Treg在亞急性甲狀腺炎發(fā)病免疫機制中的作用

王小玲，呂合作，甘懷勇，項 平，張小鳳，徐二琴，裴曉艷，金國璽*

(蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 1.內(nèi)分泌科；2.檢驗科；3.病理科；4.中心實驗室；5.蚌埠醫(yī)學(xué)院診斷學(xué)教研室， 安徽 蚌埠 233004)

亞急性甲狀腺炎(subacute thyroiditis, SAT)是一種病因及發(fā)病機制未明的疾病，特征性的表現(xiàn)為甲狀腺部位的疼痛和壓痛，一般認(rèn)為其與病毒感染及免疫因素有關(guān)，可能為病毒感染后出現(xiàn)了免疫機制異常。SAT的甲狀腺損傷似乎是細(xì)胞毒性T細(xì)胞識別病毒與宿主細(xì)胞膜抗原復(fù)合物的結(jié)果，細(xì)胞免疫反應(yīng)可能在SAT的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用[1]。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T-lymphocytes，Treg)在多種自身免疫性疾病的發(fā)生中起著重要的作用，它能夠釋放白細(xì)胞介素- 10(interleukin- 10，IL- 10)和轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor beta，TGF-β)來抑制T細(xì)胞及抗原呈遞細(xì)胞的功能，降低炎性反應(yīng)及抗體的產(chǎn)生，發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)。叉頭蛋白3(Foxp3)作為Treg的特異性標(biāo)志分子，在其調(diào)節(jié)免疫自穩(wěn)中起著關(guān)鍵的作用。前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)是一種炎性致痛因子，能抑制成纖維細(xì)胞的增殖分化及膠原的合成，對腫瘤壞死因子α和TGF-β致炎致纖維化產(chǎn)生負(fù)性影響[2]。本研究擬通過檢測外周血中Treg的比例、炎性反應(yīng)因子的水平以及SAT組織中Treg的分布情況，以探討Treg在SAT發(fā)病的免疫機制中可能的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗樣本：用于Treg及細(xì)胞因子檢測的SAT外周血為2016年1月至2016年12月在蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科門診及住院部收集，均為初發(fā)患者，且半年內(nèi)未使用影響免疫的藥物。SAT 46例，男13例，女33例，年齡范圍26～67歲，平均年齡(46.9±8.6)歲。對照組15名，為同期于體檢中心收集的外周血標(biāo)本，男4名，女11名，年齡范圍27～62歲，平均年齡(43.4±11.8)歲。

用于Foxp3檢測的SAT及對照者甲狀腺標(biāo)本分別來源于蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院外科手術(shù)的SAT甲狀腺組織和甲狀腺腺瘤瘤旁正常甲狀腺組織，均為石蠟包埋保存，并經(jīng)病理確診。其中，SAT 29例，男6例，女23例，年齡范圍29～62歲，平均年齡(46.7±7.7)歲。對照組20名，男4名，女16名，年齡范圍32～64歲，平均年齡(47.37±9.7)歲。

所有SAT病例均經(jīng)臨床表現(xiàn)、實驗室檢查、查體及影像學(xué)檢查等確診。符合2007年中國甲狀腺疾病診治指南中SAT的診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]。標(biāo)本采集已獲得蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)及受試者知情同意。

1.1.2 主要試劑：Treg檢測試劑盒(Anti-CD25-FITC、Anti-CD4-PerCP、Anti-CD127-PE及IgG1-FITC,BD公司)；小鼠抗人Foxp3單克隆抗體[236A/E7](Abcam公司)；EnVision試劑盒(邁新試劑公司)；ELISA試劑盒(IL- 10、TGF-β1及PGE2，Elabscience公司)。

1.2 方法

1.2.1 甲狀腺功能、ESR及CRP的檢測：用化學(xué)發(fā)光法檢測甲狀腺功能，用魏氏法檢測血沉(erythrocyte sedimentation rate, ESR)，用速率散色比濁法檢測C反應(yīng)蛋白(C reactive protein, CRP)。

1.2.2 外周血Treg比例的測定：清晨收集EDTA-K2抗凝血標(biāo)本2 mL，6 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)測定。取2只試管，管1加入Anti-CD4-PerCP及IgG1-FITC各20 μL，管2加入Anti-CD4-PerCP和Anti-CD25-FITC各20 μL及Anti-CD127-APC 5 μL，2管分別加入全血100 μL混勻，置于35 ℃水浴箱避光孵育15 min；加入FACSLysing溶血液2 mL，水浴箱中避光孵育10 min；1 800 r/min離心5 min，棄上清；加入PBS 1 mL，1 800 r/min離心5 min，棄上清，加入PBS 1 mL，行流式細(xì)胞儀檢測。以前向和側(cè)向散射熒光設(shè)門，獲取淋巴細(xì)胞，分析CD4+T細(xì)胞占淋巴細(xì)胞的比例。再獲取CD4+T細(xì)胞，分析CD4+CD25+T細(xì)胞及CD4+CD25+CD127-Treg所占的比例。

1.2.3 外周血血清IL- 10、TGF-β1和PGE2的濃度測定：肝素鈉抗凝管留取空腹血3 mL，1 000×g離心15 min得上清后置于-80 ℃冰箱凍存。分別用IL- 10、TGF-β1和PGE2的ELISA檢測試劑盒對血清進(jìn)行測定，嚴(yán)格按照說明書操作。

1.2.4 甲狀腺組織中Foxp3表達(dá)的測定：多聚甲醛固定新鮮甲狀腺組織，石蠟包埋；用HE染色及EnVision免疫組化染色法染色。切片機進(jìn)行厚度4 μm切片，脫蠟，水化；抗原修復(fù)，高壓鍋沸騰2 min，自然冷卻；過氧化物酶試劑阻斷；1∶100配置小鼠抗人Foxp3單克隆抗體試劑，并滴加至玻片上；37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h；滴加酶標(biāo)羊抗小鼠IgG聚合物；DAB顯色2～3 min；蘇木精復(fù)染液復(fù)染；脫水后封片劑封固。

判斷標(biāo)準(zhǔn)[4]以光鏡下淋巴細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為Foxp3陽性細(xì)胞，以高倍鏡不重復(fù)視野Foxp3陽性細(xì)胞數(shù)為判定標(biāo)準(zhǔn)，每個標(biāo)本選擇5個高倍視野，取平均值，平均值≤3為陰性，>3為陽性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 甲狀腺功能、ESR及CRP比較

SAT組TT3、TT4、FT3和FT4均高于對照組，TSH低于對照組，ESR和CRP高于對照組(P<0.05)(表1)。

2.2 SAT患者外周血Treg比例

SAT組CD4+CD25+CD127-Treg比例明顯低于對照組(P<0.05)(表2，圖1)。

2.3 血清中細(xì)胞因子IL- 10、TGF-β1和PGE2的濃度比較

SAT組血清中TGF-β1濃度明顯高于對照組(P<0.05)(表3)。

2.4 甲狀腺組織中Foxp3蛋白的表達(dá)

SAT組甲狀腺組織中有Foxp3蛋白表達(dá)，細(xì)胞核染色表現(xiàn)為黃褐色顆粒，呈分散分布，少數(shù)灶性分布，與淋巴細(xì)胞浸潤多少有關(guān)，且分布于T細(xì)胞分布區(qū)域。而甲狀腺腺瘤組織及腺瘤旁正常甲狀腺組織基本無Foxp3蛋白表達(dá)，僅少數(shù)病例表達(dá)陽性。SAT組Foxp3蛋白陽性率為72.41%，明顯高于腺瘤組及對照組(P<0.0125)(表4, 圖2)。

3 討論

研究證實，SAT患者循環(huán)中存在直接針對TSHR的抗體，并證實存在針對甲狀腺抗原的致敏T淋巴細(xì)胞[5]。一些針對免疫系統(tǒng)的新療法會導(dǎo)致SAT，提示有免疫因素參與其中[6]。目前已知Treg在體內(nèi)能夠發(fā)揮免疫抑制作用，維持自身耐受及抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)。Treg的數(shù)量異常及功能缺陷在多種疾病的發(fā)病中起了重要的作用，如Graves病(Graves disease，GD)、丙型肝炎病毒(HCV)和橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto’s thyroiditis，HT)等。Graves病患者體內(nèi)存在Treg數(shù)量減少或者功能的缺陷[7]?；謴?fù)期HCV慢性病患者的Treg數(shù)量與持續(xù)感染有關(guān)，其比例顯著增加能夠抑制HCV特異的CD8+T細(xì)胞[8]。人Treg可抑制T細(xì)胞對HIV和巨細(xì)胞病毒的抗原特異性免疫應(yīng)答[9]。推測，慢性病毒感染將引起抑制抗病毒免疫的Treg產(chǎn)生。但是，Treg在SAT發(fā)生發(fā)展中的變化及意義如何?至今沒有相關(guān)的研究報道。TGF-β1、IL- 10和PGE2均可誘導(dǎo)初始T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為Treg并表達(dá)Foxp3，在維持和增強Treg的免疫抑制作用中起著重要的作用[10- 12]。為探討SAT發(fā)病中Treg轉(zhuǎn)化率的變化以及影響Treg 轉(zhuǎn)化的細(xì)胞因子的相應(yīng)變化，進(jìn)行了相關(guān)研究。

表1 SAT組與對照組甲狀腺功能、ESR及CRP的比較Table 1 Comparison of thyroid function, ESR and CRP between SAT group and control group(±s)

*P<0.05 compared with control group.

表2 SAT組與對照組外周血Treg比例的比較Table 2 Comparison of proportion of Treg in peripheral blood between SAT group and control group(±s,%)

*P<0.05 compared with control group.

A.the proportion of CD4+CD25+T cells of SAT group; B.the proportion of CD4+CD25+T cells of control group; C.the proportion of CD4+CD25+CD127-Treg of SAT group; D.the proportion of CD4+CD25+CD127-Treg of the control group

圖1 SAT組與對照組外周血Treg比例的比較Fig 1 Comparison of proportion of Treg in peripheral blood between SAT group and control group

*P<0.05 compared with control group.

表4 SAT組、腺瘤組及對照組甲狀腺組織中Foxp3蛋白的表達(dá)

#P<0.0125 compared with adenoma group;*P<0.0125 compared with control group.

實驗結(jié)果顯示，SAT組患者外周血中Treg明顯降低。Treg降低后，免疫抑制作用減弱，易出現(xiàn)免疫紊亂。血漿中TGF-β1水平明顯升高， 與外周血Treg減少相互矛盾，這在GD和HT中亦可見，可能與TGF-β1反饋性升高有關(guān)，以誘導(dǎo)CD4+CD25-T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為CD4+CD25+T細(xì)胞，減輕自身免疫反應(yīng)[13]。

A.thyroid tissue of SAT; B.thyroid tissue of adenoma; C.thyroid tissue adjacent to adenoma圖2 SAT組、腺瘤組及對照組甲狀腺組織中Foxp3蛋白的表達(dá)

SAT組患者甲狀腺組織中Foxp3蛋白表達(dá)明顯增多，此與血液中Treg減少相悖，這在HT中亦曾被報道[14]，可能為甲狀腺產(chǎn)生免疫破壞后，血液中的Treg轉(zhuǎn)移到甲狀腺組織，從而增強病變部位的免疫抑制作用，以調(diào)節(jié)免疫機制紊亂。

推測SAT發(fā)病的機制可能為病毒感染誘發(fā)了免疫機制異常，Treg減少，對T細(xì)胞及抗原呈遞細(xì)胞的抑制作用減弱，1型T輔助細(xì)胞與細(xì)胞毒性T細(xì)胞活性增高，破壞甲狀腺濾泡，導(dǎo)致SAT的發(fā)生[1,15]。本研究證實，Treg減少可能是SAT發(fā)病的始動因素，當(dāng)免疫炎性反應(yīng)劇烈時，可伴有代償性的TGF-β1升高，至于TGF-β1升高以后會不會及時地上調(diào)Treg的分化和成熟，產(chǎn)生免疫保護作用及其在SAT轉(zhuǎn)歸中的作用機制，是下一步的研究方向。

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