù)的農(nóng)作物生產(chǎn)[1，3]。植物根際促生菌通過在植物根際土壤中協(xié)助植物獲取營養(yǎng)元素、動員土壤中難溶性的營養(yǎng)物質(zhì)、分泌植物生長調(diào)節(jié)劑和抗病活性物質(zhì)等次生代謝產(chǎn)物促進(jìn)植物生長和抑制植物病害的發(fā)生[1，3-13]。因此，篩選各種植物根際促生菌，并對其防病促生活性進(jìn)行研究，可以為PGPR菌劑的開發(fā)和應(yīng)用提供優(yōu)質(zhì)的菌種材料，從源頭上減少農(nóng)業(yè)生產(chǎn)對化學(xué)肥料和農(nóng)藥的依賴，創(chuàng)造可持續(xù)發(fā)展的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)環(huán)境。

從人參根際土壤中分離得到1株具有較強(qiáng)生物防治功能的放線菌淡紫灰鏈霉菌菌株DC-A（Streptomyces lavendulae strain DC-A），該菌還具有產(chǎn)吲哚乙酸（indoleacetic acid，簡稱IAA）、溶解無機(jī)磷和產(chǎn)生鐵載體的促生活性，可為開發(fā)人參專用型PGPR菌劑提供優(yōu)良的菌種，從而解決人參種植過程中由于農(nóng)藥的施用導(dǎo)致的人參品質(zhì)下降問題。

1材料與方法

1.1土壤樣本的來源

采集吉林省集安市和撫松市人參主產(chǎn)區(qū)人參根際土壤，放入自封袋中，置于4 ℃冰箱中保存。

1.2供試病原菌來源

人參立枯絲核病菌（Rhizoctonia solani Kuhn）、人參菌核病菌（Sclerotinia libertiana Fuck.）、人參枯萎病菌（F. oxysporum）、人參根腐病菌（Fusarium solani）、人參黑斑病菌（Alternaria panax）、禾谷鐮孢菌（F. graminearum）、玉米大斑病菌（Exserohilum turcicum）、黃瓜枯萎病菌（F. oxysporium f.sp.cucumerinum）、串珠鐮孢菌（F. moniliforme）、玉米彎孢葉斑病菌（Curvularia lunata）、番茄灰霉病菌（Botrytis cirerea）、煙草赤星病菌（Alternaria alternata）、辣椒炭疽病菌（Colletotrichum capsici）、白菜軟腐病菌（Erwinia carotovora var.carotovora）、十字花科蔬菜黑腐病菌（Xanthomonas campestris var.campestris）、茄科青枯病菌（Ralstonia solanacearum）。以上菌株均由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理實驗室提供。

1.3人參根際土壤具有拮抗活性的放線菌的篩選

稱取10 g人參根際土壤，采用稀釋平皿分離法，在放線菌分離培養(yǎng)基（可溶性淀粉20.00 g，KNO3 1.00 g，NaCl 0.50 g，MgSO4·7H2O 0.50 g，K2HPO4·3H2O 0.50 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，瓊脂18.00 g，蒸餾水1 L，pH值7.5～8.0。）表面分離土壤中的放線菌；經(jīng)純化后的放線菌菌株，于-20 ℃（用甘油保存）和4 ℃冰箱中保存。

以16種引起植物病害的病原真菌為指示菌，采用對峙培養(yǎng)法，篩選具有拮抗活性的放線菌。在PDA培養(yǎng)基表面一端接種指示菌，另一端接種人參根際放線菌，每組試驗重復(fù)3次，培養(yǎng)至病原菌長滿整個培養(yǎng)皿時結(jié)束，以抑菌帶寬度確定放線菌的拮抗活性。以不接放線菌的平板作對照。

1.4人參根際放線菌促生活性檢測

1.4.1產(chǎn)IAA活性的定性和定量測定采用Salkowski比色法對具有拮抗活性的人參根際放線菌進(jìn)行產(chǎn)IAA活性測定。將放線菌分別接種于含L-色氨酸終濃度為0.5、1.0 g/L 的高氏1號液體培養(yǎng)基中，28 ℃搖床培養(yǎng)，14 d后吸取5 mL發(fā)酵液10 000 r/min離心10 min，吸取4 mL上清加入等體積的Salkowski顯色劑，充分混勻，室溫避光顯色 30 min，出現(xiàn)粉色為陽性，說明具有產(chǎn)IAA活性[14]?？焖賹⒎磻?yīng)液在530 nm處測定吸光度（D530 nm）。以不添加色氨酸的培養(yǎng)基為對照，以標(biāo)準(zhǔn)品IAA對應(yīng)的光密度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算IAA的產(chǎn)量（mg/L）。

1.4.2溶磷活性的測定將具有拮抗活性的人參根際放線菌接種于液體高氏1號培養(yǎng)基，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)7 d，8 000 r/min 離心5 min收集菌體，用去離子水重懸菌體沉淀后 8 000 r/min 離心5 min，每次操作重復(fù)3次，將菌體表面的高氏1號培養(yǎng)基成分洗凈，無菌操作稱取0.3 g菌體（濕質(zhì)量）接種于100 mL PKO液體培養(yǎng)基中，28 ℃搖床培養(yǎng)14 d，采用鉬銻抗比色法測定不同培養(yǎng)時間發(fā)酵液有效磷含量，對具有拮抗活性的人參根際放線菌進(jìn)行溶磷活性測定[15]。以不接菌的培養(yǎng)基為對照。

1.4.3產(chǎn)鐵載體活性的定性分析將具有拮抗活性的人參根際放線菌接種于CAS培養(yǎng)基表面，28 ℃培養(yǎng)14 d，觀察菌落周圍是否有透明圈[16]。

1.5人參根際促生放線菌的鑒定endprint

1.5.1人參根際促生放線菌的培養(yǎng)特征和生理生化特性鑒定采用插片法觀察人參根際促生放線菌菌絲體形態(tài)，并參照范麗霞等的方法[17]，采用國際鏈霉菌計劃培養(yǎng)基（ISP），將溶磷放線菌菌株分別接種到酵母膏麥芽膏瓊脂培養(yǎng)基（ISP2）、燕麥粉瓊脂培養(yǎng)基（ISP3）、無機(jī)鹽淀粉瓊脂培養(yǎng)基（ISP4）、甘油天門冬酰胺瓊脂培養(yǎng)基（ISP5）、蛋白胨酵母膏鐵鹽瓊脂培養(yǎng)基（ISP6）、酪氨酸瓊脂培養(yǎng)基（ISP7）、察氏培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)20 d，觀察并記錄菌株在7種不同培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征。

參照徐麗華等的方法[18]進(jìn)行人參根際促生放線菌的生理生化特征鑒定。

1.5.2人參根際促生放線菌的分子鑒定將具有防病促生活性的人參根際放線菌接種于高氏1號液體培養(yǎng)基中，28 ℃搖床培養(yǎng)7 d，離心收集菌體后抽真空冷凍干燥48 h。冷凍干燥后的菌體，提取基因組DNA。參照Hamdali等的方法[19]進(jìn)行16S rDNA擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，用Clustal W將測序結(jié)果與GenBank中相關(guān)的16S rRNA序列進(jìn)行比對，通過MEGA 6.0軟件對菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，用Bootstrap法（1 000 次重復(fù)）檢驗。

2結(jié)果與分析

2.1人參根際放線菌抑菌譜的測定

對分離到的人參根際放線菌進(jìn)行培養(yǎng)皿內(nèi)拮抗試驗，獲得1株對病原真菌具有較強(qiáng)拮抗活性的放線菌菌株，命名為DC-A。由圖1可以看出，菌株DC-A對禾谷鐮孢菌、人參菌核病菌、人參枯萎病菌、黃瓜枯萎病菌、人參黑斑病菌和人參根腐病菌具有較強(qiáng)的抑菌效果，其抑菌帶寬度分別為 10.1、19.6、7.5、5.8、8.2、4.2 mm。

2.2人參根際放線菌促生活性檢測

2.2.1菌株DC-A產(chǎn)IAA活性的定性和定量測定結(jié)果由圖2可知，人參根際放線菌DC-A具有合成IAA的能力。IAA含量隨L-色氨酸（L-trp）添加濃度的增大而增大，不添加色氨酸時，菌株DC-A的IAA合成量最高達(dá)4.96 mg/L；色氨酸添加濃度為0.05%、0.10%時，菌株DC-A合成IAA的量明顯高于對照組，最高合成量分別為15.36、33.59 mg/L。

2.2.2菌株DC-A溶無機(jī)磷活性測定由圖3可知，人參根際放線菌菌株DC-A在以Ca3（PO4）2為唯一磷源的PKO液體培養(yǎng)基中，具有明顯的溶磷特性，15 d內(nèi)菌株的溶磷量呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，在12 d前溶磷量呈明顯增加趨勢，在12 d達(dá)到最高溶磷量410.95 mg/L。相應(yīng)發(fā)酵液的pH值并沒有同溶磷量表現(xiàn)出對應(yīng)的趨勢，而是在pH值為7.0上下波動。由此可以看出，人參根際放線菌菌株DC-A在以Ca3（PO4）2為唯一磷源的PKO液體培養(yǎng)基中出現(xiàn)的明顯溶磷特性與發(fā)酵液pH值變化不相關(guān)，菌株DC-A的溶磷機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

2.2.3菌株DC-A產(chǎn)鐵載體活性鑒定由圖4可知，將人參根際放線菌DC-A接種于CAS固體平板培養(yǎng)14 d后，在其菌落周圍出現(xiàn)明顯的橙紅色顏色圈，說明人參根際放線菌DC-A具有合成鐵載體的活性。

2.3人參根際促生菌株DC-A的鑒定

2.3.1菌株的形態(tài)特征菌株DC-A在固體高氏1號培養(yǎng)基上生長良好，氣絲絨狀，淺灰色至灰色?；z粉紫色、紅紫色和紫色，可溶色素同基絲色。氣生菌絲發(fā)達(dá)，孢子絲螺旋形，可達(dá)10圈，呈現(xiàn)典型的鏈霉菌形態(tài)特征，結(jié)果如圖5所示。

2.3.2菌株的培養(yǎng)特征高氏合成1號瓊脂：氣絲灰色，絨狀，基絲粉紫色。酵母膏麥芽膏瓊脂培養(yǎng)基（ISP2）：氣絲豐茂，灰粉色帶薰衣草色彩，基絲豐茂，無色至弱褐色，可溶色素櫟褐色。燕麥粉瓊脂培養(yǎng)基（ISP3）：氣絲灰粉色帶薰衣草色彩，基絲無色，無可溶色素。無機(jī)鹽淀粉瓊脂（ISP4）：氣絲豐茂，黃灰色，基絲無色，可溶色素黃色。甘油天門冬酰胺瓊脂培養(yǎng)基（ISP5）：氣絲弱，褐灰色至銀灰色，基絲好，無色，無可溶色素。蛋白胨酵母膏鐵鹽瓊脂培養(yǎng)基（ISP6）：氣絲不發(fā)達(dá)，灰粉色帶薰衣草色，基絲好，無色，可溶色素弱褐色。酪氨酸瓊脂（ISP7）：氣絲豐茂，紅灰色帶薰衣草色彩，基絲好，弱褐色至芥褐色，可溶色素?zé)o至弱褐色。察氏培養(yǎng)基：氣絲弱，灰色，基絲好，無可溶色素。結(jié)果如圖6所示。

2.3.3菌株的生理生化特性生理生化試驗表明，菌株 DC-A 能使明膠液化、牛奶凝固并胨化、淀粉水解、硝酸鹽還原、纖維素水解、在蛋白胨酵母精鐵瓊脂和營養(yǎng)瓊脂內(nèi)產(chǎn)生褐色素，但不產(chǎn)生硫化氫（H2S）、黑色素。碳源利用結(jié)果顯示，菌株利用D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、蔗糖以及麥芽糖、醋酸鈉、檸檬酸鈉、琥珀酸鈉；對D-果糖和D-木糖利用較差；不利用棉子糖、肌醇、D-甘露醇、L-鼠李糖以及L-乳糖。

2.3.4菌株的16S rDNA鑒定參照Hamdali等的方法[19]，以菌株DC-A總DNA為模板，對DC-A菌株的16S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到長度為1 418 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物。將測序結(jié)果在GenBank中利用Blast軟件進(jìn)行同源性序列比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖7所示。菌株DC-A與已報道的淡紫灰鏈霉菌親緣關(guān)系最近，同源性達(dá)99%，與Blast結(jié)果一致。因此，菌株DC-A在分類學(xué)地位上初步確定為淡紫灰鏈霉菌菌株DC-A。

3結(jié)論與討論

綜上所述，從人參根際土壤中分離得到1株具有抗多種植物真菌病害功能的放線菌淡紫灰鏈霉菌菌株DC-A。該菌兼具產(chǎn)IAA、鐵載體和溶解無機(jī)磷的功能。淡紫灰鏈霉菌菌株DC-A為人參根際專用防病促生菌劑的開發(fā)提供了優(yōu)

質(zhì)的資源。

致謝：研究中所用植物病原真菌均來自吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理實驗室，特此表示感謝。

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