非致死劑量的四溴雙酚A脅迫下蚯蚓的生長和抗氧化防御反應(yīng)

史雅靜，徐曉宇，王宇，韓雪松，李田春，王玉榮，史雅娟

1. 遼寧科技學院生物醫(yī)藥與化學工程學院 遼寧省生物醫(yī)藥與化學工程重點實驗室, 本溪 117004 2. 中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心 城市與區(qū)域生態(tài)國家重點實驗室，北京 100085

四溴雙酚A(tetrabromobisphenol A, TBBPA)是常用的溴化阻燃劑之一，被廣泛用于聚苯乙烯泡沫、電子產(chǎn)品和ABS樹脂等領(lǐng)域中[1]。由于TBBPA可通過制造業(yè)以及各種紡織和材料的處理或循環(huán)利用釋放到環(huán)境中，并且具有遷移性、蓄積性和持久性等特點[2]。TBBPA在空氣、土壤、水體底泥等多種環(huán)境介質(zhì)、海鳥和魚體內(nèi)、甚至人體血液和母乳生物樣品中存在[3-9]。TBBPA不僅在環(huán)境中能長期殘留，而且可以通過食物鏈和其他途徑在人體內(nèi)富集，長期接觸會妨礙大腦和骨骼的發(fā)育，并且可能致癌[10-12]，因此引起日益廣泛的關(guān)注。

利用蚯蚓作為研究污染物對土壤生物影響的指示生物，可以間接反映環(huán)境中污染物的污染強度。經(jīng)濟合作與發(fā)展組織(OECD)等機構(gòu)已將蚯蚓(赤子愛勝蚓)作為標準試驗動物。蚯蚓體內(nèi)多種酶系能夠被污染物誘導或激活，可在生化水平上對污染暴露做出敏感響應(yīng)[13-15]。近幾年，國內(nèi)外關(guān)于TBBPA對水生生物毒性的研究報道頗多[16-21]，但以土壤生態(tài)系統(tǒng)中的生物進行的毒理研究尚少，其中以蚯蚓作為模式生物進行毒理研究的，多數(shù)是采用濾紙接觸法和人工土壤法并且以急性暴露(48 h 或14 d)為主[22],而污染物對蚯蚓的亞急性(28 d)、慢性毒性(56 d以上)，因具有較好的生態(tài)相關(guān)性，且測試終點比急性的終點要敏感，而受到關(guān)注[23-24]。采用自然土壤法模擬蚯蚓生活的真實環(huán)境, 可比較真實地反映污染物在自然環(huán)境中對生物的實際影響，更好地對污染地區(qū)進行環(huán)境安全評價。

本實驗采用自然土壤暴露法，通過非致死劑量的TBBPA對蚯蚓的急性、亞急性暴露試驗，以蚯蚓的生長抑制率、體內(nèi)蛋白質(zhì)含量和抗氧化酶活性(SOD、GST)的反應(yīng)變化，來揭示TBBPA的生態(tài)生理毒性，為TBBPA土壤生態(tài)風險評估提供科學依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 供試生物、化學品和土壤

赤子愛勝蚓(Eiseniafetida)購自沈陽尊龍生物技術(shù)有限公司。選用2～3月齡，體重0.35～0.45 g，生殖帶明顯且無損傷的成熟個體。實驗前用去離子水進行清洗。

四溴雙酚A(TBBPA)(CAS No.79-94-7), 純度為98%，購自梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司(中國)。

供試清潔自然土壤采自山東省濰坊市荒地，實驗前，對土壤進行風干，過10目篩。經(jīng)測定該土壤樣品pH值為8.68，有機質(zhì)含量1.08%，全N為0.03%,TBBPA未檢出，重金屬含量低于國家土壤環(huán)境質(zhì)量一級標準。

1.2 暴露方法

蚯蚓暴露于添加不同濃度TBBPA的清潔自然土壤中，將一定量的TBBPA溶于少量丙酮并均勻拌入土壤中，TBBPA濃度梯度根據(jù)預(yù)實驗所確定的非致死劑量設(shè)定，各處理TBBPA含量依次為：0、50、100、400 mg·kg-1(以干重計，下同)，用去離子水調(diào)節(jié)土壤濕度為25%，置于通風廚中使丙酮完全揮發(fā)干凈。

暴露方法參照人工土壤標準暴露法(OECD Guideline No.207)[25]并加以適當修改。暴露試驗前，赤子愛勝蚓在供試清潔土壤中馴養(yǎng)24 h，用去離子水清洗干凈后置于放有潮濕濾紙的培養(yǎng)皿中(黑暗環(huán)境、(20 ± 1) ℃、24 h)，去除消化系統(tǒng)內(nèi)容物。隨機挑選10條蚯蚓放入裝有750 g濕土的1 000 mL燒杯中，放置于人工氣候箱?？刂茥l件為：溫度(20±1) ℃，相對濕度80%～85%，24 h連續(xù)光照，光照強度400～800 lux。試驗包括急性期(0～14 d)和亞急性期(15～28 d)2個階段，分別在4、7、14、21、28 d進行稱重。在14 d、28 d時從每個重復(fù)中隨機挑選蚯蚓2條，進行蛋白含量和酶活性測定。設(shè)空白(CK，僅加水)和溶劑空白(CKs，丙酮含量為0.02%)對照組。每個處理4個重復(fù)。

1.3 生長抑制率測定

將暴露于不同劑量TBBPA中，第4、7、14、21和28 天的蚯蚓平均體重與其在試驗開始時的平均體重相比較，采用公式In=(W0-Wt)×100%/W0計算生長抑制率[26]，其中，In是不同處理的蚯蚓的生長抑制率，W0是試驗開始時蚯蚓的平均體重(mg)，Wt是第t天蚯蚓的平均體重(mg)。

1.4 蛋白質(zhì)含量和酶活性測定

1.4.1 粗酶液制備

將經(jīng)過染毒處理的蚯蚓，洗凈，稱重，低溫勻漿，在4 ℃下以4 000 r·min-1離心30 min，取上清液按1:4(V:V)稀釋后，用于蛋白質(zhì)含量、GST酶活性、SOD酶活性測定。

1.4.2 蛋白質(zhì)含量與酶活性測定方法

蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍方法測定[27]，使用牛血清蛋白作為參考標準蛋白，以595 nm下的吸光度值計算蛋白含量，單位為mg。GST酶活性測定參考文獻[28-29]中的方法，以340 nm下吸光度值計算酶活性，單位為nmol·min-1·mg-1pro(以protein計)；超氧化物歧化酶(SOD)活性測定，采用氮藍四唑法[30]，以560 nm下的吸光度值計算酶活性，單位為U·mg-1pro，以50%抑制率的酶量為一個酶活力單位。

1.5 數(shù)據(jù)處理

在滿足正態(tài)分布或?qū)?shù)正態(tài)分布(Shapiro-Wilk test)和方差齊次(Levene’s test)的前提下，采用單因素方差分析(ANOVA)，多重比較采用LSD，與對照比較時P<0.05為顯著性差異。所有統(tǒng)計均采用SPSS18.0軟件完成。

2 結(jié)果(Results)

2.1 TBBPA對蚯蚓生長的抑制

赤子愛勝蚓暴露于TBBPA后的4 d、7 d、10 d、14 d、21 d、28 d的生長抑制率如圖1所示。統(tǒng)計分析顯示對照空白(CK)和溶劑空白(CKs)之間并沒有顯著差異，說明經(jīng)過揮發(fā)后的殘余丙酮對赤子愛勝蚓并沒有產(chǎn)生影響。隨著暴露時間的延長，空白對照(CK)的生長抑制率表現(xiàn)上升的趨勢，可能是由于土壤中營養(yǎng)物質(zhì)的消耗而造成營養(yǎng)不足，以致體重下降。

TBBPA暴露急性期(0～14 d)，隨著TBBPA濃度增大，蚯蚓生長抑制率增大并在400 mg·kg-1處理組達到最大(21.48%)。TBBPA暴露的亞急性期(14～28 d)也有相同的規(guī)律。相同的TBBPA暴露濃度，隨著TBBPA暴露時間增長，蚯蚓生長抑制率逐漸增大且均在28 d時達到最大，28 d的400 mg·kg-1處理組的生長抑制率最大(33.02%)。經(jīng)檢驗，5次生長抑制率數(shù)據(jù)滿足進行方差分析的前提條件，所以采用方差分析法來分析不同濃度處理之間差異的顯著性，結(jié)果表明在0～14 d 的急性試驗期間TBBPA對蚯蚓的生長抑制情況均存在顯著的劑量效應(yīng)關(guān)系，而在亞急性暴露期(14～28 d)各處理的生長抑制率不具有顯著性差異。(4 d:F=4.708,P= 0.014；7 d:F=3.954,P= 0.026；14 d:F=10.037,P= 0.001；21 d:F=2.469,P=0.112；28 d:F=21.743，P=0.217)。多重比較(LSD test)進一步表明了在各暴露時期高濃度(400 mg·kg-1)處理組與空白和其他濃度組相比都顯著抑制蚯蚓的生長(P<0.05)。

2.2 TBBPA對蚯蚓體內(nèi)蛋白含量影響

TBBPA對蚯蚓體內(nèi)蛋白含量影響如圖2所示，TBBPA暴露急性期(14 d)，蚯蚓體內(nèi)的蛋白含量在對照組水平上下波動, ANOVA 分析表明蚯蚓體內(nèi)蛋白含量在各處理間不存在顯著性差異(P=0.712)。進入TBBPA暴露的亞急性期(28 d)，蚯蚓體內(nèi)的蛋白質(zhì)含量，在50 mg·kg-1染毒組減少，然后隨著TBBPA濃度的增加而增加，并且到400 mg·kg-1染毒組時達到最大值，方差分析表明處理組之間存在顯著性差異(P=0.039)。

圖1 不同濃度的四溴雙酚A(TBBPA)對蚯蚓的生長抑制率Fig. 1 Growth inhibition rates of earthworms exposed to tetrabromobisphenol A (TBBPA) at different concentrations

圖2 不同濃度的TBBPA對蚯蚓體內(nèi)蛋白質(zhì)含量影響Fig. 2 Effects of TBBPA at different concentrations on protein contents of earthworms

圖3 不同濃度的TBBPA對蚯蚓體內(nèi)SOD酶活力的影響Fig. 3 Effects of TBBPA at different concentrations on SOD activities of earthworms

圖4 不同濃度的TBBPA對蚯蚓體內(nèi)GST酶活力的影響Fig. 4 Effects of TBBPA at different concentrations on GST activities of earthworms

2.3 TBBPA對蚯蚓體內(nèi)SOD酶活性的影響

TBBPA對赤子愛勝蚓SOD酶活性的影響如圖3所示。TBBPA暴露急性期(14 d)，數(shù)據(jù)分析顯示對照(CK)和溶劑空白(CKs)之間SOD酶活性并沒有顯著差異，所有TBBPA染毒組SOD酶活力均顯著高于空白對照組，其中在50 mg·kg-1處理組顯著高于中、高濃度(100 mg·kg-1、400 mg·kg-1)處理組，隨著濃度增加，SOD酶活略有下降，但都高于對照組。

隨著暴露時間的延長，空白對照(CK)和溶劑空白(CKs)的SOD酶活性有所升高。TBBPA暴露亞急性期(28 d)，各染毒組蚯蚓體內(nèi)SOD 酶活性與對照組之間仍具有顯著性差異(ANOVA,P=0.029)。低、中濃度(50 mg·kg-1、100 mg·kg-1)處理組與空白對照沒有顯著性差異，但高濃度400 mg·kg-1處理組SOD酶活性顯著升高(LSD檢驗，P<0.05)。

2.4 TBBPA對GST酶活性的影響

TBBPA對赤子愛勝蚓GST酶活性的影響如圖4所示。TBBPA暴露急性期(14 d)，統(tǒng)計分析顯示對照空白(CK)和溶劑空白(CKs)與低濃度染毒組(50 mg·kg-1)之間GST酶活性并沒有顯著差異，100 mg·kg-1染毒組開始有上升趨勢，直到400 mg·kg-1組GST酶活性才出現(xiàn)顯著誘導效應(yīng)(ANOVA,P=0.039)。TBBPA暴露亞急性期(28 d)，各處理組GST酶活性與對照無顯著差異(ANOVA，P=0.428)。

3 討論(Discussion)

傳統(tǒng)的蚯蚓生態(tài)毒理學研究多采用標準的濾紙接觸法或人工土壤法。濾紙接觸法暴露時間短(24～48 h)，可對受試物毒性進行初篩，初步了解蚯蚓的潛在毒性，但僅反映了化學品經(jīng)皮膚暴露一種途徑對蚯蚓的影響，很難評估其對蚯蚓的真實影響。人工土壤法可較好地模擬蚯蚓生活的真實環(huán)境，能夠體現(xiàn)皮膚、消化道2種暴露途徑的影響，但由于實驗導則中沒有就人工土中有機質(zhì)含量進行明確規(guī)定，不同批次土實驗中有機質(zhì)含量常有一定差異[31]，從而降低了各批次人工土壤法實驗之間的可比性；而且自然土壤有很多未知因素，污染物也是長期存在的[32]，自然土壤性質(zhì)和結(jié)構(gòu)與人工土壤仍有一定差異，對污染物的毒性均有較大影響，采用人工土壤暴露的結(jié)果表征污染物的生態(tài)風險可能會有較大的誤差。TBBPA作為類似于“POPs”的潛在環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，目前還缺乏自然土壤生態(tài)環(huán)境的急性、亞急性毒性數(shù)據(jù)，因此本文采用自然土壤法進行TBBPA毒性暴露實驗所獲得的數(shù)據(jù)可以作為一種補充和參考，以更好地對污染地區(qū)進行環(huán)境安全評價。

本文研究了非致死劑量的TBBPA經(jīng)急性和亞急性暴露對赤子愛勝蚓生長、蛋白質(zhì)含量和抗氧化酶活性的影響。采用非致死劑量在亞急性試驗條件下進行暴露，更能反映出蚯蚓在接近真實環(huán)境中毒性反應(yīng)[26]。非致死濃度梯度是根據(jù)急性試驗得到半致死濃度而確定的，確保蚯蚓在整個試驗過程中無死亡或死亡率低于10%，本試驗的死亡率低于10%符合OECD標準。

生物量變化是聯(lián)系化學脅迫、化學效應(yīng)與能量動態(tài)變化的[33]。CK和CKs組蚯蚓在實驗前期(0～7 d)的生長抑制率均為負值，在14 d的生長抑制率也低于10%，表示蚯蚓在此條件下可以正常生長；CK和CKs組在亞急性期的生長抑制率增加，體重下降可能因為亞急性試驗過程中只依靠自然土壤中營養(yǎng)物質(zhì)，其不足以滿足蚯蚓生長的需要，因此，在亞急性期時，可以適當增加有機質(zhì)以補充營養(yǎng)物質(zhì)的不足。

在試驗范圍內(nèi)，急性期間，TBBPA沒有使蚯蚓死亡，卻顯著抑制蚯蚓生長，隨著TBBPA暴露濃度增大，暴露時間延長，生長抑制率逐漸增大；進入亞急性期時，受到TBBPA脅迫的蚯蚓體重進一步下降，生長抑制率持續(xù)增大，與空白對照之間不具有顯著性差異，此時蚯蚓體重的下降可能更多的是受土壤營養(yǎng)物質(zhì)缺乏的影響。實際上蚯蚓受TBBPA脅迫而體重下降是一個綜合過程，蚯蚓持續(xù)受到TBBPA脅迫時，會減少食物的攝取，TBBPA的吸收隨之減少，同時攝入體內(nèi)的有限能量更多地應(yīng)用于解毒過程的代謝消耗，而對影響蚯蚓存活的非必要功能如生長、繁殖功能則受到抑制，導致體重下降[26]。

在TBBPA暴露急性期(14 d)，蚯蚓蛋白質(zhì)含量與空白對照無顯著性差異。這可能是由于TBBPA在微生物的作用下部分降解，蚯蚓表現(xiàn)出一定的適應(yīng)性，而此時影響蛋白質(zhì)含量的主要是腸組織，其吸收得比較少，所以蛋白質(zhì)含量僅在空白組水平上下波動，基本上沒有變化。然而進入TBBPA暴露亞急性期時(28 d)，蚯蚓蛋白含量在低濃度組顯著減少，后逐漸增加，在TBBPA 400 mg·kg-1時達到最大值。這種變化規(guī)律可能是由于蚯蚓暴露在TBBPA中，低濃度TBBPA的長時間刺激，使蚯蚓做出反應(yīng)相對較少，體內(nèi)蛋白質(zhì)含量有所減少，但當隨著TBBPA濃度的增加到一定程度，并長時間刺激以后，且土壤中的TBBPA降解產(chǎn)物的毒性比較大[9, 34]，在大分子TBBPA和其小分子降解產(chǎn)物對蚯蚓的共同作用下，并且相當一部分產(chǎn)物被腸組織吸收，吸收量比較大，使得腸組織會做出相應(yīng)的反應(yīng)，刺激體內(nèi)的蛋白質(zhì)和酶分泌增加，以緩解外來刺激作用。蚯蚓面對外來刺激做出相應(yīng)的反應(yīng)，體壁組織和腸組織分泌的蛋白質(zhì)和一些酶會增加，從而起到自我保護的作用[32]。

已有的TBBPA對蚯蚓毒性效應(yīng)的研究顯示，TBBPA對蚯蚓抗氧化酶活性具有誘導效應(yīng)[35]。SOD催化超氧陰離子自由基變成過氧化氫和氧氣。在本研究中TBBPA暴露急性期(14 d)，各染毒組與對照空白組相比均有顯著差異，并且SOD酶活性在染毒組50 mg·kg-1達到最大值(P<0.01)。一般認為，當蚯蚓受到輕度環(huán)境脅迫時，體內(nèi)SOD酶活性往往有所提高，而當受到重度逆境脅迫時，SOD酶活性通常下降[33, 36]。這與利用人工土壤研究TBBPA對蚯蚓SOD基因表達,證明低濃度TBBPA對SOD基因表達水平有誘導效應(yīng)的結(jié)果[33]相一致。進入TBBPA暴露亞急性期時，蚯蚓體內(nèi)的SOD酶活性隨著TBBPA的增加，總體上表現(xiàn)為上升的趨勢。在TBBPA脅迫損害下，破壞蚯蚓體內(nèi)的代謝平衡，引起代謝產(chǎn)物的積累，并產(chǎn)生過量的能產(chǎn)生氧化損傷的活性氧等有害物質(zhì)。因此蚯蚓通過啟動防御系統(tǒng)如誘導SOD酶活性來抵御和清除這些物質(zhì)，以保持機體內(nèi)部動態(tài)穩(wěn)定平衡。

GST催化谷胱甘肽和外源親電子基團結(jié)合并將產(chǎn)物移出體外。與對照組相比，400 mg·kg-1染毒組中GST活性基因表達量出現(xiàn)明顯誘導的現(xiàn)象[33]。我們可以推斷蚯蚓暴露在含有400 mg·kg-1TBBPA的土壤中，被誘導產(chǎn)生大量谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶來應(yīng)對氧化脅迫。進入TBBPA暴露亞急性期時，染毒組與空白對照GST酶活性無顯著性差異，表明TBBPA毒性超過了蚯蚓的耐受范圍，對蚯蚓的機體造成了一定損傷。

本實驗中，TBBPA對蚯蚓的生長抑制情況，在急性試驗中均存在顯著的劑量效應(yīng)關(guān)系，而在亞急性暴露期， 400 mg·kg-1時被顯著抑制蚯蚓的生長(P<0.05)；TBBPA對蚯蚓體內(nèi)蛋白含量影響，在急性試驗中各處理間差異不顯著(P=0.712)，進入亞急性期蛋白質(zhì)含量在400 mg·kg-1時被顯著誘導(P=0.039，P<0.05)；TBBPA對蚯蚓SOD酶活性的影響，在急性試驗中50 mg·kg-1時被顯著誘導(P<0.01)，在亞急性試驗中400 mg·kg-1時SOD酶活性顯著升高(P<0.05)；TBBPA對蚯蚓GST酶活性，在急性試驗中400 mg·kg-1時呈現(xiàn)顯著誘導效應(yīng)(P<0.05)，在亞急性期各處理間差異不顯著(P=0.428)。蚯蚓生長抑制率、蛋白質(zhì)含量、體內(nèi)各生化酶系對TBBPA暴露的時間效應(yīng)和劑量效應(yīng)的敏感性存在不同程度差異，因而在土壤污染生態(tài)毒性診斷時，應(yīng)依據(jù)污染暴露指示的有效性和敏感性選擇多時間段檢測和多指標聯(lián)合診斷。

土壤性質(zhì)對污染物在土壤中的毒性程度具有重要影響。土壤有機質(zhì)含量與疏水性有機物在土壤中的生物有效性密切相關(guān)，因而土壤有機質(zhì)是對有機污染物在土壤中毒性影響的最重要因素，也是將人工土毒性實驗結(jié)果外推到自然土中的重要依據(jù)[37-39]，但含水量、土壤pH值和微生物活性等對污染物在土壤中的毒性也具有一定影響[39-42]。污染物在自然和人工土中具有不同的行為和生物可利用性[38, 43-45]，因而對土壤生物表現(xiàn)出不同的毒性，例如苯敵草在有機質(zhì)含量高的人工土中吸附性強，對線蚓在人工土中的存活率和繁殖率都比在自然土中高[41]；而重金屬Zn在人工土中比在自然土壤的毒性強10倍，是由于人工土中的生物可利用性強[46]；DDT在有機質(zhì)含量相當?shù)淖匀煌梁腿斯ね翆︱球敬婊畹亩拘圆町惤咏?倍[47]，因而采用土壤有機質(zhì)含量作為在自然土和人工土中外推的唯一標準常常引起較大偏差。

目前尚缺乏TBBPA在人工土和不同自然土壤中對蚯蚓的毒性的全面對比研究。本研究中TBBPA在自然土中經(jīng)14 d暴露后對蚯蚓的生長抑制作用與有關(guān)人工土中TBBPA對蚯蚓生長抑制程度[33]相當，上述2個研究其他暴露條件相似，所用實驗介質(zhì)的差異在于本研究所用的自然土壤有機質(zhì)含量(1.08%)僅為人工土中的1/3，而偏堿性(pH值為8.68)土壤與中性的人工土差異較大。二者土壤性質(zhì)差異較大但毒性卻相當，說明土壤有機質(zhì)含量和土壤酸堿性對TBBPA在土壤中的毒性具有一定影響，土壤有機質(zhì)含量作為TBBPA在自然土和人工土中外推的唯一標準將會引起偏差。

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