稻粒黑粉病、稻曲病、惡苗病病原真菌的MALDI—TOF—MS鑒定規(guī)范化條件研究

周莉質(zhì)+宗凱+李云飛+姚劍+檀根甲

摘要：采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，簡稱MALDI-TOF-MS）技術(shù)對(duì)水稻作物的3種主要病原真菌進(jìn)行分析，以獲得穩(wěn)定的指紋圖譜。從菌物預(yù)處理方法、基質(zhì)、點(diǎn)樣方法等3個(gè)方面進(jìn)行比較，對(duì)影響MALDI-TOF-MS分析結(jié)果的主要因素進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，菌物預(yù)處理方法對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響最大，熱處理法在細(xì)胞壁較厚的真菌樣品處理中可以獲得較完整的生物信息；構(gòu)建稻粒黑粉病病菌（Tilletia horrida）、稻曲病病菌（Ustilaginoidea virens）、惡苗病病菌（Fusarium moniliforme）的MALDI-TOF-MS鑒定規(guī)范化方法，擴(kuò)充MALDI-TOF-MS指紋圖譜數(shù)據(jù)庫，可簡便、快速、準(zhǔn)確地對(duì)細(xì)胞壁加厚的真菌樣品進(jìn)行鑒定。

關(guān)鍵詞：MALDI-TOF-MS；稻粒黑粉??；稻曲?。粣好绮。昏b定；指紋圖譜

中圖分類號(hào)： S435.111.4文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2017）23-0093-07

水稻真菌病害大多是由病原菌的分生孢子、厚垣孢子以種子、土壤帶菌或空氣水流傳播的方式流行[1]。近年來由于新型超級(jí)稻的推廣，稻粒黑粉病、稻曲病、惡苗病的真菌病害逐漸上升為水稻的主要病害?；|(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，簡稱MALDI-TOF-MS）技術(shù)可借助基質(zhì)對(duì)非揮發(fā)性和熱不穩(wěn)定性等生物大分子進(jìn)行解吸電離，脈沖激發(fā)后離子云電離粒子真空向上通過飛行管探測(cè)器，產(chǎn)生1個(gè)頻譜圖被認(rèn)為是該微生物的指紋圖譜[2]。

植物病原真菌各生長階段營養(yǎng)體差異較大，表達(dá)的蛋白種類和表達(dá)量有一定變化，與細(xì)菌相比，真菌孢子細(xì)胞壁含多糖和固醇類物質(zhì)，在MALDI-TOF-MS鑒定中沒有單一的方法被作為常規(guī)處理方法使用，其結(jié)果常出現(xiàn)因培養(yǎng)條件不同而導(dǎo)致鑒定結(jié)果不準(zhǔn)確的情況[3-5]?；贒NA序列的鑒定方法受PCR引物探針特異性、測(cè)序成本和時(shí)間等因素的制約。本研究對(duì)稻粒黑粉病病菌（Tilletia horrida）、稻曲病病毒（Ustilaginoidea virens）和惡苗病病菌（Fusarium moniliforme）的MALDI-TOF-MS鑒定從預(yù)處理方法、適用基質(zhì)、點(diǎn)樣方法等3個(gè)方面進(jìn)行優(yōu)化[1，6]，對(duì)病原真菌建立標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范化的 MALDI-TOF-MS鑒定方法并進(jìn)行穩(wěn)定性重復(fù)分析，為植物病原真菌的MALDI-TOF-MS鑒定方法提供參考。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用菌種分離自水稻帶菌種子中，由安徽出入境檢驗(yàn)檢疫局植物檢疫實(shí)驗(yàn)室保存。

PDA培養(yǎng)基：200 g馬鈴薯、20 g葡萄糖、18 g瓊脂，加入1 000 mL蒸餾水中加熱攪拌溶解，滅菌后待冷卻至55～60 ℃倒平板。

察氏培養(yǎng)基：3.00 g硝酸鈉、1.00 g磷酸氫二鉀、0.50 g硫酸鎂、0.50 g氯化鉀、0.01 g硫酸亞鐵、30.00 g蔗糖、18.00 g 瓊脂，加入 1 000 mL 蒸餾水中加熱攪拌溶解，滅菌后待冷卻至55～60 ℃ 倒平板。

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜分析系統(tǒng)，購自日本島津公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1MALDI-TOF-MS參數(shù)線性操作模式，延遲提取，分析離子帶正電荷，基質(zhì)抑制偏轉(zhuǎn)模式，加速電壓為20 kV，提取電壓為18.6 kV，脈沖離子提取時(shí)間為3 500 ns，質(zhì)荷比范圍為1 500～20 000，激光點(diǎn)擊數(shù)為每張圖譜80～100次，激光頻率60.0 Hz。使用大腸桿菌ATCC 8739作為外標(biāo)校準(zhǔn)物質(zhì)。

1.2.2病原真菌的培養(yǎng)稻曲病病菌的培養(yǎng)：將純化保存的菌株接種于PDA平板中，28 ℃活化培養(yǎng)7 d。

惡苗病病菌的培養(yǎng)：將純化保存的菌株接種于察氏培養(yǎng)基平板中，28 ℃活化培養(yǎng)7 d。

稻粒黑粉病病菌厚垣孢子的獲得：病粒在75%乙醇中浸泡5 min后夾出，在濾紙上晾干，再用無菌水漂洗病粒2次，夾出病粒用濾紙吸干水分，用刀切開病粒將厚垣孢子抖入裝有無菌水的培養(yǎng)皿中，用擦鏡紙過濾得到稻粒黑粉病菌的厚垣孢子。

1.2.3樣品的預(yù)處理方法選擇用接種針各挑取20 mg（濕質(zhì)量）稻曲病病菌、惡苗病病菌菌體和稻粒黑粉病病菌厚垣孢子，采用75%乙醇法、熱處理法、液氮研磨法、載玻片擠壓法、氧化鋯珠勻漿法等5種方法分別對(duì)3種真菌進(jìn)行破壁預(yù)處理。

75%乙醇法：向20 mg菌體（厚垣孢子）中加入300 μL無菌水搖勻，再加入900 μL預(yù)冷的無水乙醇渦旋混勻，超聲處理 3 min 后12 000 r/min離心2 min，棄去上清液，沉淀物于室溫晾5 min[6]。

熱處理法：向20 mg菌體（厚垣孢子）中加入300 μL無菌水搖勻，沸水水浴加熱30 min，取出冷卻后加入1 mL無水乙醇，搖勻靜置3 min后12 000 r/min離心2 min。棄去上清液，沉淀物于室溫晾5 min。

液氮研磨法：將菌體（厚垣孢子）用液氮研磨后，加入 300 μL 無菌水并移入1.5 mL離心管內(nèi)，加入900 μL預(yù)冷的無水乙醇渦旋混勻，靜置3 min后12 000 r/min離心2 min，棄去上清液，沉淀物于室溫晾5 min。

載玻片擠壓法：將菌體（厚垣孢子）用2片載玻片用力擠壓，在顯微鏡下觀察到孢子破裂即可。用300 μL無菌水將擠壓的菌體洗入1.5 mL離心管中，加入900 μL預(yù)冷的無水乙醇渦旋混勻，靜置3 min后12 000 r/min離心2 min，棄去上清液，沉淀物于室溫晾5 min。endprint

氧化鋯珠勻漿法：向20 mg菌體（厚垣孢子）中加入 300 μL 無菌水搖勻，加入100 mg氧化鋯珠（直徑0.5 mm），研磨棒勻漿5 min，加入900 μL預(yù)冷的無水乙醇渦旋混勻，靜置3 min后12 000 r/min離心2 min，棄去上清液，沉淀物于室溫晾5 min[7]。

向5種方法提取的沉淀物中加入30 μL 70%甲酸，將沉淀打散混勻，再加入30 μL乙腈，8 000 r/min離心1 min，取上清液進(jìn)行MALDI-TOF-MS分析。

1.2.4基質(zhì)的選擇采用“1.2.3”節(jié)中選出的最佳樣品預(yù)處理方法分別對(duì)病原真菌進(jìn)行預(yù)處理，基質(zhì)溶劑為水、乙醇、乙腈（體積比為1 ∶1 ∶1）的混合溶液，分別以α-氰基-4-羥基肉桂酸（CHCA）、2，5-二羥基苯甲酸（DHB）、芥子酸（SA）為基質(zhì)進(jìn)行MALDI-TOF-MS分析。

1.2.5點(diǎn)樣方法的選擇采用“1.2.3”節(jié)中最佳的樣品預(yù)處理方法對(duì)病原真菌進(jìn)行預(yù)處理，選用“1.2.4”節(jié)中最佳的基質(zhì)。試樣的點(diǎn)樣方法直接影響基質(zhì)對(duì)生物信息物質(zhì)的離子化程度，對(duì)有效基質(zhì)的溶劑和點(diǎn)樣包被方法進(jìn)行篩選可有效提高M(jìn)ALDI-TOF-MS檢測(cè)結(jié)果的有效性[6]。點(diǎn)樣方法有以下3種。

覆蓋干燥法：將1 μL真菌提取物點(diǎn)加到飛行質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption/ionization，簡稱MALDI）靶板上，室溫條件下晾干，再點(diǎn)加1 μL基質(zhì)溶液覆蓋于樣品點(diǎn)上，室溫條件下晾干用于MALDI-TOF-MS分析。

夾心點(diǎn)樣法：將1 μL基質(zhì)溶液點(diǎn)加在MALDI靶板上，室溫晾干形成種子層，然后在種子層上覆蓋1 μL樣品，室溫晾干，再點(diǎn)加1 μL基質(zhì)溶液覆蓋于樣品點(diǎn)上，室溫條件下晾干用于MALDI-TOF-MS分析。

混合干燥法：將樣品上清液與基質(zhì)溶液等體積混合，取 1 μL 混合液點(diǎn)加在MALDI靶板上，室溫條件下晾干用于MALDI-TOF-MS分析。

1.2.6重復(fù)性試驗(yàn)為確定稻粒黑粉病、稻曲病、惡苗病病原真菌的MALDI-TOF-MS鑒定條件的穩(wěn)定性，對(duì)這3種病原真菌的鑒定進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)。采用“1.2.3”節(jié)中最佳樣品預(yù)處理方法對(duì)病原真菌進(jìn)行預(yù)處理，選用“1.2.4”節(jié)中最佳基質(zhì)和“1.2.5”節(jié)中最適的點(diǎn)樣方法進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)。同一樣品的重復(fù)性試驗(yàn)：每個(gè)樣品重復(fù)點(diǎn)樣10次，進(jìn)行MALDI-TOF-MS分析。批間樣品的重復(fù)性試驗(yàn)：對(duì)病原真菌進(jìn)行3次重復(fù)培養(yǎng)、預(yù)處理提取、點(diǎn)樣等工作。

2結(jié)果與分析

2.1樣品預(yù)處理方法的確定

稻粒黑粉病、稻曲病、惡苗病病原真菌的預(yù)處理提取物以CHCA為基質(zhì)的MALDI-TOF-MS分析結(jié)果分別如圖1、圖2、圖3所示。75%乙醇法對(duì)真菌類細(xì)胞壁過厚的樣品不適用，稻粒黑粉病病菌和惡苗病病菌未得到特征峰譜圖或強(qiáng)度過低，稻曲病病菌在質(zhì)荷比小于4 000的小分子肽段部分背景噪音過高；液氮研磨法和氧化鋯珠勻漿法對(duì)真菌細(xì)胞破碎程度過高，使蛋白特征峰過低；載玻片擠壓法造成細(xì)胞破碎不完全，特征蛋白沒有完全釋放；熱處理法操作簡便，所得蛋白提取物的離子峰背景噪音最低，特征峰數(shù)量最多，離子激發(fā)強(qiáng)度適中且峰譜明顯。因此，選用熱處理法作為樣品預(yù)處理的最適方法。

2.2最適基質(zhì)的確定

基質(zhì)CHCA多用于多肽及小分子樣品的分析，DHB多用于糖類及小分子樣品的分析，SA多用于大于10 000 u的蛋白及大分子樣品的分析。由圖4至圖6可知，3種植物病原真菌胞內(nèi)提取物中DHB包被的糖類小分子成分無法激發(fā)出特征成分；SA背景噪音較高，并無特征峰譜。基質(zhì)篩選試驗(yàn)表明，稻粒黑粉病病菌、稻曲病病菌、惡苗病病菌的細(xì)胞懸液提取物中特征成分主要為在質(zhì)荷比小于10 000位置出現(xiàn)的多肽和小分子，以CHCA為基質(zhì)獲得的圖譜較穩(wěn)定，為最佳基質(zhì)。

2.3點(diǎn)樣方法的確定

由圖7至圖9可知，稻粒黑粉病病菌混合干燥法只得到質(zhì)荷比 3 847、 6 829、 7 497等3個(gè)特征峰且2次平行點(diǎn)樣重

復(fù)性較差，夾心點(diǎn)樣法在質(zhì)荷比2 615、3 814位置出現(xiàn)非特異性峰且背景噪音較高；稻曲病病菌混合干燥法在質(zhì)荷比4 000之前背景噪音過高無法辨識(shí)特征峰，夾心點(diǎn)樣法只能激發(fā)到質(zhì)荷比4 414、8 823 等2個(gè)最強(qiáng)的峰值，其他強(qiáng)度不高的小峰不明顯；惡苗病病菌混合干燥法出峰凌亂無規(guī)律，夾心點(diǎn)樣法幾乎未檢測(cè)到特征物質(zhì)且背景噪音較高。點(diǎn)樣方法試驗(yàn)結(jié)果表明，覆蓋干燥法中基質(zhì)對(duì)特征蛋白的離子化程度較高，特征蛋白峰譜較清晰，并能有效降低MALDI-TOF-MS背景的干擾。

2.4標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)方法重復(fù)性試驗(yàn)

由圖10至圖12可知，同一樣品重復(fù)10次所得的特征峰譜一致，說明本試驗(yàn)所選的樣品預(yù)處理方法、基質(zhì)、點(diǎn)樣方法穩(wěn)定可行。3種病原真菌分別進(jìn)行3次重復(fù)培養(yǎng)和預(yù)處理提取、點(diǎn)樣等工作的MALDI-TOF-MS分析結(jié)果分別如圖 13至圖15所示，該方法從病原真菌的純培養(yǎng)條件到 MALDI-TOF-MS鑒定的各個(gè)步驟所得的特征蛋白的指紋圖譜一致、特征峰譜一致，說明病原真菌的鑒定結(jié)果可靠，重復(fù)性較好，特征峰譜數(shù)量多且豐度高。采用MALDI-TOF-MS自帶專業(yè)分析軟件 Biotyper 分別對(duì)稻粒黑粉病、 稻曲病、

惡苗病病原真菌圖譜進(jìn)行分析，得到病原真菌標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的特征峰信息如表1所示，在MALDI-TOF-MS鑒定方法相同并選用同種電離基質(zhì)時(shí)，3種病原真菌在質(zhì)荷比對(duì)應(yīng)的位置應(yīng)有的特征峰均出現(xiàn)。

3結(jié)論與討論

在沒有提取、分離和擴(kuò)增的情況下，蛋白質(zhì)作為最具特征性的物質(zhì)可用于微生物的鑒定，而植物病原真菌的MALDI-TOF-MS鑒定準(zhǔn)確性主要影響因素為預(yù)處理方法的差異[8-9]。預(yù)處理使用的75%乙醇法常用于破裂細(xì)菌細(xì)胞膜[10]，但該方法對(duì)真菌的厚垣孢子類細(xì)胞壁加厚的樣品并不能達(dá)到破裂效果。Adams等將病原菌經(jīng)過75%乙醇破裂后再進(jìn)行勻漿和超聲處理[3]，該方法在本試驗(yàn)中并未得到相似的結(jié)果，超聲處理后細(xì)胞內(nèi)蛋白小分子結(jié)構(gòu)松散，不利于與基質(zhì)結(jié)合。MALDI-TOF-MS技術(shù)在植物病原菌的鑒定和研究應(yīng)用中要依靠病原菌指紋圖譜數(shù)據(jù)庫，建立足夠種類的已知病原菌指紋圖譜庫才能實(shí)現(xiàn)最有效、最真實(shí)的鑒定結(jié)果[8]，且應(yīng)對(duì)病原菌進(jìn)行歸類，建立不同的預(yù)處理方法和標(biāo)準(zhǔn)基質(zhì)以得到最穩(wěn)定的結(jié)果，提高指紋圖譜數(shù)據(jù)庫比對(duì)的準(zhǔn)確性。endprint

本試驗(yàn)對(duì)3種水稻病原真菌進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)含物粗提取，沸水水浴30 min細(xì)胞壁破裂較完全，所得細(xì)胞內(nèi)含物主要為胞內(nèi)小分子粗蛋白，蛋白與基質(zhì)CHCA所得MALDI-TOF-MS圖譜背景較低，特征峰數(shù)量多且豐度高，經(jīng)過多次重復(fù)試驗(yàn)，培養(yǎng)條件相同的情況下所得的蛋白指紋圖譜重復(fù)性良好，該方法可用于細(xì)胞壁加厚類真菌樣品的蛋白提取和MALDI-TOF-MS分析。

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