高脂飲食誘導(dǎo)小鼠血糖增高損傷睪丸微血管功能

張曉艷，李炳蔚，劉明明，尚 飛，劉淑英，盛有明，李宏偉，修瑞娟

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 微循環(huán)研究所 衛(wèi)生部微循環(huán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100005)

近年來(lái)，高脂飲食對(duì)雄性生殖功能損害不斷受到關(guān)注[1- 3]。高脂飲食可誘導(dǎo)大鼠發(fā)生早期糖尿病癥狀，表現(xiàn)為空腹血糖水平增高、伴或不伴有糖耐量異常[4- 6]，而高血糖能損傷小鼠睪丸微血管內(nèi)皮細(xì)胞，間接誘導(dǎo)睪丸生精功能障礙[7]。目前針對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠睪丸微循環(huán)障礙、微血管損傷對(duì)生精細(xì)胞的影響報(bào)道較少。因此，本研究利用高脂飲食飼養(yǎng)C57BL/6雄性小鼠20周，觀察小鼠睪丸微循環(huán)和微血管形態(tài)、功能改變及生精細(xì)胞的病理組織學(xué)變化，探索高脂飲食誘導(dǎo)雄性生殖功能損害機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑：羊抗兔血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子- 1抗體(CD31)及增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)(Abcam公司)；TUNEL檢測(cè)試劑盒(Roche公司)；伊文思藍(lán)染色劑(Evans Blue)(Sigma公司)；免疫組化抗原修復(fù)液(北京康為世紀(jì)公司)；高脂飼料(D12492)及普通維持飼料(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物研究所)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：40只SPF級(jí)7 ～ 8周雄性C57BL/6小鼠，體質(zhì)量(23±2)g(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物研究所[SCXK(京)2009- 0007])。飼養(yǎng)在室溫21 ℃～23 ℃、濕度45%～55%、12 h明暗交替，自由進(jìn)食水。

1.2 方法

1.2.1 小鼠分組及處理：將小鼠分為對(duì)照(control)和高脂飼料喂養(yǎng)20周的高脂組(high fat diet, HFD)，每周測(cè)體質(zhì)量及空腹血糖。

本研究方案經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院微循環(huán)研究所倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2.2 睪丸通透性的檢測(cè)：禁食水4 h，腹腔注射2%伊文思藍(lán)。3 h后1.5%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，灌流心臟，取睪丸固定包埋，液氮速凍，-80 ℃保存。20 μm冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察生精小管內(nèi)伊文思藍(lán)染色。

1.2.3 睪丸微循環(huán)血流灌注水平和自律運(yùn)動(dòng)的檢測(cè)：Moor VMS-LDF激光多普勒血流灌注監(jiān)測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)小鼠睪丸微循環(huán)血流量及睪丸微血管自律運(yùn)動(dòng)。Moor VMS PC2.1軟件提取各時(shí)相睪丸血流灌注水平(perfusion unit，PU)，計(jì)算平均灌注量(PU/min)。以單位時(shí)間內(nèi)多普勒血流圖波峰及波谷頻數(shù)計(jì)算睪丸微血管自律運(yùn)動(dòng)頻率(cycle per minute, CPM, 周期/分鐘)，以單位時(shí)間內(nèi)多普勒血流圖波峰與波谷血流灌注單位差值計(jì)算睪丸微血管自律運(yùn)動(dòng)振幅(△PU)。

1.2.4 HE染色觀察睪丸病理組織學(xué)變化：常規(guī)制片觀察睪丸組織。

1.2.5 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)CD31及PCNA表達(dá)：切片脫蠟水化，按免疫組化常規(guī)處理切片，1∶50加入CD31，1∶4 000加入PCNA抗體，4 ℃過(guò)夜；常規(guī)二抗室溫下孵育20 min，DAB染色，蘇木精復(fù)染，脫水透明，中性樹(shù)膠封片。睪丸微血管內(nèi)皮細(xì)胞、生精細(xì)胞棕黃色染色為CD31、PCNA表達(dá)陽(yáng)性，應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件對(duì)陽(yáng)性表達(dá)區(qū)域進(jìn)行積分吸光度值(integrated absorbance,IA)定量分析。

1.2.6 TUNEL染色法檢測(cè)：切片脫蠟至水，按TUNEL染色試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，凋亡生精細(xì)胞為深棕色染色。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 空腹血糖及體質(zhì)量結(jié)果比較

HFD組小鼠高脂飲食20周后，體質(zhì)量為(45±3)g，顯著高于對(duì)照組的(32±4)g (P<0.01)；空腹血糖為(9.96±1.57)mmol/L，顯著高于對(duì)照組的(5.32±1.16) mmol/L (P<0.01)。

2.2 睪丸通透性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對(duì)照組僅在睪丸間質(zhì)和生精小管基底膜處有紅色熒光標(biāo)記，生精小管內(nèi)無(wú)可見(jiàn)熒光染色；而HFD組生精小管內(nèi)有熒光物質(zhì)表達(dá)(圖1)。

EB.evans blue圖1 兩組小鼠睪丸Evanse blue染色結(jié)果Fig 1 Evans blue staining of the mice testis in two groups(×400)

2.3 睪丸微血管血流灌注水平及睪丸微血管自律運(yùn)動(dòng)

對(duì)照組小鼠睪丸表面微血管血流灌注持續(xù)穩(wěn)定，HFD組睪丸血流灌注量降低(P<0.01)，睪丸微血管自律運(yùn)動(dòng)頻率(P<0.05)及振幅(P<0.01)均降低(圖2)。

A.testicular blood perfusion in two groups；B.frequency of vasomotion；C.amplification of vasomotion; *P<0.05, **P<0.01 compared with control圖2 兩組小鼠睪丸微血管血流灌注水平、自律運(yùn)動(dòng)頻率及振幅的變化Fig 2 Comparison of testicular blood perfusion, frequency and amplification of vasomotion

2.4 睪丸組織形態(tài)學(xué)觀察

HFD組小鼠睪丸生精上皮破壞嚴(yán)重，生精小管萎縮，Sertoli細(xì)胞和各級(jí)生精細(xì)胞之間的黏附松散，生精上皮有空泡樣改變(圖3)。

圖3 兩組小鼠睪丸組織形態(tài)學(xué)觀察(HE)Fig 3 Histomorphology in testis between two groups

2.5 睪丸組織CD31及PCNA免疫組化表達(dá)量

HFD組小鼠睪丸微血管內(nèi)皮細(xì)胞CD31表達(dá)斷續(xù)或無(wú)表達(dá)，IA值為(1.22±0.10)×107，表達(dá)量顯著低于對(duì)照組的(3.23±0.13)×107(P<0.01)；HFD組生精細(xì)胞PCNA表達(dá)減少，IA值為(0.74±0.04)×108，顯著低于對(duì)照組的(2.18±0.17)×108(P<0.01)(圖4)。

2.6 睪丸組織生精細(xì)胞TUNEL表達(dá)水平

HFD組可見(jiàn)各級(jí)生精細(xì)胞凋亡，IA值為(1.77±0.15)×107，顯著高于對(duì)照組的(0.87±0.04)×107(P<0.01)(圖5)。

圖5 兩組小鼠睪丸生精細(xì)胞TUNEL表達(dá)水平Fig 5 TUNEL expression level of germ cells in testis between two groups(×400, ±s, n=5)

3 討論

睪丸微循環(huán)承擔(dān)著睪丸內(nèi)雄激素、氧和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等的運(yùn)輸及代謝產(chǎn)物的交換釋放[8]，微血管內(nèi)皮細(xì)胞是睪丸微循環(huán)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，完整的微血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)維持睪丸微循環(huán)的功能至關(guān)重要。睪丸內(nèi)血流的變化與精子發(fā)生緊密相關(guān)[9]， 睪丸微循環(huán)障礙可降低睪丸微血管灌注水平，致睪丸組織缺氧，嚴(yán)重者可使睪丸局部組織梗死并最終造成雄性不育[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，HFD組小鼠睪丸微血管內(nèi)皮細(xì)胞CD31表達(dá)缺失，睪丸微血管血流灌注量以及微血管自律運(yùn)動(dòng)頻率、振幅均降低，提示HFD組小鼠睪丸微血管受損。

血睪屏障是睪丸毛細(xì)血管和生精小管之間的一種功能性結(jié)構(gòu)，睪丸微血管是血睪屏障的重要組成部分。血睪屏障可保護(hù)生精細(xì)胞免受血源性毒素以及生精上皮自體免疫反應(yīng)的侵害，使正常精子發(fā)生過(guò)程得以順利進(jìn)行[11- 13]。有研究報(bào)道，高脂飲食能破壞家兔血睪屏障并使家兔不育[14]；本研究HFD組小鼠空腹血糖水平顯著增高，提示長(zhǎng)期高脂飲食可致C57BL/6雄性小鼠發(fā)生糖尿病前驅(qū)癥狀。由于糖毒性可致睪丸微血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，推測(cè)高脂飲食誘導(dǎo)小鼠血糖增高導(dǎo)致睪丸微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷使睪丸微血管通透性增加，破壞血睪屏障完整性。伊文思藍(lán)染色結(jié)果顯示，HFD組小鼠睪丸生精小管內(nèi)出現(xiàn)熒光染料，表明血睪屏障完整性受損。同時(shí)，組織學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HFD組小鼠睪丸生精上皮出現(xiàn)空泡樣損傷，各級(jí)生精細(xì)胞均見(jiàn)凋亡，且生精細(xì)胞增殖不良。提示高脂飲食誘導(dǎo)小鼠血糖增高使睪丸微血管內(nèi)皮細(xì)胞受損、破壞血睪屏障完整性，導(dǎo)致生精細(xì)胞凋亡及增殖水平異常，使生精上皮受損，并影響精子發(fā)生。

綜上所述，高脂飲食誘導(dǎo)C57BL/6小鼠血糖增高，糖毒性繼發(fā)損傷睪丸微血管內(nèi)皮細(xì)胞，使微血管灌注功能障礙[15]；受損的睪丸微血管通透性增加，破壞血睪屏障完整性，使小鼠精子發(fā)生的內(nèi)環(huán)境紊亂，生精上皮受損且生精細(xì)胞增殖凋亡異常，最終可致雄性不育。通過(guò)糾正由高脂飲食誘導(dǎo)的高血糖,改善睪丸微血管損傷程度，可能成為臨床針對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)男性不育癥的治療靶點(diǎn)之一。

[1] Erdemir F, Atilgan D, Markoc F,etal. The effect of diet induced obesity on testicular tissue and serum oxidative stress parameters [J]. Actas Urol Esp, 2012, 36: 153- 159.

[2] Jensen TK, Heitmann BL, Blomberg JM,etal. High dietary intake of saturated fat is associated with reduced semen quality among 701 young Danish men from the general population [J]. Am J Clin Nutr, 2013, 97: 411- 418.

[3] Dupont C, Faure C, Sermondade N,etal. Obesity leads to higher risk of sperm DNA damage in infertile patients [J]. Asian J Androl, 2013, 15: 622- 625.

[4] Rato L, Alves MG, Dias TR,etal. High-energy diets may induce a pre-diabetic state altering testicular glycolytic metabolic profile and male reproductive parameters [J]. Andrology, 2013, 1: 495- 504.

[5] Utzschneider KM, Prigeon RL, Faulenbach MV,etal. Oral disposition index predicts the development of future diabetes above and beyond fasting and 2- h glucose levels [J]. Diabetes Care, 2009, 32: 335- 341.

[6] American Diabetes Association. Diagnosis and classification of diabetes mellitus [J]. Diabetes Care, 2012, 35(Suppl 1): S64- 71.

[7] 張曉艷, 劉明明, 李炳蔚, 等. 觀察鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的balb/c糖尿病小鼠睪丸微循環(huán)損害 [J]. 微循環(huán)學(xué)雜志, 2015, 3: 1- 4.

[8] Hjertkvist M, Bergh A, Damber JE. HCG treatment increases intratesticular pressure in the abdominal testis of unilaterally cryptorchid rats [J]. J Androl, 1988, 9: 116- 120.

[9] Biagiotti G, Cavallini G, Modenini F,etal. Spermatogenesis and spectral echo-colour Doppler traces from the main testicular artery [J]. BJU Int, 2002, 90: 903- 908.

[10] Gandhi J, Dagur G, Sheynkin YR,etal. Testicular compartment syndrome: an overview of pathophysiology, etiology, evaluation, and management [J]. Transl Androl Urol, 2016, 5: 927- 934.

[11] Levy S, Serre V, Hermo L,etal. The effects of aging on the seminiferous epithelium and the blood-testis barrier of the Brown Norway rat [J]. J Androl, 1999, 20: 356- 365.

[12] Fan Y, Liu Y, Xue K,etal. Diet-induced obesity in male C57BL/6 mice decreases fertility as a consequence of disrupted blood-testis barrier [J]. PLoS One, 2015, 10: e0120775. doi: 10.1371/journal.pone.0120775.

[13] Fernandez CD, Bellentani FF, Fernandes GS,etal. Diet-induced obesity in rats leads to a decrease in sperm motility [J]. Reprod Biol Endocrinol, 2011, 9: 32- 42.

[14] Morgan DH, Ghribi O, Hui L,etal. Cholesterol-enriched diet disrupts the blood-testis barrier in rabbits [J]. Am J Physiol Endocrinol Metab, 2014, 307: E1125- 1130.

[15] Foster RR, Armstrong L, Baker S,etal. Glycosaminoglycan regulation by VEGFA and VEGFC of the glomerular microvascular endothelial cell glycocalyx in vitro [J]. Am J Pathol, 2013, 183: 604- 616.