CD11c+DCs促K14-VEGF轉(zhuǎn)基因小鼠銀屑病樣發(fā)病

張 怡，周 彪，郭政宏，龍 虎，嚴(yán)亨秀

(西南民族大學(xué)， 四川 成都 610041)

FLT3配體(ligand of FMS-like tyrosine kinase 3，F(xiàn)L)是刺激樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cells，DCs)成熟的主要的幾種生長(zhǎng)因子之一[1],FL/FLT3信號(hào)使DCs維持特定的功能。因此，F(xiàn)LT3可以作為靶分子，通過(guò)影響DCs調(diào)節(jié)，進(jìn)而調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。有研究使用FLT3抑制劑治療急性髓性白血病[2]；還有使用FLT3抑制劑CEP- 701抑制DCs治療C57小鼠的實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)[3]，有效改善了發(fā)病小鼠的癥狀，但其作用機(jī)制仍不清楚。

DCs是機(jī)體內(nèi)最強(qiáng)的專職抗原遞呈細(xì)胞，可以有效刺激初始性T細(xì)胞活化，是機(jī)體免疫反應(yīng)的主要啟動(dòng)者。DCs作為T(mén)細(xì)胞的上游，特定的DCs亞型刺激T細(xì)胞分化為特定亞型。比如，DCs可以分泌IL- 23、TGF-β和IL- 6等細(xì)胞因子，刺激T細(xì)胞分化為T(mén)h17細(xì)胞，Th17細(xì)胞在特定的免疫機(jī)制中發(fā)揮重要的作用[4]。因此，以DCs為靶細(xì)胞改善機(jī)體的免疫力將是一種比以T細(xì)胞為靶細(xì)胞更為精確和有效的治療免疫性疾病的方法。

本研究通過(guò)向K14-VEGF轉(zhuǎn)基因小鼠皮下注射FMS樣酪氨酸激酶3陽(yáng)性樹(shù)突狀細(xì)胞(CD11c+DCs)，觀察并分析CD11c+DCs在銀屑病模型鼠中的作用及其免疫機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF級(jí)K14-VEGF轉(zhuǎn)基因小鼠，6周齡雄性，體質(zhì)量約為25 g(四川大學(xué)生物治療國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng))是自身性免疫性疾病銀屑病的轉(zhuǎn)基因鼠模型[5]。K14-VEGF轉(zhuǎn)基因小鼠具有穩(wěn)定的銀屑病臨床表現(xiàn)，幼鼠在最初不會(huì)表現(xiàn)銀屑病的臨床癥狀，3月齡小鼠的耳朵和頸部小部分皮膚開(kāi)始出現(xiàn)銀屑病樣改變，包括表皮增生，表皮分化能力改變，血管黏附分子上調(diào)等特征。5月齡以上小鼠銀屑病樣癥狀加重，背部發(fā)病，病理區(qū)逐漸擴(kuò)大，直至最后紅斑結(jié)痂滲出液覆蓋耳朵和背部大面積皮膚。

飼養(yǎng)小鼠的動(dòng)物房溫度為(25±1)℃，相對(duì)濕度為60%±10%，自由攝食與飲水。

小鼠白細(xì)胞介素4(IL- 4)，小鼠粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落因子(GM-CSF)和小鼠FLT3配體(FL)(PeproTech公司)；亞美尼亞倉(cāng)鼠抗小鼠CD11c抗體(Abcom公司)；兔抗小鼠FLT3抗體(Santa Cruz公司)；羊抗兔-FITC熒光標(biāo)記二抗和蛋白A熒光-TRITC熒光標(biāo)記二抗(武漢博士德生物工程有限公司).

1.2 方法

1.2.2 體外CD11c+DCs的誘導(dǎo)培養(yǎng)：為了獲得純度較高的CD11c+DCs，用IL- 4、GM-CSF和FL等細(xì)胞因子誘導(dǎo)DCs定向分化及成熟，采用半量換液法去除漂浮的非樹(shù)突狀細(xì)胞，棄去的懸浮細(xì)胞中主要包括T細(xì)胞、B細(xì)胞、粒細(xì)胞、死細(xì)胞、細(xì)胞碎片及少量單核細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞。具體方法是取BABL/c小鼠雙側(cè)股骨和脛骨內(nèi)骨髓細(xì)胞。細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞為(1～2)×10-6/mL，使用含有IL- 4(20 ng/mL)、GM-CSF(20 ng/mL)和FL(FLT3配體)(10 ng/mL)的RPMI 1640(含血清&抗生素)培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，2、4、6和8 d吸取最上層培養(yǎng)基半量換液，第9天收細(xì)胞，流式抗體CD11c-PerCP和FLT3-PE染色，使用流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)分析。

1.2.3 K14-VEGF小鼠皮下注射CD11c+DCs：選取12只6周齡未發(fā)病K14-VEGF轉(zhuǎn)基因小鼠，隨機(jī)分為對(duì)照組(n=6)和實(shí)驗(yàn)組(n=6)。重復(fù)1.2.2中的方法培養(yǎng)CD11c+DCs細(xì)胞，分別于第1天和第8天注射入實(shí)驗(yàn)組小鼠頸部皮下[6]，對(duì)照組小鼠皮下注射培養(yǎng)基作為對(duì)照。

1.2.4 對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行分析：觀察小鼠臨床表現(xiàn)以及病理區(qū)變化情況，依據(jù)小鼠銀屑病樣皮損面積和疾病嚴(yán)重程度(psoriasis area and severity index，PASI)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)給予小鼠皮損處紅斑(erythema)、鱗屑(scales)和浸潤(rùn)增厚程度(thickness)0～4的積分: 0，無(wú)；1，輕度；2，中度; 3，重度; 4，極重度。將3者積分相加得到總積分(0～12)，紅斑根據(jù)顏色深淺，鱗屑根據(jù)覆蓋面積占發(fā)病皮膚總面積的比例計(jì)算，對(duì)各組小鼠皮損總積分取平均值后繪制趨勢(shì)線。

注射后第21天取小鼠耳部、頸部以及頸部至背部約1.5 cm的皮膚做石蠟切片，進(jìn)行HE染色，檢測(cè)組織學(xué)變化；流式細(xì)胞術(shù)分析實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠骨髓、血液、脾臟和頜下淋巴結(jié)中的T淋巴細(xì)胞和DCs的變化；免疫熒光法分析小鼠皮損中CD4、CD8、IL- 17a、IFN-γ和CD31的變化；HE染色方法觀察小鼠心、肝、脾、肺和腎的變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 CD11c+DCs表型鑒定

成熟DCs形狀似星形、多邊形或梭形， FLT3分子和CD11c分子分布于成熟CD11c+DCs表面。圖1C為熒光雙染圖片，綠色熒光(圖1A)標(biāo)記的FLT3分子和紅色熒光(圖1B)標(biāo)記的CD11c分子同時(shí)在CD11c+DCs細(xì)胞膜顯色，反映FLT3分子和CD11c分子在DCs膜上表達(dá)陽(yáng)性。K14-VEGF小鼠皮損中90% FLT3陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)CD11c。

A. FLT3-FITC; B. CD11c-PE; C. merge image of double immunofluorescence圖1 免疫熒光雙染法對(duì)CD11c+DCs進(jìn)行表型鑒定Fig 1 Phenotype identification of CD11c+DCs by immunofluorescence

2.2 CD11c+DCs對(duì)K14-VEGF轉(zhuǎn)基因小鼠的影響

2.2.1 CD11c+DCs流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)：圖2A為培養(yǎng)中的DCs，可見(jiàn)明顯的樹(shù)突狀分支和模糊的細(xì)胞核。

誘導(dǎo)培養(yǎng)至第9天，CD11c+DCs細(xì)胞比率為80.23%±3.10%(n=6)(圖2B)。

選取適合的截止高度角，保障算法的可用性，設(shè)置好檢測(cè)門(mén)限閾值，可以有效地進(jìn)行周跳的探測(cè)。成功探測(cè)到周跳后，利用Chebyshev多項(xiàng)式擬合進(jìn)行計(jì)算修復(fù)。值得注意的是，本文的方案可以有效地對(duì)獨(dú)立的單頻接收機(jī)發(fā)生的周跳進(jìn)行探測(cè)和修復(fù)，減小了對(duì)接收機(jī)性能的要求，增強(qiáng)系統(tǒng)的可靠性。

A.form of DCs; B.purity detection of bone marrow cells by flow cytometry圖2 IL- 4、GM-CSF和FL誘導(dǎo)分化后的CD11c+DCsFig 2 CD11c+DCs induced by IL- 4, GM-CSF and FL

2.2.2 K14-VEGF轉(zhuǎn)基因小鼠注射CD11c+DCs后的臨床表現(xiàn)：實(shí)驗(yàn)組小鼠在第3天耳朵面部出現(xiàn)少量紅斑，對(duì)照組小鼠無(wú)變化。隨著時(shí)間延長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)組小鼠銀屑病樣皮損逐漸加重，在第7天已有小鼠兩耳間出現(xiàn)明顯紅斑，少量的結(jié)痂，皮膚的增厚。對(duì)照組小鼠仍無(wú)任何銀屑病樣臨床癥狀。第8天進(jìn)行第2次細(xì)胞注射，注射部位與第1次相同，繼續(xù)觀察小鼠。在第21天時(shí)實(shí)驗(yàn)組小鼠耳朵背部皮膚出現(xiàn)紅斑，結(jié)痂較多，皮膚有滲出液且較厚，嚴(yán)重的有血點(diǎn)出現(xiàn)，而對(duì)照組只有部分小鼠耳朵面部剛剛出現(xiàn)紅斑(圖3)。

實(shí)驗(yàn)組小鼠比對(duì)照組小鼠發(fā)病快，且發(fā)病程度十分嚴(yán)重。第21天時(shí)，實(shí)驗(yàn)組小鼠紅斑平均積分、鱗屑的平均積分和浸潤(rùn)增厚程度的平均積分均顯著高于對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組小鼠PASI的平均總積分顯著低于對(duì)照組(P<0.01)(表1)。

2.2.3 小鼠皮損處組織學(xué)變化:第21天所有實(shí)驗(yàn)小鼠的耳朵和背部皮膚切片組織學(xué)觀察并統(tǒng)計(jì)結(jié)果如下。

2.2.3.1 實(shí)驗(yàn)組小鼠耳部和背部表皮層厚度增加。第21天實(shí)驗(yàn)組小鼠耳朵皮膚表皮厚度為(29±4)μm，顯著高于對(duì)照組的(11±2)μm(P<0.01)(圖4A)。

實(shí)驗(yàn)組小鼠背部皮膚表皮厚度為(25±3)μm，顯著高于對(duì)照組(9±1)μm(P<0.01)(圖4B)。

2.2.3.2 實(shí)驗(yàn)小鼠耳朵棘突明顯增加。皮膚中發(fā)現(xiàn)棘突結(jié)構(gòu)是人類銀屑病患者最典型且最容易識(shí)別的組織學(xué)表現(xiàn)，只在K14-VEGF轉(zhuǎn)基因模型鼠中才有棘突結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)。

棘突結(jié)構(gòu)表現(xiàn)在K14-VEGF發(fā)病小鼠耳朵腹側(cè)面皮膚表皮層。伴隨棘突結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)，銀屑病癥狀會(huì)加重，如炎性細(xì)胞浸潤(rùn)增加，角化過(guò)度和局灶性角化不全增強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)組小鼠單位長(zhǎng)度棘突數(shù)量為11.9±4.1，顯著高于對(duì)照組的2.0±1.3(P<0.01，n=6)，表明實(shí)驗(yàn)組小鼠已具有一種典型銀屑病樣變化(圖4C)。

2.2.4 多個(gè)免疫器官中CD11c+DCs和T淋巴細(xì)胞減少:1)與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠骨髓和淋巴結(jié)中CD11c+CD11c+DCs顯著降低 (圖5，表2)。2) 實(shí)驗(yàn)小鼠T淋巴細(xì)胞明顯降低，其中Th17和Th1均下降。

實(shí)驗(yàn)組小鼠血液中CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)為(17.87±0.23)個(gè)，明顯低于對(duì)照組(31.77±0.54)(P<0.01，n=6)(圖6A)。

與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠骨髓、血液、脾臟及頜下淋巴結(jié)中的CD3+CD4+IL- 17a+Th17細(xì)胞及CD3+CD4+IFN-γ+Th1細(xì)胞數(shù)量均顯著降低(P<0.01)(圖6B，表3)。

2.2.5 皮損處CD4+、CD8+、IL- 17a+和IFN-γ+淋巴細(xì)胞和血管改變：實(shí)驗(yàn)組小鼠CD4+、CD8+、IL- 17a+或IFN-γ+細(xì)胞數(shù)顯著高于對(duì)照組(P<0.01，n=6)；實(shí)驗(yàn)組小鼠血管數(shù)也較對(duì)照組明顯增加(P<0.01，n=6)(圖7，表4)。

圖3 實(shí)驗(yàn)小鼠臨床表現(xiàn)和PASI積分Fig 3 Clinical manifestation and PASI scores of mice skin lesions

grouperythemascalesthicknessPASIcontrol 0.83±0.41 0.50±0.55 0.17±0.41 1.50±1.05experiment 2.67±0.52* 2.33±0.52* 2.00±0.63* 7.00±0.89*

*P<0.01 compared with control.

A.ear skin; B.back skin; C.epidermal rete ridge structures from ear skin圖4 細(xì)胞注射后21 d時(shí)小鼠耳部和背部受損皮膚Fig 4 Mice ear and back skin lesions on day 21 after injecting DCs

圖5 小鼠骨髓和頜下淋巴結(jié)內(nèi)的CD11c+DCs數(shù)量顯著變化Fig 5 Significient change of the number of CD11c+DCs from bone marrow and submaxillary lymph nodes in mice

groupbonemarrowsubmaxillarylymphnodescontrol1.76±0.302.29±0.36experiment0.14±0.03*0.47±0.05*

*P<0.01 compared with control.

2.2.6 實(shí)驗(yàn)組小鼠心、肝、脾、肺和腎的組織學(xué)特征無(wú)明顯改變:實(shí)驗(yàn)組小鼠與對(duì)照組小鼠比較，各臟器組織形態(tài)無(wú)明顯變化，表明CD11c+DCs注射對(duì)內(nèi)臟無(wú)明顯不良反應(yīng)。

3 討論

在銀屑病中，pDCs和mDCs分泌IFN-α、IL- 12和IL- 23，進(jìn)而刺激初始T細(xì)胞分化為T(mén)h1和Th17細(xì)胞[7]。在注射CD11c+DCs后，皮損處的CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞、IL- 17a+細(xì)胞、IFN-γ+細(xì)胞和CD31分子均顯著增多。CD8+T淋巴細(xì)胞增多提示，CD8+炎性淋巴細(xì)胞滲出增多；CD31分子染色顯示，血管數(shù)量增多：提示皮損區(qū)血管擴(kuò)張和數(shù)量增加。銀屑病皮損中CD4+T淋巴細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IL- 17[8]。銀屑病是由Th17/Th1混合介導(dǎo)的自身免疫性疾病[6,9]。Th1和Th17細(xì)胞為CD4+T細(xì)胞分化而來(lái)，INF-γ由Th1產(chǎn)生，且是Th1的標(biāo)志性細(xì)胞因子；IL- 17由Th17產(chǎn)生，且是Th17的標(biāo)志性細(xì)胞因子。IL- 17具有致炎性[10]，可以誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子、趨化因子和基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)，引起組織細(xì)胞浸潤(rùn)和組織破壞。IL- 17協(xié)同IFN-γ通過(guò)人類角質(zhì)形成細(xì)胞增加前炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，也許會(huì)參與中性粒細(xì)胞在銀屑病皮損中的浸潤(rùn)(血管周圍中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)和表皮中性粒細(xì)胞微膿瘍的形成)。

A.number of CD3+CD4+T lymphocytes cells; B.number of Th1, Th17 cells from bone marrow, spleen, submaxillary lymph nodes and blood in mice

圖6 K14- VEGF轉(zhuǎn)基因小鼠骨髓、脾臟、頜下淋巴結(jié)和血液中的T淋巴細(xì)胞數(shù)

*P<0.05，**P<0.01 compared with control.

All the data between the experimental group and the control group is significantly圖7 小鼠皮損處CD4+, CD8+, IL- 17a+, IFN-γ+和CD31+細(xì)胞的免疫熒光Fig 7 CD4+, CD8+, IL- 17a+, IFN-γ+ and CD31+ immunofluorescence in the lesion skins of K14-VEGF mice

groupCD4+CD8+IL-17a+IFN-γ+CD31+control7.12±1.455.64±1.226.43±1.219.76±2.4424.50±4.53experiment21.32±2.31*13.43±2.12*19.86±2.87*25.54±11.68*53.30±9.86*

*P<0.01 compared with control.

在骨髓的流式細(xì)胞術(shù)分析中，實(shí)驗(yàn)組CD11c+FLT3+DCs少于對(duì)照組。頜下淋巴結(jié)在小鼠的頸部，距K14-VEGF小鼠發(fā)病皮膚較近。實(shí)驗(yàn)組CD11c+FLT3+DCs細(xì)胞數(shù)少于對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組中的脾臟和血液中的CD11c+FLT3+DCs細(xì)胞數(shù)量與對(duì)照組相比未見(jiàn)差異。

對(duì)骨髓、脾臟、頜下淋巴結(jié)和血液的流式細(xì)胞術(shù)分析表明，血液中的CD3+CD4+雙陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量減少，其他組的CD3+CD4+雙陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量無(wú)顯著性差異。在CD3+CD4+IL- 17a+和CD3+CD4+IFN-γ+的流式細(xì)胞術(shù)分析中，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)量均減少，且具有極顯著差異。

皮損處CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞、IL- 17a+細(xì)胞、IFN-γ+細(xì)胞和血管數(shù)均增多，致使小鼠皮膚表皮層和顆粒層增厚，出現(xiàn)棘突，皮膚出現(xiàn)鱗屑、紅斑和結(jié)痂等臨床特征。證明CD11c+DCs通過(guò)直接或間接對(duì)CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞、IL- 17a+細(xì)胞、IFN-γ+細(xì)胞和CD31分子等產(chǎn)生作用促進(jìn)K14-VEGF小鼠發(fā)病。

背部注射CD11c+DCs后，小鼠體內(nèi)DCs和T細(xì)胞數(shù)量減少。被激活的DCs可以通過(guò)分泌IL- 6，增強(qiáng)效應(yīng)T細(xì)胞的功能，限制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的數(shù)量[11]。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞抑制效應(yīng)T細(xì)胞用來(lái)維持免疫平衡狀態(tài)。反過(guò)來(lái)，不受限制的效應(yīng)T細(xì)胞會(huì)減少調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的數(shù)量或降低功能，引起自身免疫性疾病[12]。有報(bào)道，銀屑病中的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞機(jī)能下降，抑制能力減弱[13]?；蛟SCD11c+DCs與體內(nèi)DCs和T細(xì)胞之間有一種抑制機(jī)制，但是作用通路尚不可知，還有待進(jìn)一步研究。

[1] O’Keeffe M, Hochrein H, Vremec D,etal. Effects of administration of progenipoietin 1, Flt- 3 ligand, granulocyte colony-stimulating factor, and pegylated granulocyte-macrophage colony-stimulating factor on dendritic cell subsets in mice[J]. Blood, 2002, 99:2122- 2130.

[2] Mark L, Donald S. Novel FLT3 tyrosine kinase inhibitors[J]. Int J Hematol, 2005, 82:100- 107.

[3] Whartenby KA, Calabresi PA, Erin MC,etal. Inhibition of FLT3 signaling targets DCs to ameliorate autoimmune disease[J]. Proc Natl Acad Sci, 2005, 102: 16741- 16746.

[4] Huh JR, Leung MW, Huang P,etal. Digoxin and its derivatives suppress TH17 cell differentiation by antagoniz-ing RORγt activity[J]. Nature, 2011, 472:486- 490.

[5] Xia YP, Li B, Hylton D,etal. Transgenic delivery of VEGF to mouse skin leads to an inflammatory condition resembling human psoriasis[J]. Blood, 2003, 102:161- 168.

[6] Singh TP, Schon MP, Wallbrecht K,etal. 8-methoxypsoralen plus ultraviolet A therapy acts via inhibition of the IL- 23/Th17 axis and induction of Foxp3+ regulatory T cells involving CTLA4 signaling in a psoriasis-like skin disorder[J]. J Immunol, 2010, 184:7257- 7267.

[7] Lee MR, Cooper AJ. Immunopathogenesis of psoriasis[J]. Exp Dermatol, 2007, 16:779- 798.

[8] Consuelo O, Silvia FA, Carrillo JM,etal. IL- 17-producing CD8+T lymphocytes from psoriasis skin plaques are cytotoxic effector cells that secrete Th17-related cytokines[J]. J Leukocyte Biol, 2009, 86:435- 443.

[9] Fitch EL, Rizzo HL, Kurtz SE,etal. Inflammatory skin disease in K5.hTGF-beta1 transgenic mice is not depend-ent on the IL- 23/Th17 inflammatory pathway[J]. J Invest Dermatol, 2009, 129: 2443- 2450.

[10] Park H, Li Z, Yang XO,etal. A distinct lineage of CD4 T cells regulates tissue inflammation by producing interleukin 17[J]. Nat Immunol, 2005, 6:1133- 1141.

[11] Goodman WA, Levine AD, Massari JV. IL- 6 signaling in psoriasis prevents immune suppression by regulatory T cells[J]. J Immunol, 2009, 183:3170- 3176.

[12] Buckner JH. Mechanisms of impaired regulation by CD4+CD25+FOXP3+regulatory T cells in human autoimmune diseases[J]. Nat Rev Immunol. 2010,10: 849- 859.

[13] Hideaki S, Rolland G, Eiko T,etal. Dysfunctional blood and target tissue CD4+CD25 high regulatory T cells in psoriasis: mechanism underlying unrestrained pathogenic effector T cell proliferation[J]. J Immunol, 2005, 174:164- 173.