小麥耐Cu性綜合評價及其谷胱甘肽相關(guān)酶活性差異研究

張黛靜，劉雪晴，劉安琪，馬建輝，楊惠荔，陳倩青，李春喜

河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007

銅（Cu）是植物生長發(fā)育必需的微量營養(yǎng)元素，是一些調(diào)控蛋白和氧化酶的組成元素（Guerrero，2005），廣泛參與各種代謝過程（Harrison et al.，1999），而適合植物生長的 Cu含量范圍很窄，過量的Cu會造成毒害（Polle et al.，2004），使植物根尖細(xì)胞核核質(zhì)解體、核空泡化，細(xì)胞功能喪失（王萍萍等，2007），影響根系活力，致使根系生理機能降低；此外，過量的 Cu還可以使植物體內(nèi)積累等一系列活性氧（ROS）（Schützendübel et al.，2002）。

植物受重金屬脅迫后，會啟動體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)清除過量的ROS，從而保持機體內(nèi)ROS代謝平衡（P?tsikk? et al.，2002）。還原型谷胱甘肽（GSH）是植物抗氧化系統(tǒng)中重要的非酶類抗氧化劑，不僅能夠清除過量的ROS（Noctor et al.，2002），而且也是植物螯合肽（PC）的前體，能螯合細(xì)胞內(nèi)游離的 Cu離子并將其轉(zhuǎn)運至液泡后排出體外，從而降低重金屬Cu的毒害作用（Rauser，1990）。谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（GSTs）作為一種多功能酶，參與GSH與有毒物質(zhì)的結(jié)合與轉(zhuǎn)運（Marrs，1996），GSTs不僅能催化 GSH與底物結(jié)合，與次生代謝產(chǎn)物相互作用，而且還具有 GSH依賴的谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）活性（張雪等，2017），在植物中有高達(dá) 90個基因編碼，可在重金屬誘導(dǎo)下表達(dá)（Chi et al.，2010；Moons，2003）。谷胱甘肽還原酶（GR）通過抗壞血酸-谷胱甘肽（ASA-GSH）循環(huán)途徑清除過量的 ROS，有研究發(fā)現(xiàn)植物在遭受Cu（王松華等，2011）、鉛（Pb）（楊志娟等，2015）、鎘（Cd）（馬曉麗等，2017）脅迫后，GR活性顯著增強，且抗性品種的GR活性高于其敏感性品種（丁順華，2006）。GSH-PX作為一種含巰基的過氧化物酶，在清除機體內(nèi)的H2O2、有機氫過氧化物和脂質(zhì)過氧化物過程中扮演重要角色（Mittler，2002；Margis et al.，2008）。

小麥（Triticum aestivum L.）作為世界上重要的谷物之一，近年來關(guān)于重金屬 Cu對小麥的影響多集中于其生理生化（Gajewska et al.，2013）及基因表達(dá)差異（Li et al.，2014）方面，而關(guān)于小麥品種對重金屬耐性評價的研究多集中于Cd（慈敦偉等，2011）、Pb（孫洪欣等，2015）、Al（林咸永，2002），對小麥耐 Cu性評價的研究卻較少。有研究證實，小麥幼苗在30 mg·L-1Cu2+處理下會受到脅迫（董敬娜等，2011；張黛靜等，2014）。本研究采用統(tǒng)計分析和綜合評價法，比較不同品種小麥耐 Cu性差異，以期篩選出耐 Cu性差異較大的品種，進(jìn)而分析其幼根谷胱甘肽相關(guān)酶的響應(yīng)差異，為進(jìn)一步研究其抗氧化機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及其培養(yǎng)

表1 Cu脅迫下37個小麥品種的相對性狀平均值Table 1 The mean value of relative traits of 37 wheat cultivars under Cu stress

1.2 測定指標(biāo)及方法

1.2.1 株高與根長

隨機選取小麥幼苗30株測量其株高（cm）、根長（cm）。

1.2.2 根系形態(tài)

運用根系掃描儀（Epson V700），結(jié)合分析軟件（WinRhizo），測量根系的總長度、總體積和總表面積。

1.2.3 根系活力

采用本實驗室改良的氯化三苯基四氮唑（TTC）法測定（張志良等，2003）。

1.2.4 GSTs、GR和GSH-PX活力

特殊配合力(SCA)指一個親本在與另一親本所產(chǎn)生雜交組合的性狀表現(xiàn)中偏離兩親本平均效應(yīng)的特殊效應(yīng)。將SCA效應(yīng)值按正向、負(fù)向進(jìn)行組合歸類，從表4看出，各性狀的SCA效應(yīng)值為正向和負(fù)向的雜交組合個數(shù)相當(dāng)，正向、負(fù)向效應(yīng)值變幅較大。

取0.2 g幼根鮮樣，加入0.8 mL預(yù)冷的0.1 mol?L-1PBS（pH 6.5），冰浴研磨，低溫離心 15 min后參照胡延玲等（2009）的試驗方法測定 3種酶活力。

1.2.5 Cu耐性鑒定指標(biāo)的篩選和Cu耐性綜合評價

參照孫小芳等（2001）、陳仲英等（2016）的指標(biāo)篩選方法，將各指標(biāo)值換算成相對值（處理值/對照值），采用模糊數(shù)學(xué)隸屬函數(shù)法計算各個指標(biāo)的隸屬度值、平均隸屬度值，根據(jù)平均隸屬度值大小進(jìn)行聚類分析，綜合評價小麥的耐Cu性。

隸屬度值計算公式（楊梅等，2012）：

式中，Xj表示用于隸屬函數(shù)分析的第j個指標(biāo)；Xjmax與_Xjmin分別表示第 j個指標(biāo)的最大值和最小值，表示平均隸屬度值。

1.3 數(shù)據(jù)分析

運用 Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)整理并計算隸屬度值，SPSS 22.0統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行Pearson相關(guān)分析和中位數(shù)聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cu脅迫下不同品種小麥幼根生長生理差異分析

以各個指標(biāo)的相對值反映品種耐性，可以比較不同性狀間的差異。由表1可知，Rvr相對于其他指標(biāo)變幅較大，最大值是3.91，與最小值相差3.78，且品種間差異顯著（P＜0.01）；Rv變化幅度較小，品種間差異顯著（P＜0.01）。此外，不同指標(biāo)在相同品種中變化規(guī)律存在差異，比如西農(nóng)979 Rvr小于1，其他指標(biāo)相對值均大于1。綜上可知，用任何單一指標(biāo)的變化判斷小麥的耐 Cu性，缺乏準(zhǔn)確性、全面性。

分析結(jié)果表明，6個指標(biāo)間存在一定的相關(guān)性（表 2）。其中，Rrl與 Rtrl、Rrsa呈極顯著正相關(guān)；Rph分別與Rtrl和Rv、Rrsa呈極顯著或顯著正相關(guān)，而與Rvr呈顯著負(fù)相關(guān)；Rvr與Rv存在顯著負(fù)相關(guān)；Rtrl與Rv、Rrsa呈極顯著正相關(guān)。

表2 37個小麥品種各相對性狀值的相關(guān)系數(shù)Table 2 Correlation matrixes of each relative character values of different wheat cultivars

2.2 Cu脅迫下不同品種小麥耐Cu性的綜合評價

圖1 37個小麥品種平均隸屬度值聚類分析圖Fig. 1 Clustering chart of value of average membership degree of 37 wheat varieties

平均隸屬度值的大小反映了品種耐性的強弱。采用中位數(shù)聚類分析法將37個品種分為3類（圖1，表3）：（Ⅰ）強耐Cu型，包括良星99、科農(nóng)9204、濟(jì)麥22等7個品種，即耐Cu能力排名前7的品種；（Ⅱ）中等耐Cu型，由花培8號、揚富麥101、煙農(nóng)19、石農(nóng)086等22個品種組成，耐Cu能力排名在8～29之間；（Ⅲ）弱耐Cu型，包括西農(nóng)979、洛麥23、懷川916在內(nèi)的8個品種，耐Cu能力排名在30～37之內(nèi)。

表3 37個小麥品種的耐Cu性綜合評價Table 3 Comprehensive evaluation results of Cu resistance of 37 wheat varieties

2.3 Cu脅迫下不同耐性品種的谷胱甘肽相關(guān)酶活性差異分析

2.3.1 Cu脅迫下不同耐性品種的 GSTs活性差異分析

基于以上試驗結(jié)果，選擇強耐Cu型品種（濟(jì)麥22、科農(nóng)9204）和弱耐Cu型品種（西農(nóng)979、洛麥23）各兩個，測定根系GSTs、GR及GSH-PX活力，比較這3種酶在4個品種間的活性。從圖2可知，CK處理下，4個品種的GSTs都表現(xiàn)較高的活性，GSTs活力在西農(nóng) 979幼根中高達(dá) 1108.92 U?g-1，顯著高于其他3個品種（P＜0.05）。Cu脅迫96 h后，洛麥23的GSTs被誘導(dǎo)，顯著高于其對照處理（P＜0.05），并與其他 3個品種呈顯著差異（P＜0.05）。濟(jì)麥22、科農(nóng)9204和西農(nóng)979受Cu脅迫后GSTs活力略降低，科農(nóng)9204幼根中GSTs活力低至 874.89 U?g-1，顯著低于其他 3個品種（P＜0.05）。

2.3.2 Cu脅迫下不同耐性品種的GR活性差異分析

由圖3可知，CK處理下，4個品種幼根的GR活力相對較低，西農(nóng) 979顯著低于其他 3個品種（P＜0.05）。Cu脅迫下，濟(jì)麥22 GR活力達(dá)到2.31 U?g-1，顯著高于其對照處理（P＜0.05），與其他 3個小麥品種達(dá)顯著性差異（P＜0.05）。與CK相比，Cu脅迫下濟(jì)麥22的GR活性顯著升高，但其他品種均有不同程度的下降（P＜0.05），且僅科農(nóng)9204與對照差異不顯著（P＜0.05）。

圖2 Cu對4個小麥品種幼根GSTs活力的影響Fig. 2 Effects of Cu stress on the activity of GSTs in young roots of four wheat cultivars

圖3 Cu對4個小麥品種幼根GR活力的影響Fig. 3 Effects of Cu stress on the activity of GR in young roots of four wheat cultivars

2.3.3 Cu脅迫下不同耐性品種的GSH-PX活性差異分析

由圖4知，CK處理下，洛麥23根部GSH-PX活力為 55.38 U?g-1，顯著低于其他 3個品種（P＜0.05），西農(nóng)979活力最大，且與其他3個品種差異顯著（P＜0.05）。Cu脅迫下，濟(jì)麥 22、科農(nóng)9204和西農(nóng)979的GSH-PX活性相比CK呈升高趨勢，濟(jì)麥 22和西農(nóng) 979的 GSH-PX活力分別為1198.50 U?g-1和 1209.33 U?g-1，均與其他 2 個品種達(dá)顯著差異（P＜0.05），且濟(jì)麥 22的 GSH-PX活力顯著高于其對照處理（P＜0.05）。

圖4 Cu對4個小麥品種幼根GSH-PX活力的影響Fig. 4 Effects of Cu stress on the activity of GSH-PX in young roots of four wheat cultivars

3 討論

3.1 小麥耐Cu性鑒定指標(biāo)的篩選及綜合評價方法

作物的耐重金屬性（陳仲英等，2016）與抗旱性（張龍龍等，2016）、抗寒性（徐瀾等，2015）都屬于復(fù)雜的生物性狀，由一系列因素共同決定，是基因與環(huán)境的綜合表現(xiàn)，所以綜合多個生長和生理指標(biāo)更能全面、準(zhǔn)確地評價小麥的耐 Cu性。在評價方法中，隸屬函數(shù)法被廣泛用于評價植物的抗旱性（李春喜等，2016）、抗寒性（張志偉等，2012）和耐重金屬性（陳仲英等，2016；Ci et al.，2011），隸屬度值是與品種耐性相關(guān)的生長生理指標(biāo)綜合的結(jié)果，較準(zhǔn)確地反映品種間的耐性差異（姜麗娜等，2014）。聚類分析法能在未知分類數(shù)情況下對參試品種進(jìn)行客觀精確的分類，對品種耐性的劃分具有較好的應(yīng)用價值（許紅等，2014）。本研究結(jié)合隸屬函數(shù)法、聚類分析法以及耐 Cu能力排名相對客觀精準(zhǔn)地將37個小麥品種聚為3類。

3.2 重金屬Cu對小麥GSTs、GR和GSH-PX活性的影響

本研究依據(jù)耐 Cu能力排名選擇耐性強弱不同的4個品種，研究GSTs、GR和GSH-PX這3個酶在小麥?zhǔn)蹸u脅迫后的活性變化規(guī)律。GSTs在植物抵御逆境過程中具有重要作用，當(dāng)植物遭受重金屬（Mokgalaka-Matlala et al.，2009）、低溫（趙鳳云等，2006）、干旱（邱宗波等，2008）和紫外線（劉新仿等，2002）等脅迫后，其活性被誘導(dǎo)，催化GSH與有毒物質(zhì)的結(jié)合并轉(zhuǎn)運至液泡排出體外，從而達(dá)到解毒的目的（Edwards et al.，2000）。有研究表明，Cd脅迫下，GSTs活性顯著增強（Dixit et al.，2001；Iannelli et al.，2002），而且弱耐性品種GSTs活力高于強耐性品種（胡延玲等，2009），這在本試驗中也有體現(xiàn)。洛麥23在本試驗中的耐Cu能力排名是35，屬于弱耐Cu型品種，受Cu脅迫后其活力升高并與其他3個品種差異顯著。而濟(jì)麥22、科農(nóng)9204和西農(nóng)979在Cu脅迫后GSTs活力略降低，且西農(nóng)979在對照處理下，其GSTs活力最高，這可能與不同基因型小麥GSTs同工酶的組成和表達(dá)存在多樣化有關(guān)，這在其他研究中也有發(fā)現(xiàn)（胡延玲等，2009；Zhang et al.，2008）。

GR能將氧化型谷胱甘肽（GSSG）還原為GSH（林宇豐等，2015），還能抑制O2-的產(chǎn)生（Mittler，2002），從而降低機體內(nèi)過量的ROS，因此GR活力的升高對植物抵御非生物脅迫有重要作用。Gupta et al.（1999）用Cu脅迫菜豆和Drazkiewicz et al.（2003）用Cu脅迫擬南芥后都發(fā)現(xiàn)其GR活力升高。本研究中，濟(jì)麥22受Cu脅迫后其幼根活性顯著增強，且與其他3個品種差異顯著，同時GR活性也顯著增強，與其他3個品種差異顯著，由于濟(jì)麥22在本研究中耐Cu能力排名第四，故屬于耐Cu性較強的品種，而西農(nóng)979和洛麥23屬于弱耐Cu型品種，GR活力較低，對重金屬Cu較敏感，這與Mittova et al.（2003）的研究類似。王聰?shù)龋?010）用100 mmol?L-1NaCl脅迫耐性不同的大豆也得到類似結(jié)果，而且耐性較強的“綠領(lǐng)特早”活性顯著提高，這可能與GR酶在不同品種中被調(diào)控的因素不同有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，重金屬對GR活性是先誘導(dǎo)后抑制，且誘導(dǎo)作用受重金屬濃度影響，本試驗中科農(nóng)9204的GR活性較低，可能是因為本研究中Cu的質(zhì)量濃度超過其GR耐受范圍，導(dǎo)致GR結(jié)構(gòu)或合成受到影響，進(jìn)而降低活力（黃國勇等，2010）。

多數(shù)的GSH-PX在植物遭受重金屬（Sugimoto et al.，1997）、高鹽（Kim et al.，2014）、干旱（Neto et al.，2013）等一些非生物脅迫時被激活，迅速降解脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物（Foyer et al.，1997），從而減少脅迫引起的毒害。研究發(fā)現(xiàn)，Cu脅迫下GSH-PX活性增強（Zhou et al.，2001），且在強耐性品種中活力較強（Anjum et al.，2016）這在本研究也有體現(xiàn)。與CK相比，濟(jì)麥22、科農(nóng)9204在Cu脅迫后GSH-PX活性顯著增強，洛麥 23略降低，且濟(jì)麥22和科農(nóng)9204在本實驗中屬于強耐Cu型品種。黃國勇等（2010）研究發(fā)現(xiàn)重金屬脅迫下GSH-PX活性相對較高，對重金屬耐受性較強，而本試驗中西農(nóng)979 GSH-PX活性較高，可能與其GSH-PX對Cu脅迫不太敏感有關(guān)。綜上，GSTs、GR和GSH-PX活力在濟(jì)麥22中相對較高，與其耐Cu性呈正相關(guān)。同一種酶在同一類型品種間的變化規(guī)律不同，這暗示了其在不同的品種間的調(diào)控解毒機制可能存在差異。然而這3種酶的同工酶數(shù)目較多，調(diào)控其表達(dá)的因素也有很多，在今后的研究中，需要借助分子生物學(xué)技術(shù)深入研究與 Cu解毒有關(guān)的同功酶及調(diào)控其表達(dá)的因素，這對揭示耐性小麥的解毒機制有重要意義。

4 結(jié)論

（1）本研究采用室內(nèi)水培法，對參試的 37個小麥品種進(jìn)行重金屬 Cu脅迫處理。結(jié)合隸屬函數(shù)法和中位數(shù)聚類分析法將37個小麥品種分為3類：強耐Cu型，包括良星99、濟(jì)麥22、科農(nóng)9204等7個品種；中等耐Cu型，由眾麥1號、石農(nóng)952等22個品種組成；弱耐Cu型，包括西農(nóng)979、洛麥23等8個品種。

（2）重金屬Cu脅迫下，GSTs活力升高，且在弱耐Cu型小麥品種間較高；GR和GSH-PX活力在強耐Cu型品種間較高，而在弱耐Cu型品種間變化不同，西農(nóng)979的GSH-PX活力顯著高于洛麥23。

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