Bacillus coagulans BP-2非活性菌株對Cd2+的吸附特性及機理研究

王偉彤，彭燕,，周舒薏，鄭邦豐，陳迪云,，龍建友*

1. 廣州大學環(huán)境科學與工程學院，廣東 廣州 510006；2. 廣東省放射性核素污染控制與資源化重點實驗室，廣東 廣州 510006

隨著現代工業(yè)的迅速發(fā)展，含鎘廢水的不合理排放不僅污染地表、海洋和地下水資源，還通過食物鏈累積危及人類生活和身體健康（Mahmoud et al.，2017；Mousumi et al.，2017）。傳統(tǒng)處理鎘的物理化學方法有離子交換、超濾、反滲透、化學沉淀和溶劑萃取等，但這些方法存在操作成本高、運行時間長、去除不完全，以及難以處置的大量有毒污泥等問題，嚴重限制了它們的推廣應用（Ryszard et al.，2017；Li et al.，2017）。與之相比，微生物由于種類多、分布廣、繁殖快、適應性強和易于培養(yǎng)，表面存在大量功能基團如羧基、羥基、氨基、酰胺基等和活性位點，使得重金屬很容易被吸附到微生物細胞表面（王澤煌等，2016；Luo et al.，2017）。近年來，利用微生物作為經濟、高效的吸附材料去除環(huán)境介質中的重金屬的研究得到了廣泛的關注，如周賡等（2017）研究發(fā)現，在溫度為30 ℃，pH為 9.0，Cd2+質量濃度為 100 mg?L-1條件下，利用Streptomyces sp. Cd TB01粉劑吸附溶液中的鎘，吸附量可達到70.45 mg?g-1；王繼勇等（2017）利用一株產脲酶菌株對鎘吸附特性及機理進行分析，該菌株對鎘的去除率可達 70.5%，菌株細胞表面的-OH,-NH,-C=O起主要吸附貢獻作用。同時研究表明，非活性微生物菌株對重金屬的吸附效果優(yōu)于活性菌株，如黃飛（2013）發(fā)現非活性Bacillus cereus RC-1菌株對的鎘吸附量為31.95 mg?g-1，高于活性菌株（24.01 mg?g-1）。目前雖然有關細菌吸附Cd2+的研究報道很多，但利用非活性Bacillus coagulans菌株吸附重金屬鎘的報道相對較少。從韶關大寶山礦區(qū)土壤中篩選、分離、純化得到一株功能菌株Bacillus coagulans BP-2，研究其非活性菌株在不同環(huán)境變量下對Cd2+的吸附效果；運用不同模型擬合其吸附過程；利用 FTIR、XRD、XPS等表征手段初步判定菌株與鎘的吸附機制，旨在為有效指導實際環(huán)境中鎘的污染治理提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料

菌株分離于韶關大寶山礦區(qū)土壤，經馴化篩選后保藏于廣州大學環(huán)境生物學實驗室。

1.1.2 實驗試劑

稀HCl、硝酸、NaOH溶液、待測金屬Cd2+來自分析純試劑 CdCl2標準溶液，質量濃度為 1000 μg?mL-1。

1.1.3 培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基（牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，瓊脂18 g蒸餾水1000 mL，調節(jié)至pH 7.0）；液體培養(yǎng)基（蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，蒸餾水1000 mL，調節(jié)至pH 7.0）。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)條件

挑取Bacillus coagulans BP-2純菌落于新鮮無菌的固體培養(yǎng)基中進行劃線，置于 25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，以供菌株液體培養(yǎng)制備吸附劑用。

1.2.2 非活性菌株吸附劑的制備

用無菌水將固體培養(yǎng)基中的Bacillus coagulans BP-2菌落制成孢子懸浮液，并按3%體積比接種到液體培養(yǎng)基中，在150 r?min-1、25 ℃條件下?lián)u床培養(yǎng)24 h，離心后保留沉淀得到菌體，取菌體用去離子水洗滌后置于恒溫烘箱中75 ℃烘干6 h，菌體研磨后得到的粉末即為非活性菌株的吸附劑，然后將粉末進行過篩保存。

1.2.3 菌株16S rDNA基因序列分析

PCR擴增引物為16 F（5′-AGAGTTTGATCCT GGCTCAG-3′）和 16 R（5′-TACGGTTACCTTGTTA CGACTT-3′），擴增程序：94 ℃預變性 2 min，94 ℃變性1 min，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s，反復36 個循環(huán)，72 ℃再延伸 2 min（Osama et al.，2012）?；驍U增產物純化后經上海生工測序，將所得序列與 GenBank數據庫中已有的16S rDNA序列進行BLAST對比分析，利用MEGA 5.2進行多重序列比對，采用Kimura-2模型構建NJ（Neighbor-joining）系統(tǒng)進化樹（Kim et al.，2015）。

1.2.4 吸附試驗

準確稱取一定量的非活性菌株粉末添加至 50 mL不同質量濃度的鎘溶液中，置于100 mL錐形瓶中研究不同環(huán)境變量對Cd2+吸附的影響：Cd2+溶液初始質量濃度為10～210 mg?L-1，接觸時間為1～140 min，菌株生物量為 1～5 g?L-1，在溫度為 25 ℃，pH為5，搖床轉速為150 r?min-1條件下進行吸附，吸附完成后取上清液離心，再經0.45 μm濾膜過濾后，采用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜（ICP-AES）測定上清液中剩余Cd2+的質量濃度，并按下列公式計算Cd2+的吸附率和吸附量（Antonio et al.，2017；周丹丹等，2016）。

式中，R為非活性菌株粉末對 Cd2+的吸附率，%；C0為溶液中Cd2+初始質量濃度， mg?L-1；Ce為吸附平衡時溶液中剩余 Cd2+質量濃度，mg?L-1；q為非活性菌株粉末對 Cd2+的吸附量，mg?g-1；V為溶液體積，L；M為非活性菌株粉末質量，g。

1.2.5 表征分析

FTIR：取干燥的非活性菌株粉末與KBr混勻研磨、壓片，然后在UK61M/RENISHAW型傅立葉變換紅外光譜儀上在 400～4000 cm-1內掃描（Chinnannan et al.，2017）。

XRD：將吸附前后的菌株固體粉末壓片后，利用JF-2000型X-射線粉末衍射儀進行分析，分析條件如下：Cu靶 Ka能級，掃描角度 2θ=100°～800°，溫度25 ℃，電流100 mA，加速電壓50 KV，采用連續(xù)掃描方式，掃描速度50 min-1（Ge et al.，2017）。

XPS：將吸附前后的菌株粉末冷凍干燥，用Perkin-Elmer型X射線光電子能譜檢測Cd2+結合能的變化，判斷 Cd2+與菌株結合前后電子能譜差異（Lalhmunsiama et al.，2017）。

1.2.6 吸附等溫模型

基于吸附特性試驗中得到的對 Cd2+的最佳吸附條件，考察菌株在平衡條件下的吸附等溫特征，可運用Langmuir和Freundlich模型表示擬合：

式中，qmax為最大吸附量；mg?g-1；b 為 Langmuir吸附常數；n和Kf為Freundlich吸附常數。

1.2.7 吸附動力學模型

基于吸附特性試驗中得到的對 Cd2+的最佳吸附條件，考察菌株在不同吸附時間下吸附量之間的變化?？煞謩e用一級動力學（pseudo-first-order）模型和二級動力學（pseudo-second-order）模型進行擬合：

式中，K1為一級動力學模型吸附常數；t為時間，min；qt為t時刻菌株粉末對Cd2+的吸附量；k2為二級動力學模型吸附常數。

2 結果與分析

2.1 菌株16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

菌株的16S rDNA序列擴增后得到一段大小為1439 bp的基因片段，通過 GenBank將序列提交NCBI數據庫進行Blast同源性分析，結果顯示，BP-2菌株與Bacillus coagulans序列有99%的同源性，利用Mega 5.2軟件繪制與其相關的種的16S rDNA序列并構建NJ（neighbor-joining）系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1），由圖1可知，BP-2菌株與Bacillus coagulans的親緣關系最近，表明該菌株屬于芽孢桿菌屬，將其命名為 Bacillus coagulans BP-2，該菌株序列已提交NCBI數據庫，登錄號為JF901703。

2.2 Cd2+初始濃度對Bacillus coagulans BP-2菌株吸附的影響

在微生物吸附重金屬影響因素研究中，重金屬的濃度是其中一個重要的影響因素。由圖2可知，非活性菌株Bacillus coagulans BP-2受Cd2+初始質量濃度影響較大，在初始質量濃度為 20～150 mg?L-1時，吸附量隨之增加，這是由于菌株表面的吸附位點沒有被 Cd2+充分占據，當 Cd2+濃度增加時，吸附量也增加，之后隨著 Cd2+初始質量濃度繼續(xù)增加，吸附量保持不變；吸附率隨著 Cd2+初始質量濃度的增加而降低，這可能是因為過高的Cd2+濃度會導致其對吸附位點的競爭，從而導致吸附率降低（宋瑛瑛等，2016）。

圖2 Cd2+初始濃度對Bacillus coagulans BP-2菌株吸附的影響Fig. 2 Effects of Cd2+ initial concentration of Bacillus coagulans BP-2 on biosorption

圖3 吸附時間對Bacillus coagulans BP-2菌株吸附的影響Fig. 3 Effects of contact time of Bacillus coagulans BP-2 on biosorption

圖1 BP-2菌株與相關種16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 1 Molecular phylogenetic consensus of strain BP-2 based on 16S rDNA gene sequence

2.3 接觸時間對Bacillus coagulans BP-2菌株吸附的影響

由圖 3可知，隨著時間的延長，菌株對 Cd2+的吸附量也逐漸增加，當接觸時間為80 min時，該菌株對鎘的吸附量達到最大，為72.36 mg?g-1，這可能是由于在吸附開始階段，菌株表面存在大量可利用的吸附位點，可以吸附更多的金屬離子，導致吸附量增加；但隨著吸附時間的延長，吸附量不發(fā)生變化，這是由于隨著時間的增加，反應趨向平衡，菌株吸附已達到飽和，故吸附量不再增加（Weon et al.，2014）。由此推斷，菌株吸附Cd2+的最佳時間為80 min。

2.4 生物量對Bacillus coagulans BP-2菌株吸附的影響

由圖4可知，當生物量濃度為0～2.5 g?L-1時，吸附量隨著生物量的增加而增加，這可能是因為生物量的增加導致菌株表面吸附位點的增加，同時菌株與Cd2+的接觸概率逐漸增大，并在2.5 g?L-1時達到峰值，此時吸附量最高，為73.15 mg?g-1；繼續(xù)增加生物量濃度，吸附量保持不變，這是由于溶液中Cd2+吸附達到飽和的緣故（Yang et al.，2017）。

圖4 生物量對Bacillus coagulans BP-2菌株吸附的影響Fig. 4 Effects of biomass of Bacillus coagulans BP-2 on biosorption

2.5 Bacillus coagulans BP-2菌株吸附Cd2+前后FTIR分析

對比菌株吸附前后峰值偏移及強度變化，由圖5可知，位于3406 cm-1附近的吸收峰顯示的是-OH或-NH伸縮振動的重疊吸收帶，本研究發(fā)現該菌株由吸附前的3406.42 cm-1偏移到吸附后的3415.20 cm-1，這可能是由于菌株表面的-OH或-NH與Cd2+發(fā)生了配位作用導致峰位的偏移；吸收峰由吸附前的2904.33 cm-1偏移到吸附后的2940.19 cm-1，說明C-H參與了其吸附過程；1631.53 cm-1處的強吸附可能是-C=O的伸縮振動所產生，其吸附完成后峰位從1631.53 cm-1偏移到1649.83 cm-1，說明菌株表面的功能基團-C=O與溶液中Cd2+發(fā)生了反應；1022 cm-1附近處峰位是由 C-OH的伸縮振動所產生的，吸附后由1022.58 cm-1偏移到1067.23 cm-1，且峰的強度有明顯減弱，說明C-OH參與了吸附過程。綜上所述，非活性菌株細胞表面的-OH或-NH、C-H、-C=O及C-OH與Cd2+發(fā)生了作用，吸附前后特征峰的位置和強度都發(fā)生了變化（李璐瑋等，2016；Zhou et al.，2017）。

圖5 BP-2菌株吸附Cd2+前（A）后（B）紅外光譜分析Fig. 5 FT-IR analysis of strain BP-2 before (A) and after (B)adsorbing Cd2+

2.6 Bacillus coagulans BP-2菌株吸附Cd2+前后XRD分析

Bacillus coagulans BP-2對 Cd2+吸附前后的XRD分析結果如圖6所示，通過衍射角出現的Cd2+的特征峰可知，Bacillus cereus在吸附Cd2+前后發(fā)生了變化，吸附前，無Cd2+特征峰出現，吸附后，分別在 13.3°、39.1°處出現了明顯的 Cd2+特征峰，與 MDI Jade軟件標準卡進行對比，推測 Bacillus coagulans BP-2吸附 Cd2+后在菌株表面形成了(NH4)4CdS6化合物，說明Cd2+被成功吸附到了菌株的表面（Wang et al.，2017）。

圖6 BP-2菌株吸附Cd2+前（A）后（B）XRD分析Fig. 6 XRD analysis of strain BP-2 before and after adsorbing Cd2+

2.7 Bacillus coagulans BP-2菌株吸附Cd2+前后XPS分析

菌株吸附前后的 XPS全峰分析結果如圖 7所示，吸附前后元素含量變化見表1。由圖7和表1可知，吸附后的C從64.48%增加到69.15%，說明菌株細胞表面的-OH可能在吸附過程中與Cd2+發(fā)生了相互作用；-NH官能團的結合能位于400 eV附近，吸附完成后，N的含量由吸附前的 11.55%降至吸附后的7.14%，這說明-NH參與了Cd2+的吸附過程；532 eV附近代表的-C=O官能團由吸附前的23.51%減少到了22.27%，說明-C=O亦對Cd2+的吸附有貢獻作用；而菌株表面 Cd2+的含量增加了0.96%，說明Cd2+被成功吸附到了菌株的表面（操艷蘭等，2016；Tan et al.，2017；Lata et al.，2017）。總之，由XPS分析可知，非活性菌株表面的-OH、-NH和-C=O基團參與了 Cd2+的吸附過程，這與FTIR分析的結果一致。

圖 7 BP-2菌株吸附Cd2+前（A）后（B）XPS分析.Fig. 7 XPS analysis of strain BP-2 before (A) and after (B)adsorbing Cd2+

表1 Bacillus coagulans BP-2非活性菌株吸附Cd2+前后元素含量分析Table 1 Element content analysis of Cd2+ before and after the adsorption by the inactive Bacillus coagulans BP-2

2.8 Bacillus coagulans BP-2菌株對Cd2+的吸附等溫模型

本研究采用Langmuir和Freundlich吸附模型對Cd2+的吸附過程進行線性擬合，結果如圖 8(a)，圖8(b)所示，其擬合的相關參數計算見表 2。由圖 8可知，菌株吸附Cd2+的Langmuir等溫模型的相關系數r2（0.9911）高于Freundlich模型的r2（0.9767），因此，Langmuir模型更能準確描繪菌株的吸附過程，說明該菌株對Cd2+的吸附以單層吸附為主（Gao et al.，2017；Tang et al.，2017）。

表2 Bacillus coagulans BP-2非活性菌株吸附Cd2+等溫常數Table 2 Isotherm constants for the adsorption of Cd2+ by the inactive Bacillus coagulans BP-2

2.9 Bacillu

s coagulans BP-2菌株對Cd2+的吸附動力學

圖8 BP-2菌株吸附Cd2+的Langmuir和Freundlich模型Fig. 8 Langmuir and Freundlich model of strain BP-2 adsorbing Cd2+

Bacillus coagulans BP-2菌株對Cd2+吸附過程的一級、二級動力學模型分別如圖9(a)，圖9(b)所示，相關參數見表3。由圖9和表2可知，二級動力學模型相關系數（r2=0.9814）高于一級動力學模型（r2=0.9653），說明二級動力學模型更能準確描繪 Cd2的+吸附過程（Pugazhendhi et al.，2014；Filomena et al.，2017）；同時，二級動力學模型擬合計算的吸附量（qe=57.77 mg?g-1）與實際測定的吸附量（qe=60.10 mg?g-1）較為接近，說明二級動力學模型更能反映該菌株對Cd2+的全過程吸附。

圖9 BP-2菌株吸附Cd2+一級動力學和二級動力學模型Fig. 9 Pseudo-first-order and Pseudo-second-order model of strain BP-2 adsorbing Cd2+

表3 Bacillus coagulans BP-2非活性菌株吸附Cd2+動力學參數Table 3 Kinetic parameters for the adsorption of Cd2+ by the inactive Bacillus coagulans BP-2

3 結論

（1）在NCBI數據庫中對BP-2菌株的16S rDNA基因序列進行Blast同源性比對，發(fā)現其與Bacillus coagulans序列相似性高達 99%，初步鑒定該菌株屬于芽孢桿菌屬，并命名為 Bacillus coagulans BP-2。

（2）Bacillus coagulans BP-2非活性菌株吸附Cd2+的最佳條件為：Cd2+初始質量濃度為 100 mg?L-1，非活性菌株生物量為 2.5 g?L-1，吸附時間為80 min，在該條件下菌株對Cd2+的最大吸附量可達73.26 mg?g-1。

（3）FTIR結果表明，非活性BP-2菌株細胞壁上的-OH或-NH、C-H、-C=O及C-OH在其對Cd2+的吸附過程中起主要貢獻作用。XRD結果表明，吸附后，在13.3°、39.1°處出現了2個明顯的Cd2+特征峰，說明Cd2+被成功吸附到菌株表面，并推測吸附后在菌株表面可能形成了(NH4)4CdS6化合物。XPS結果表明，菌株表面的-OH、-NH和-C=O基團參與了Cd2+的吸附過程。

（4）吸附動力學模擬結果表明，二級動力學模型能較好擬合菌株對Cd2+的吸附過程。吸附等溫模型結果表明，Langmuir模型更能準確地描繪菌株對Cd2+的吸附過程，擬合后的最大吸附量可達 86.19 mg?g-1。

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