深低溫降低缺血大鼠大腦MMP- 9和NPY蛋白水平

黃 清，徐 蔚，黃秋玉

(1.福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 神經(jīng)外科，福建 泉州 362000；2.昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院 神經(jīng)外科，云南 昆明 650101；3.福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 手術(shù)室，福建 泉州 362000)

中樞神經(jīng)元對缺血缺氧耐受性極差，常溫狀態(tài)下缺血超過5～8 min[1]即可導(dǎo)致嚴(yán)重且不可逆性損傷，這是臨床上缺血缺氧性腦病預(yù)后不良的重要原因。低溫可以有效降低腦細(xì)胞新陳代謝和氧耗，改善缺血局部微環(huán)境，抑制神經(jīng)干細(xì)胞凋亡的同時減少炎性因子的釋放，從而提高神經(jīng)元缺血缺氧耐受性[2- 3]。目前對其機制中損傷因子與保護因子的表達(dá)變化及其相互關(guān)系仍不清楚?；|(zhì)金屬蛋白酶家族重要成員MMP- 9和中樞神經(jīng)核團重要遞質(zhì)NPY可間接反映腦神經(jīng)元缺血缺氧的損傷程度[4- 5]，本文研究不同溫度下急性缺血大鼠大腦MMP- 9和NPY的表達(dá)變化，進一步揭示深低溫對腦的保護機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物：SPF級雄性SD大鼠63只，體質(zhì)量250～300 g[上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，實驗動物合格證編號：SCXK(滬)2012- 0002]。

1.1.2 主要試劑：鼠抗大鼠β-action單克隆抗體、羊抗鼠MMP- 9單克隆抗體、兔抗鼠NPY多克隆抗體和ECL發(fā)光試劑(Santa Cruz公司)；過氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗(羊抗鼠IgG、兔抗羊IgG和羊抗兔IgG)(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2 主要方法

1.2.1 腦缺血模型的建立及取材：參考文獻(xiàn)[6- 10]報道的方法建立腦缺血模型，大鼠體外循環(huán)各項參數(shù)設(shè)置見參考文獻(xiàn)[11- 12]。隨機分為對照(NC)組、常溫缺血(NTCA)組和深低溫缺血(DHCA)組，每組(n=21)，另取10 只大鼠作為循環(huán)供血及后備使用。

1.2.2 腦含水量測定：取出新鮮右側(cè)大腦半球后立即稱濕重，后置入110 ℃恒溫箱中，24 h后立即稱干重。腦含水量=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.2.3 檢測MMP- 9和NPY的表達(dá)

1.2.3.1 HE染色及免疫組化：取制備好的額葉皮質(zhì)100 mg，用OCT冰凍包埋后連續(xù)切片，厚度約2 μm，0.01 mol/L PBS液接片后在37 ℃下山羊血清封閉2 h，加一抗(1∶100)，4 ℃下反應(yīng)72 h，加二抗，37 ℃下作用2 h，PBS液漂洗4次，DAB顯色10～15 min后漂洗4次，脫水透明，封片后烘干，分別行HE染色和免疫組化分析。隨機選取各組大鼠腦切片10張，每張圖像選取5個不同的高倍視野，計算每個視野下MMP- 9及NPY陽性細(xì)胞均數(shù)(棕黃色或褐色)，并以胞核呈藍(lán)色，胞質(zhì)呈紅色，胞膜、胞核和核仁完整者為存活神經(jīng)元計算神經(jīng)元存活率(神經(jīng)元存活率=正常神經(jīng)元/神經(jīng)元總數(shù)×100)。

1.2.3.2 Western blot檢測：MMP- 9蛋白表達(dá)取制備好的額葉皮質(zhì)100 mg，剪碎后加入1mL含PMSF單去污劑裂解液進行勻漿，冰塊上裂解30 min，裂解液在4 ℃ 12 000 r/min離心5 min，取上清液，BCA法行蛋白定量(以含100 μg蛋白的均漿液為上樣量)。樣本與1/3的4×SDS凝膠上樣緩沖液混合，煮沸變性5～10 min，制成10% SDS-PAGE分離膠與4%濃縮膠后上樣(總體積20 μL)。100 V電泳分離2～3 h，300 mA恒流1 h，濕轉(zhuǎn)至0.45 mm PVDF膜上，5%脫脂奶粉TBS緩沖液室溫封閉3 h。在分別與MMP- 9多抗(1∶500)、β-action單抗(1∶1 000)、NPY多抗(1∶500)溶液混合，4 ℃靜置過夜，與HRP標(biāo)記的相應(yīng)二抗(1∶8 000)室溫孵育1 h，一次與ECL試劑盒A液和B液反應(yīng)，壓片、X線片曝光顯影，拍攝照片。用ImagePro-Plug6.0分析軟件測定目的條帶的IA，以β-action條帶的IA值比值作為目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 腦組織含水量的變化

NTCA組大鼠腦組織含水量最高，DHCA組次之，NC組最低(P<0.05)(表1)。

表1 各組大鼠腦組織含水量及額葉皮質(zhì)神經(jīng)元存活率

*P<0.05 compared with NC；△P<0.05 compared with NTCA

2.2 腦組織形態(tài)學(xué)變化

2.2.1 HE 染色：1)NC組神經(jīng)元未見明顯病理學(xué)改變(圖1A)；2)NTCA組部分神經(jīng)元胞體腫脹，核固縮，伴炎細(xì)胞浸潤及膠質(zhì)增生(圖1B)；3)DHCA組神經(jīng)核染色略加深，少量神經(jīng)元變性(圖1C)，細(xì)胞存活率較NTCA組提高(P<0.05)(表1)。

2.2.2 免疫組化結(jié)果：各組切片免疫組化顯示，MMP陽性細(xì)胞呈棕黃色，大部分分布于神經(jīng)元胞質(zhì)中。NPY陽性細(xì)胞為棕褐色，多數(shù)分布于胞核內(nèi)。

2.3 神經(jīng)元胞核中NPY及MMP- 9表達(dá)的變化

1)免疫組化顯示NC組大鼠額葉中僅有少量神經(jīng)元表達(dá)MMP- 9，分布于皮質(zhì)各區(qū)，染色物質(zhì)均位于胞核內(nèi)，染色淺(圖2A)；NTCA組可見部分神經(jīng)元胞體破裂，陽性物質(zhì)染色深，部分溢出于胞外(圖2B)；DHCA組神經(jīng)元結(jié)構(gòu)形態(tài)完整，染色較淺，陽性物質(zhì)均位于胞質(zhì)內(nèi)(圖2C)。Western blot顯示NTCA組和DHCA組MMP- 9蛋白的表達(dá)均較NC組明顯增多，其中，NTCA組的表達(dá)量要高于DHCA組(P<0.05)。

A.normal control group; B.normal temperature group; C.deep hypothermia group圖1 低溫對缺血大鼠額葉皮質(zhì)神經(jīng)元損傷的影響Fig 1 Effect of low temperature on the damage of rat frontal cortex neurons(×200)

A.normal control group; B.normal temperature group； C.deep hypothermia group； D.normal control group; E.normal temperature group； F.deep hypothermia group

2)免疫組化顯示NC組大鼠額葉有穩(wěn)定量的NPY表達(dá)，神經(jīng)元胞體結(jié)構(gòu)清晰，陽性產(chǎn)物位于胞核和胞質(zhì)內(nèi)，染色深(圖2D)；NTCA組和DHCA組中的NPY陽性物質(zhì)較NC組明顯減少(圖2E, F)。Western blot 顯示NTCA組和DHCA組大鼠額葉NPY蛋白的表達(dá)與NC組比較均有明顯降低，但NTCA組中NPY表達(dá)的減少要比DHCA組更為顯著(P<0.05)(圖2,3，表2,3)。

*P<0.05 compared with NC；△P<0.05 compared with NTCA.

表3 深低溫對缺血大鼠大腦MMP- 9及NPY表達(dá)的影響

*P<0.05 compared with NC；△P<0.05 compared with NTCA.

*P<0.05 compared with NC； #P<0.05 compared with NTCA圖3 3組大鼠大腦皮質(zhì)MMP- 9和NPY蛋白的表達(dá)Fig 3 Expression of MMP- 9 and NPY proteins in the cerebral cortex of the three groups of rats

3 討論

腦缺血后，氧氣和葡萄糖大量消耗，神經(jīng)元能量枯竭，胞膜內(nèi)外離子梯度失調(diào)等，引起細(xì)胞興奮毒性、鈣超載和氧自由基損傷等，導(dǎo)致蛋白質(zhì)和DNA等裂解，促使細(xì)胞凋亡或壞死[13]。低溫則通過降低組織代謝率增強了神經(jīng)元的缺氧耐受性。其中，MMP- 9和NPY發(fā)揮了重要作用。

本實驗中，常溫狀態(tài)下體外停循環(huán)導(dǎo)致的急性腦缺血缺氧誘發(fā)了嚴(yán)重的腦水腫，同時MMP- 9的表達(dá)明顯增高。低溫在相同條件下改善了腦部缺血微環(huán)境，強化了抗缺血半暗帶細(xì)胞的凋亡作用，誘導(dǎo)缺血耐受的同時有效地減少了炎性因子的過度釋放，抑制了MMP- 9的過度表達(dá)，從而為修復(fù)損傷的內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和激活提供了有利條件[14]。低溫還可能通過阻斷金屬蛋白酶對細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的降解，維持血管內(nèi)皮微結(jié)構(gòu)完整，大大減輕了腦水腫的發(fā)生[15]。

本實驗從相反方向揭示了低溫的腦保護作用。NPY在正常腦細(xì)胞中達(dá)到穩(wěn)態(tài)，而缺血導(dǎo)致胞膜內(nèi)外離子梯度失調(diào)誘發(fā)胞膜去極化[14,16]，使細(xì)胞間傳導(dǎo)功能障礙從而導(dǎo)致病理性損傷。NPY的急劇減少就是一個有力的證據(jù)。我們觀察到，常溫缺血導(dǎo)致的NPY下降與腦水腫程度及MMP- 9的表達(dá)水平呈高度負(fù)相關(guān)，這表明NPY作為急性應(yīng)激相關(guān)性神經(jīng)肽在神經(jīng)元損傷中扮演著保護性因子的作用，低溫則能夠在相同條件下維持NPY的表達(dá)在一個相對較高的水平，有報道[16]低溫誘導(dǎo)EPO游離受體表達(dá)、促進神經(jīng)元再生并調(diào)控血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)介導(dǎo)缺氧預(yù)適應(yīng)，從而發(fā)揮腦保護作用。

綜上所述，缺血可誘導(dǎo)大鼠大腦皮質(zhì)損傷因子MMP- 9的表達(dá)，及抑制保護因子NPY的表達(dá)，而低溫在相同條件下降低了NPY的下降幅度及減少了MMP- 9的表達(dá)，從而發(fā)揮腦保護作用。

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