96孔U型反應(yīng)板在縣級(jí)獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室抗體檢測(cè)中的應(yīng)用

左文兵+林貫樹+高伯建

摘要：縣級(jí)獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室主要承擔(dān)著動(dòng)物疫?。谔阋?、高致病性禽流感、豬瘟、豬高致病性藍(lán)耳病、新城疫、布魯氏桿菌病和牛結(jié)核病）免疫抗體效果監(jiān)測(cè)、疫病診斷、流行病學(xué)調(diào)查、重大動(dòng)物疫情的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和預(yù)警預(yù)報(bào)等主要任務(wù)。在動(dòng)物疫病預(yù)防控制，特別是重大動(dòng)物疫情預(yù)防控制工作中發(fā)揮著重要作用。現(xiàn)在市場(chǎng)上進(jìn)口的全自動(dòng)酶免工作站由于價(jià)格昂貴，大多數(shù)的縣級(jí)獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室都沒(méi)有配備，所有的抗體檢測(cè)實(shí)驗(yàn)需要手工操作。在實(shí)驗(yàn)室抗體檢測(cè)操作工作中，筆者利用96孔U型反應(yīng)板的排列布局，集中添加檢測(cè)血清樣品，大大減少每次檢測(cè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)添加血清樣品的時(shí)間和檢測(cè)結(jié)果記錄及統(tǒng)計(jì)時(shí)間。

關(guān)鍵詞：96孔U型板反應(yīng)板；ELISA檢測(cè)試驗(yàn)；血凝抑制試驗(yàn)；樣品排順

在獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)操作中，各種ELISA抗原包被板和血凝抑制試驗(yàn)96孔U型板排列都是和96孔反應(yīng)板結(jié)構(gòu)及位置一致的，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)常用的檢測(cè)方法主要是ELISA檢測(cè)方法和血凝抑制試驗(yàn)檢測(cè)方法。筆者以前實(shí)驗(yàn)時(shí)，每種動(dòng)物的被檢血清樣品要根據(jù)檢測(cè)項(xiàng)目每檢測(cè)一次要加樣血清一次，而且每次實(shí)驗(yàn)一般要檢測(cè)幾個(gè)檢測(cè)項(xiàng)目。在每年的春、秋2季動(dòng)物疫病抗體檢測(cè)工作量大的時(shí)候，有的實(shí)驗(yàn)或要做幾天才能完成，被檢的血清樣品按照實(shí)驗(yàn)要求需要冷藏或者冷凍保存，如果反復(fù)凍融對(duì)檢測(cè)結(jié)果會(huì)有很大影響，在實(shí)驗(yàn)室實(shí)際操作中，用時(shí)最多的時(shí)間主要用在添加被檢血清樣品上。筆者根據(jù)江蘇省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心老師的培訓(xùn)指導(dǎo)和全自動(dòng)酶免工作站的工作原理，在實(shí)際操作中改進(jìn)了原來(lái)實(shí)驗(yàn)時(shí)的血清樣品的加樣方式，根據(jù)檢測(cè)項(xiàng)目和檢測(cè)量的需要，將血清樣品根據(jù)實(shí)驗(yàn)試劑盒的要求，收樣時(shí)在樣品架上按照96孔反應(yīng)板的位置做好的相應(yīng)對(duì)應(yīng)順序排列，在實(shí)驗(yàn)前做好準(zhǔn)備，一次性集中抽取足量的被檢血清，放入96孔反應(yīng)板空中，封膜備用，根據(jù)實(shí)驗(yàn)時(shí)間要求，估計(jì)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境溫度，按照室溫保存或者放在冰箱中4～C冷藏保存?zhèn)溆谩?6孔反應(yīng)板每孔可以存放動(dòng)物血清樣品200μL左右。在做實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目檢測(cè)時(shí)，根據(jù)不同試劑盒實(shí)驗(yàn)需求的血清樣品用量，用相應(yīng)規(guī)格的8或12道等多道移液器添加血清樣品，這樣就可以不用每次檢測(cè)加樣時(shí)再重復(fù)分別一一抽取被檢血清樣品，做到一次足量抽取血清樣品，多次加樣檢測(cè)的使用目的。減少實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目檢測(cè)的加樣時(shí)間，同時(shí)減少環(huán)境溫度對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響?，F(xiàn)在將筆者在動(dòng)物疫病抗體檢測(cè)工作中的96孔ELISA反應(yīng)板的運(yùn)用介紹如下，不妥之處，請(qǐng)同行批評(píng)指正。

1接樣排版

1.1家禽的血清樣品排版

家禽的抗體檢測(cè)方法主要是用血凝抑制試驗(yàn)，接收到合格的樣品后，在96孔樣品離心管架上將被檢樣品按照豎例A1到H1順序排列，依次排版96孔板，血凝抑制試驗(yàn)每版可以排96個(gè)被檢樣品。排好后在樣品離心管架上做好相應(yīng)版號(hào)標(biāo)記，在記錄紙上按照排版位置，記錄一一對(duì)應(yīng)的排列順序位置，記錄也可以運(yùn)用計(jì)算機(jī)表格軟件進(jìn)行，自制記錄排版順序位置表。打印或者復(fù)印此表，作為實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)的母表，記錄和統(tǒng)計(jì)時(shí)用雙色筆對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行記錄和統(tǒng)計(jì)（如表1）。

1.2豬、牛和羊血清樣品排版

豬、牛和羊的抗體檢測(cè)方法主要是用ELISA方法，ELISA試驗(yàn)每板可以排92個(gè)被檢樣品。每次檢測(cè)項(xiàng)目時(shí)，被檢樣品數(shù)量不一定都能排滿92孔板，根據(jù)實(shí)驗(yàn)實(shí)際檢測(cè)量，按照試劑盒要求可以做88～92個(gè)樣品板。為了方便檢測(cè)添加被檢樣品和方便結(jié)果統(tǒng)計(jì)，增加實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，減少實(shí)驗(yàn)中因?yàn)殛?、?yáng)對(duì)照的誤差對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響，增加實(shí)驗(yàn)的成功率，筆者在實(shí)際實(shí)驗(yàn)操作中，對(duì)樣品排不滿92孔板時(shí)，我們一般一板做88樣品，把包被反應(yīng)板的第一列豎向排A1到H12空留8格，留作做兩個(gè)陰、陽(yáng)對(duì)照孔，在96孔反應(yīng)板上，將被檢測(cè)血清樣品從第2列至12列以橫向A2～A12、B2～B12的順序依次排板，以此類推。這種排版方法適用做豬瘟ELISA抗體檢測(cè)、豬高致病性藍(lán)耳病ELISA抗體檢測(cè)和口蹄疫結(jié)構(gòu)蛋白VP1ELISA抗體檢測(cè)等幾種動(dòng)物疫病的抗體檢測(cè)（如表2）。

1.3口蹄疫液相

口蹄疫液相阻斷ELISA的實(shí)驗(yàn)安排在其他實(shí)驗(yàn)做完后再做，根據(jù)口蹄疫液相阻斷ELISA的試劑盒的實(shí)驗(yàn)要求，陰、陽(yáng)對(duì)照放在最后2列排列，這樣就和其他ELISA抗體檢測(cè)的位置排列不一致，口蹄疫液相阻斷ELISA的每個(gè)包被板只能做10份檢測(cè)樣品或者20份檢測(cè)樣品，操作時(shí)把96孔樣品板中的被檢樣品以橫向排列方式（如表3）。

2加被檢血清樣品

根據(jù)動(dòng)物抗體檢測(cè)項(xiàng)目中實(shí)際的檢測(cè)需要量，每個(gè)被檢測(cè)樣品按照樣品記錄表的排序一一對(duì)應(yīng)，使用相應(yīng)規(guī)格的8道或者12道移液器將被檢測(cè)血清樣品按照實(shí)驗(yàn)檢測(cè)項(xiàng)目不同的試劑盒要求的樣品量，分別加入相對(duì)應(yīng)排序位置的抗原包被反應(yīng)板孔中，在實(shí)驗(yàn)檢測(cè)加樣過(guò)程中，樣品中水分會(huì)因?yàn)檎舭l(fā)而發(fā)生樣品量減少，抽取樣品時(shí)，抽取樣品的量應(yīng)多于檢測(cè)需要量。以縣級(jí)動(dòng)物疫病控制中心實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)項(xiàng)目任務(wù)，加入96孔反應(yīng)板中家禽的血清樣品量（家禽主要檢測(cè)高致病性禽流感Re-6株、Re-7株、Re-8株、H7N9和雞新城疫等抗體檢測(cè)項(xiàng)目），以不低于180～200μL足量加入96孔v型反應(yīng)板中，豬牛羊的血清樣品（主要做口蹄疫液相阻斷ELISA、口蹄疫結(jié)構(gòu)蛋白VPlELISA、豬瘟抗體ELISA、豬高致病性藍(lán)耳病ELISA等）以200μL足量加入96孔U型反應(yīng)板中保存?zhèn)溆?，確保所有實(shí)驗(yàn)做完后，96孔反應(yīng)板中的血清樣品孔內(nèi)還有一定量的血清樣品，否則被檢測(cè)樣品量不足時(shí)，還需要再重新添加樣品，增加實(shí)驗(yàn)加樣用時(shí)。

血清樣品加完一版立即封膜一版，保存一版，同時(shí)根據(jù)檢測(cè)項(xiàng)目需要，置常溫保存或者放入冰箱4℃冷藏保存?zhèn)溆?。在?shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)程中，每做一次檢測(cè)項(xiàng)目要換一次新的封膜封板一次，以防止血清樣品在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中受到污染并防止血清樣品中的水分蒸發(fā)，在最短時(shí)間內(nèi)用完，切記被檢測(cè)的血清樣品不可反復(fù)凍融。否則導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確，從而造成實(shí)驗(yàn)失敗。

3實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄和統(tǒng)計(jì)

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，在結(jié)果記錄紙上或者打印好的96孔排序表上或者運(yùn)用電腦軟件上的電子表格上直接記錄檢測(cè)結(jié)果，同時(shí)找出可疑和不合格的動(dòng)物血清樣品，必要時(shí)對(duì)可疑樣品做復(fù)檢。這種運(yùn)用96孔反應(yīng)板的統(tǒng)計(jì)方法，因?yàn)閹追N實(shí)驗(yàn)的96孔反應(yīng)板和試劑盒抗原包被板位置一致，排版表可以做到一表多用，記錄統(tǒng)計(jì)檢測(cè)結(jié)果直觀，準(zhǔn)確，便捷，節(jié)約記錄統(tǒng)計(jì)時(shí)間，大大提高實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作效率。

4結(jié)語(yǔ)

隨著現(xiàn)代畜牧業(yè)快速的發(fā)展，養(yǎng)殖企業(yè)越來(lái)越重視獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測(cè)在動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)及免疫程序制定中的指導(dǎo)作用。雖然縣級(jí)獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室功能室設(shè)置都比較齊全，但是各地動(dòng)物疫情監(jiān)測(cè)經(jīng)費(fèi)投入還有不足，而且因全年檢測(cè)量、檢測(cè)任務(wù)和監(jiān)測(cè)經(jīng)費(fèi)等原因的制約，現(xiàn)有的縣級(jí)獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)操作都是以純手工操作為主，自動(dòng)化ELISA檢測(cè)工作站先進(jìn)的設(shè)備配備極少。為了按時(shí)完成省、市下達(dá)的各項(xiàng)抗體檢測(cè)任務(wù)。縣級(jí)獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室的主要工作是根據(jù)上級(jí)有關(guān)要求，做好春防、秋防集中疫病檢測(cè)和日常檢測(cè)工作，重點(diǎn)檢測(cè)國(guó)家實(shí)行強(qiáng)制免疫的豬瘟、口蹄疫、高致病性藍(lán)耳病、禽流感和雞新城疫等幾大疫病的免疫抗體水平。用96孔U型反應(yīng)板在動(dòng)物疫病抗體檢測(cè)中按照固定格式順序排版集中一次加樣，多次使用，可以大大減少實(shí)驗(yàn)時(shí)間，特別在春防、秋防集中疫病檢測(cè)工作中運(yùn)用效果尤為突出。endprint