腦膠質(zhì)瘤組織中P—gp、MRP、BCRP的表達(dá)及臨床意義

侯亮+馮海利

[摘要] 目的 探討腦膠質(zhì)瘤組織中P-糖蛋白（P-gp）、多藥抗藥性相關(guān)蛋白（MRP）、乳腺癌耐藥相關(guān)蛋白（BCRP）的表達(dá)及臨床意義。 方法 選擇2007年7月～2016年7月于武安市第一人民醫(yī)院手術(shù)切除的腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本56例作為觀察組，同期腦外傷的正常腦組織10例作為對(duì)照組。應(yīng)用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)兩組標(biāo)本中的P-gp、MRP、BCRP表達(dá)情況，并分析其與腦膠質(zhì)瘤患者的臨床病理特征的關(guān)系。 結(jié)果 觀察組P-gp、MRP、BCRP陽(yáng)性表達(dá)率分別為42.86%（24/56）、76.79%（43/56）、46.43%（26/56），均明顯低于對(duì)照組的0.00%（0/10）、10.00%（1/10）、0.00%（0/10）（P < 0.01）。腦膠質(zhì)瘤組織P-gp、MRP、BCRP陽(yáng)性表達(dá)率與腫瘤病理分期、組織學(xué)分級(jí)有關(guān)，病理分期越高，P-gp、MRP、BCRP陽(yáng)性表達(dá)率越高；組織學(xué)分級(jí)越低，P-gp、MRP、BCRP陽(yáng)性表達(dá)率越高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。Spearman等級(jí)相關(guān)分析顯示，腦膠質(zhì)瘤組織P-gp陽(yáng)性表達(dá)率與MRP、BCRP陽(yáng)性表達(dá)率呈正相關(guān)（Rs = 0.612、0.537，P < 0.05）。 結(jié)論 腦膠質(zhì)瘤組織中P-gp、MRP、BCRP均呈高表達(dá)，其表達(dá)水平與腫瘤病理分期、組織學(xué)分級(jí)有關(guān)，且三者表達(dá)呈正相關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 腦膠質(zhì)瘤；P-糖蛋白；多藥抗藥性相關(guān)蛋白；乳腺癌耐藥相關(guān)蛋白；免疫組織化學(xué)法

[中圖分類(lèi)號(hào)] R739.41 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）12（b）-0012-04

[Abstract] Objective To investigate the expression and clinical significance of P- glycoprotein （P-gp）， multidrug resistance associated protein （MRP） and multidrug resistance associated protein （BCRP） in brain gliomas. Methods Fifty-six cases of brain glioma resected in the First People's Hospital of Wuan from July 2007 to July 2016 were selected as the observation group， and 10 normal brain tissues of brain trauma in the same period were selected as control group. The expressions of P-gp， MRP and BCRP in specimens of two groups were detected by immunohistochemistry （SP）， and the relationship between the expression and clinical pathological features of glioma was analyzed. Results The P-gp， MRP， BCRP positive expression rates of the observation group was 42.86% （24/56）， 76.79% （43/56）， 46.43% （26/56）， respectively， was significantly lower than the control group of 0% （0/10）， 10% （1/10）， 0% （0/10） （P < 0.01）. The positive rates of P-gp， MRP and BCRP in glioma was related to the pathological stage and histological grade of glioma， the higher the pathological stage， the higher the positive expression rate of P-gp， MRP and BCRP. The lower the histological grade， the higher the positive expression rates of P-gp， MRP and BCRP， and the differences were statistically significant （P < 0.01）. Spearman rank correlation analysis showed that the positive rate of P-gp expression in glioma tissues was positively correlated with the positive rates of MRP and BCRP （Rs = 0.612， 0.537， P < 0.05）. Conclusion The expressions of P-gp， MRP and BCRP are highly expressed in gliomas， and the expression level is related to the pathological stage and histological grade， and the three expressions are positively correlated.

[Key words] Brain glioma； P-glycoprotein； Multidrug resistance associated protein； Breast cancer resistance related protein； Immunohistochemistryendprint

腦膠質(zhì)瘤是臨床上最為常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)腫瘤之一，約占顱內(nèi)腫瘤的50%[1]。該病具有較高的發(fā)病率，且近年來(lái)發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)[2]。目前，臨床上對(duì)于腦膠質(zhì)瘤主要是采用手術(shù)治療，但由于腦膠質(zhì)瘤惡性程度較高，多呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，腫瘤邊界不明顯，僅通過(guò)手術(shù)治療難以達(dá)到完全切除的效果，術(shù)后常需要輔助化療、免疫治療等[3]。近年來(lái)，隨著腫瘤多藥耐藥性的發(fā)生，化療藥物敏感性逐漸下降，導(dǎo)致患者預(yù)后不良[4]。P-糖蛋白（P-gp）是多藥耐藥基因編碼的一種單鏈跨膜糖蛋白，與化療耐藥密切相關(guān)[5]。而多藥抗藥性相關(guān)蛋白（multidrug resistant proteins，MRP）和乳腺癌耐藥相關(guān)蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP）是目前已知的與化療耐藥相關(guān)的重要蛋白，不僅影響腦膠質(zhì)瘤化療效果，也可能與腫瘤惡性程度有關(guān)[6]。鑒于此，本研究探討腦膠質(zhì)瘤組織中P-gp、MRP、BCRP的表達(dá)及臨床意義，目的在于進(jìn)一步分析上述指標(biāo)與膠質(zhì)瘤的病理級(jí)別關(guān)系，從而為腦膠質(zhì)瘤的化療提供新的靶點(diǎn)與思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2007年7月～2016年7月武安市第一人民醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱(chēng)“我院”）手術(shù)切除并經(jīng)病理診斷確診的腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本56例，其中男32例，女24例；年齡20～72歲，平均（41.2±6.2）歲；根據(jù)Ann Arbor系統(tǒng)對(duì)所有患者進(jìn)行臨床病理分期：Ⅰ～Ⅱ期30例，Ⅲ～Ⅳ期26例；組織學(xué)分級(jí)：低分化19例，中、高分化37例。入選標(biāo)準(zhǔn)：①患者臨床資料完整；②本次就診為腦部疾病初次就診，術(shù)前未經(jīng)任何放化療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①同時(shí)患有其他系統(tǒng)腫瘤患者；②腎、肝功能異?；颊撸虎埏B內(nèi)退行性病變患者；④既往有神經(jīng)、精神系統(tǒng)疾病病史。同時(shí)選取同期因外傷切取的正常腦組織標(biāo)本10例作為對(duì)照組，其中男6例，女4例；年齡18～70歲，平均（36.75±5.35）歲。兩組性別、年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），有可比性。患者均簽署了知情同意書(shū)，本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑

P-gp小鼠抗人單克隆抗體，MRP小鼠抗人單克隆抗體，液體DAB酶底物顯色試劑盒，4%中性甲醛溶液以及SP-9002免疫組化試劑盒。上述試劑購(gòu)自廣州安必平醫(yī)藥科技股份有限公司。PBS緩沖液購(gòu)自北京武警總醫(yī)院病理實(shí)驗(yàn)室。

1.3 免疫組織化學(xué)SP法

所有標(biāo)本均經(jīng)5%福爾馬林固定、液體石蠟包埋，冷卻，制成4 μm厚度連續(xù)切片。并應(yīng)用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)兩組標(biāo)本中的P-gp、MRP、BCRP表達(dá)情況，具體方式如下：梯度酒精脫水，PBS緩沖液沖洗，高溫高壓抗原修復(fù)，PBS緩沖液沖洗，加入生物學(xué)一抗過(guò)夜，山羊血清封閉，加入生物學(xué)二抗，DAB顯色，梯度酒精水化，蘇木精復(fù)染，中性樹(shù)膠封片。具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。取已知P-gp、MRP陽(yáng)性切片為陽(yáng)性對(duì)照，以PBS替代一抗為陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

腦組織細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞膜內(nèi)存在棕黃色顆粒記為P-gp、MRP陽(yáng)性，隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野，視野中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占比<10%記為陰性，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占比≥10%記為陽(yáng)性[7]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，并應(yīng)用Speraman相關(guān)分析相關(guān)性，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組P-gp、MRP、BCRP表達(dá)情況比較

觀察組P-gp、MRP、BCRP陽(yáng)性表達(dá)率均明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。見(jiàn)表1。

2.2 腦膠質(zhì)瘤組織中P-gp陽(yáng)性表達(dá)率與患者病理特征關(guān)系分析

腦膠質(zhì)瘤組織中P-gp陽(yáng)性表達(dá)率與患者的性別、年齡無(wú)關(guān)（P > 0.05）；病理分期Ⅲ～Ⅳ期、組織學(xué)分級(jí)為低分化腦膠質(zhì)瘤患者的P-gp陽(yáng)性表達(dá)率均明顯高于病理分期為Ⅰ～Ⅱ期、組織學(xué)分級(jí)為中、高分化者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。見(jiàn)表2。

2.3 腦膠質(zhì)瘤組織中MRP陽(yáng)性表達(dá)率與患者病理特征關(guān)系分析

腦膠質(zhì)瘤組織中MRP陽(yáng)性表達(dá)率與患者的性別、年齡無(wú)關(guān)（P > 0.05）；病理分期為Ⅲ～Ⅳ期、組織學(xué)分級(jí)為低分化腦膠質(zhì)瘤患者的MRP陽(yáng)性表達(dá)率均明顯高于病理分期為Ⅰ～Ⅱ期、組織學(xué)分級(jí)為中、高分化患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。見(jiàn)表3。

2.4 腦膠質(zhì)瘤組織中BCRP陽(yáng)性表達(dá)率與患者病理特征關(guān)系分析

腦膠質(zhì)瘤組織中BCRP陽(yáng)性表達(dá)率與患者的性別、年齡無(wú)關(guān)（P > 0.05）；病理分期為Ⅲ～Ⅳ期、組織學(xué)分級(jí)為低分化腦膠質(zhì)瘤患者的BCRP陽(yáng)性表達(dá)率，均明顯高于病理分期為Ⅰ～Ⅱ期、組織學(xué)分級(jí)為中、高分化患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。見(jiàn)表4。

2.5 腦膠質(zhì)瘤組織中P-gp、MRP、BCRP表達(dá)的相關(guān)性

Spearman等級(jí)相關(guān)分析顯示，腦膠質(zhì)瘤組織P-gp陽(yáng)性表達(dá)率與MRP、BCRP陽(yáng)性表達(dá)率呈正相關(guān)（Rs = 0.612、0.537，P < 0.05）。

3 討論

腦膠質(zhì)瘤的發(fā)病率在所有顱內(nèi)腫瘤中位居首位，臨床主要采用手術(shù)治療[8]。但由于腦膠質(zhì)瘤惡性程度較高，僅通過(guò)手術(shù)治療難以達(dá)到根治效果，患者術(shù)后復(fù)發(fā)率較高，有研究報(bào)道顯示，腦膠質(zhì)瘤患者術(shù)后平均生存期為1年[9]。而術(shù)后化療在腦膠質(zhì)瘤的綜合治療過(guò)程中具有積極作用。近年來(lái)，隨著化療的廣泛應(yīng)用，腫瘤多藥耐藥發(fā)生率逐漸升高，化療敏感性降低，成為患者預(yù)后不良的重要原因。因此，如何有效提高化療效果是目前臨床上備受關(guān)注的熱點(diǎn)。分子生物學(xué)研究顯示[10-11]，腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中部分耐藥基因及其產(chǎn)物的表達(dá)水平是導(dǎo)致化療耐藥的主要機(jī)制。其中P-gp是多藥耐藥基因編碼的跨膜糖蛋白，可以通過(guò)外轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制將多種化療藥物泵出細(xì)胞外，降低化療敏感度[12]。而MRP則可以通過(guò)與化療藥物中的葡萄糖醛酸甙形成共軛化合物，降低化療敏感度[13]。BCRP屬于ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，則可以介導(dǎo)20多種化療藥物的耐藥[13]。以上三種分子可能影響腦膠質(zhì)瘤的生物學(xué)行為。endprint

本研究通過(guò)對(duì)腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本和正常腦組織比較發(fā)現(xiàn)，腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本P-gp、MRP、BCRP陽(yáng)性表達(dá)率均明顯高于正常腦組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這與Jeibmann等[14]的研究報(bào)道相一致，表明了腦膠質(zhì)瘤組織中P-gp、MRP、BCRP均呈高表達(dá)。此外，腦膠質(zhì)瘤患者病理分期為Ⅲ～Ⅳ期、組織學(xué)分級(jí)為低分化患者的P-gp、MRP、BCRP陽(yáng)性表達(dá)率均明顯高于病理分期為Ⅰ～Ⅱ期、組織學(xué)分級(jí)為中、高分化患者。證實(shí)了腦膠質(zhì)瘤組織P-gp、MRP、BCRP陽(yáng)性表達(dá)率與腫瘤病理分期、組織學(xué)分級(jí)有關(guān)。目前有研究報(bào)道顯示[15]，P-gp能夠泵出秋水仙堿、依托泊苷、長(zhǎng)春新堿等藥物；其可通過(guò)外排轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制將通過(guò)細(xì)胞膜的親脂性藥物泵出細(xì)胞外，從而降低化療藥物的作用效果。MRP不僅屬于能量泵之一，同時(shí)亦是谷胱甘肽偶合泵之一，可介導(dǎo)化療藥物中的葡萄糖醛酸甙共軛物、硫酸鹽共軛物以及谷胱甘肽硫共軛物排出細(xì)胞，進(jìn)一步引發(fā)耐藥的產(chǎn)生[16-17]。同時(shí)，MRP主要定位于細(xì)胞膜，參與了細(xì)胞質(zhì)內(nèi)囊泡的運(yùn)輸，進(jìn)一步導(dǎo)致藥物亞細(xì)胞分布的改變，從而促使化療藥物不能與其靶點(diǎn)結(jié)合，最終導(dǎo)致了耐藥的產(chǎn)生[18]。BCRP屬于ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族成員之一，作為細(xì)胞膜上的藥物排出泵，其能排出20多種細(xì)胞毒性藥物，從而對(duì)藥物作用產(chǎn)生極大的影響[19-20]。本研究結(jié)果進(jìn)一步表明，P-gp、MRP、BCRP可能在腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。同時(shí)，Spearman等級(jí)相關(guān)分析顯示，腦膠質(zhì)瘤組織P-gp陽(yáng)性表達(dá)率與MRP、BCRP陽(yáng)性表達(dá)率呈正相關(guān)。筆者推測(cè)P-gp、MRP、BCRP可能通過(guò)相互影響，從而促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和耐藥，其具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。本結(jié)果也提示臨床上可以通過(guò)對(duì)P-gp、MRP、BCRP干預(yù)，降低化療的耐藥性，為人腦膠質(zhì)瘤的化療提供新的方法，也為抗腫瘤藥物的研制提供了新思路。

綜上所述，腦膠質(zhì)瘤組織中P-gp、MRP、BCRP均呈高表達(dá)，臨床上可通過(guò)對(duì)上述三項(xiàng)指標(biāo)表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，從而為腦膠質(zhì)瘤患者的診斷、治療以及預(yù)后評(píng)估提供參考依據(jù)。

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（收稿日期：2017-10-19 本文編輯：任 念）endprint