WNT4及其抑制因子SFRP1在糖尿病腎病大鼠腎組織中的表達(dá)

孔 靜，田平平，李圓圓，石明雋，王圓圓，肖 瑛，張 帆，郭 兵，孫 蘭

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 病理生理學(xué)教研室, 貴州 貴陽 550025； 2.貴州省高校重大疾病發(fā)病機(jī)制及藥物防治特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州 貴陽 550025； 3.江蘇醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院 病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室, 江蘇 鹽城 224005)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病(diabetic mellitus, DM)最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，是導(dǎo)致慢性腎衰竭的重要原因。腎小管間質(zhì)纖維化是慢性腎衰竭的重要病理改變[1]，而腎小管上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)在腎小管間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[2]。Wnt通路是誘導(dǎo)EMT發(fā)生的一條重要的信號(hào)通路，本課題組的前期研究和其他學(xué)者的研究證實(shí)Wnt信號(hào)通路的活化促進(jìn)了單側(cè)輸尿管梗阻大鼠和糖尿病大鼠腎臟纖維化的發(fā)生發(fā)展過程。分泌型卷曲相關(guān)蛋白(secreted frizzled-relatd proteins, SFRPs)是Wnt通路的拮抗因子之一。DN時(shí)WNT4/β-catenin信號(hào)通路的異?；罨欠衽c該通路的抑制因子SFRPs表達(dá)下調(diào)有關(guān)，目前研究甚少。因此，本研究旨在探索DN時(shí)WNT4/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)分子及SFRP1的表達(dá)變化及其與DN腎纖維化的可能關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:SD大鼠，雄性，體質(zhì)量200 g±20 g，SPF級(jí)，16只(北京華阜康生物科技股份有限公司，質(zhì)量合格證號(hào)：0257330)。

1.1.2 主要試劑:鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)(Sigma公司)；兩步法免疫組化檢測(cè)試劑、 辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG、DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋公司)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、一抗稀釋液和超敏ECL化學(xué)發(fā)光顯示劑(北京碧云天公司)；過硫酸銨(APS)(武漢博士德公司)；0.45 μm PVDF膜(Millipore公司)；Tween- 20(北京索萊寶生物公司)；RevertAidTNTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo公司)；iQTMSYBR～Green Supermix(Bio-Rad公司)；WNT4抗體(北京博奧森公司)；SFRP1、糖原合成激酶- 3β(glycogen synthase kinase- 3β，GSK- 3β)、p-GSK- 3β抗體(Santa Cruz公司)；β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、上皮細(xì)胞鈣黏蛋白(E-cadherin)、Ⅰ型膠原(CollagenⅠ)抗體(北京博奧森公司)；α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)、β-actin抗體(武漢博士德公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 糖尿病大鼠模型的復(fù)制和分組:STZ法復(fù)制大鼠胰島素依賴型糖尿病(insulin dependent diabetes mellitus，IDDM)模型，72 h后連續(xù)3 d監(jiān)測(cè)空腹血糖≥16.7 mmol/L者判定為IDDM模型復(fù)制成功。于模型復(fù)制成功后1周檢測(cè)大鼠尿蛋白，取8只IDDM模型復(fù)制成功且尿蛋白陽性的大鼠為DN組，取8只相同鼠齡的正常大鼠為正常對(duì)照(normal control, NC)組。

1.2.2 收集標(biāo)本:于12周末處死大鼠，處死前天收集24 h尿液，記錄尿量。處死時(shí)乙醚麻醉；股動(dòng)脈穿刺取血，室溫1 000 r/min離心分離血清；開腹取雙腎，一部分腎組織固定于4%中性甲醛，其余腎組織于-80 ℃保存。

1.2.3 生化指標(biāo)的測(cè)定:活體動(dòng)物血糖用血糖儀尾部取血檢測(cè)；處死動(dòng)物取血清送貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院生化科檢測(cè)血糖(blood glucose)、糖化血紅蛋白(glycated hemoglobin,GHb)、尿素氮(urea nitrogen,UN)、三酰甘油(triglyceride,TG)、膽固醇(cholesterol)；處死動(dòng)物前收集24 h尿液送貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院生化科檢測(cè)24 h尿蛋白(urine protein, UP)。

1.2.4 腎組織形態(tài)學(xué)的觀察：用4%中性甲醛固定的腎臟組織制作成厚度約3 μm的石蠟切片，用HE、PAS和Masson染色，鏡下觀察腎組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)和纖維化病變的情況。

1.2.5 免疫組化染色:將石蠟切片進(jìn)行烤片、脫蠟、PBS漂洗，3% H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶，檸檬酸鹽緩沖液煮沸進(jìn)行微波抗原修復(fù)，PBS漂洗后，給予WNT4(1∶50) 和 β-catenin(1∶100) 4 ℃孵育過夜。PBS漂洗后滴加即用型生物素標(biāo)記的二抗，DAB鏡下顯色，蘇木精復(fù)染，流水沖洗、脫水、透明、晾干、中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并攝取圖像。

1.2.6 Western blot檢測(cè)目的蛋白：稱取約60～100 mg腎皮質(zhì)置于冰預(yù)冷的勻漿器內(nèi)，加入1 mL蛋白裂解液充分裂解后冰上研磨。超聲擊打組織液，12 000 r/min離心10 min，將上清轉(zhuǎn)移置一個(gè)新的EP管中。BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，加入1.5×上樣緩沖液配制成統(tǒng)一濃度的蛋白樣品，100 ℃煮沸10 min。蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST洗膜，分別加入SFRP1(1∶400)、WNT4(1∶200)、GSK- 3β(1∶500)、p-GSK- 3β(1∶600)、β-catenin(1∶300)、α-SMA(1∶200)、CollagenⅠ(1∶200)、E-cadherin(1∶500)、β-actin(1∶400)的一抗，4 ℃孵育過夜，TBS洗膜后加入相應(yīng)二抗，室溫孵育1 h，ECL顯影，凝膠成像系統(tǒng)(ChemiDoc, Bio-Rad)掃描條帶并分析結(jié)果。

1.2.7 Real-time PCR方法檢測(cè)WNT4 mRNA表達(dá)：Trizol法提取總RNA，核酸蛋白儀檢測(cè)RNA濃度和純度，用Thermo試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。Bio-Rad CFX 96熒光定量PCR分析系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，以β-actin為內(nèi)參照，目的基因的相對(duì)含量以2-ΔΔCt表示，引物序列和退火溫度(表1)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析處理，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

表1 PCR引物序列及擴(kuò)增條件

2 結(jié)果

2.1 糖尿病腎病大鼠相關(guān)生化指標(biāo)改變

DN組大鼠與NC組相比，DN組大鼠血糖、GHb、UN、TG、膽固醇和24 h UP均有顯著增高(表2)。

2.2 取腎臟行病理切片觀察腎組織形態(tài)學(xué)改變

HE、PAS及Masson染色顯示，NC組腎小球結(jié)構(gòu)完整清晰，腎小管上皮細(xì)胞排列整齊，腎間質(zhì)未見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。DN組腎小球結(jié)構(gòu)不清晰且系膜區(qū)擴(kuò)張，部分腎小管可見空泡樣變性；腎組織中PAS陽性染色物及Masson染色陽性物質(zhì)明顯增多(圖1)。

2.3 免疫組織化學(xué)染色

與NC組相比，DN組WNT4蛋白在腎小管上皮細(xì)胞胞質(zhì)表達(dá)明顯增多，β-catenin蛋白在腎小管上皮細(xì)胞包膜和胞質(zhì)中均有表達(dá)，并可見核表達(dá)(圖2)。

2.4 蛋白印跡檢測(cè) WNT4/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)分子及SFRP1蛋白表達(dá)

與NC組相比，DN組大鼠腎皮質(zhì)中WNT4、β-catenin、p-GSK- 3β蛋白表達(dá)顯著增多(P<0.05)(圖3A～C)；SFRP1蛋白在NC組大鼠腎皮質(zhì)呈高表達(dá)，在DN組表達(dá)較NC組顯著減少(P<0.05)(圖3D)。

2.5 E-cadherin、α-SMA及collagenⅠ蛋白在糖尿病大鼠腎皮質(zhì)中的表達(dá)

E-cadherin蛋白在NC組大鼠腎皮質(zhì)的表達(dá)較多，DN組E-cadherin蛋白表達(dá)顯著減少(P<0.05；圖4A)；α-SMA和CollagenⅠ蛋白在NC組大鼠腎皮質(zhì)的表達(dá)很少，在DN組表達(dá)則顯著增多(P<0.05)(圖4B～C)。

表2 各組大鼠生化指標(biāo)Table 2 Levels of biochemical index in each group(±s, n=8)

*P<0.05 compared with NC group.

圖1 12周NC和DN組大鼠腎組織HE、PAS和Masson染色Fig 1 Hemotoxyin and eosin staining, periodic acid- schiff and Masson staining of kidney tissues of NC and DN group in 12 weeks rats (scale bars =50 μm)

圖2 WNT4和β-catenin在NC和DN組大鼠腎組織中的免疫組織化學(xué)染色Fig 2 Immunohistochemical staining of WNT4 and β-catenin in the kidney tissue of NC group and DM group rats(scale bars=50 μm)

A.protein levels of Wnt4 were determined by Western blot analysis in kidneytissue in NC group and DN group; B.Western blot analysis of β-catenin protein expression in kidneytissue in NC group and DN group; C.Western blot analysis of p-GSK- 3β/GSK- 3β protein expression in kidneytissue in in NC group and DN group; D.Western blot analysis of SFRP1 protein expression in kidneytissue in in NC group and DN group;*P<0.05 compared with NC group

圖3WNT4、β-catenin、p-GSK-3β/GSK-3β和SFRP1蛋白在NC及DN組大鼠腎組織中的表達(dá)水平

2.6 real-time PCR檢測(cè)WNT4和SFRP1 mRNA在DN腎皮質(zhì)中的表達(dá)

WNT4 mRNA在NC組表達(dá)較少；在DN組中的表達(dá)量有顯著增高(P<0.05)(圖5A)；SFRP1 mRNA在NC組表達(dá)較高；在DN組中的表達(dá)量有顯著降低(P<0.05)(圖5B)。

3 討論

腎小管間質(zhì)纖維化是DN進(jìn)展到終末期的重要病理基礎(chǔ)，而EMT在腎小管間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展中有著重要作用[3]，在誘導(dǎo)EMT發(fā)生的信號(hào)通路中，Wnt是其中的一條關(guān)鍵信號(hào)通路，大量研究證明，Wnt信號(hào)通路的異常激活參與了腎臟纖維化時(shí)的EMT過程[4- 5]。 WNT蛋白家族包括19個(gè)成員[6]，其中WNT4蛋白既可以通過激活經(jīng)典Wnt信號(hào)通路參與腎小管的形成[7]， 又可以通過啟動(dòng)非經(jīng)典Wnt/PCP 信號(hào)通路促進(jìn)腎小管的延長(zhǎng)[8]。本實(shí)驗(yàn)中，DN組大鼠12周末UN、24 h UP較NC組顯著增高，病理切片顯示有腎纖維化病變，表明發(fā)生了糖尿病腎病。DN組腎皮質(zhì)中的WNT4、p-GSK- 3β、β-catenin蛋白較NC組表達(dá)上調(diào)；DN組腎皮質(zhì)中上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin蛋白表達(dá)下調(diào)，間質(zhì)蛋白α-SMA、細(xì)胞外基質(zhì)成分collagenⅠ蛋白表達(dá)上調(diào)，提示DN時(shí)腎組織發(fā)生了WNT4/β-catenin信號(hào)通路的異常活化，腎小管-間質(zhì)發(fā)生EMT及ECM沉積增多，促進(jìn)了腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展。這與PAX2基因在體外誘導(dǎo)大鼠近端腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化后發(fā)現(xiàn)WNT4蛋白、β-catenin蛋白表達(dá)增高[9]以及在高糖培養(yǎng)的人近端腎小管上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)WNT4蛋白、β-catenin蛋白表達(dá)增高的結(jié)果一致[10]。

A.protein levels of Ecadherin were determined by Western blot analysis in kidney tissue in NC group and DN group; B.Western blot analysis of α-SMA protein expression in kidney tissue in NC group and DN group; C.Western blot analysis of collagenⅠ protein expression in kidneytissue in in NC group and DN group;*P<0.05 compared with NC group

圖4E-cadherin、α-SMA及collagenⅠ蛋白在在NC及DN組大鼠腎組織中的表達(dá)水平

A.the mRNA levels of WNT4 were determined by real-time PCR analysis in kidney tissue in NC group and DN group;B.the mRNA levels of SFRP1 were determined by real-time PCR analysis in kidney tissue in NC group and DN group; *P<0.05 compared with NC group圖5 WNT4和SFRP1 mRNA在NC及DN大鼠腎組織中的表達(dá)Fig 5 The mRNA levels of WNT4 and SFRP1 in kidney tissue in NC group and DN group

SFRPs是一類Wnt信號(hào)胞外拮抗因子，它是分泌性糖蛋白家族，在哺乳動(dòng)物中包括5個(gè)成員，即SFRP1～5。最初的研究發(fā)現(xiàn)SFRPs通過富含半胱氨酸的區(qū)域(cysteine-rich domain，CRD)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合Frizzled受體，拮抗Wnt信號(hào)[11]；然而，近期有學(xué)者發(fā)現(xiàn)基于不同的細(xì)胞環(huán)境及不同的frizzled受體濃度和表達(dá)模式，SFRP1也可以激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路[12]。本實(shí)驗(yàn)研究顯示DN組SFRP1 mRNA及蛋白表達(dá)較NC組顯著性降低，說明DN時(shí)SFRP1表達(dá)下調(diào)，且其表達(dá)下調(diào)后可能對(duì)WNT4/β-catenin信號(hào)通路的抑制作用減弱，導(dǎo)致WNT4/β-catenin信號(hào)通路異?；罨龠M(jìn)了DN腎纖維化的發(fā)生發(fā)展。提示DN腎纖維化時(shí)SFRP1可對(duì)Wnt信號(hào)進(jìn)行負(fù)調(diào)節(jié)。

有學(xué)者在對(duì)腎透明細(xì)胞癌、結(jié)直腸癌、胃癌等多種腫瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，SFRP1啟動(dòng)子區(qū)呈高甲基化修飾狀態(tài)，是其蛋白表達(dá)水平下調(diào)的重要原因[13- 15]。而DN時(shí)，腎組織中SFRP1 mRNA和蛋白表達(dá)下調(diào)是否與SFRP1啟動(dòng)子高甲基化而導(dǎo)致其轉(zhuǎn)錄失活有關(guān)，亦或還有其他原因的參與，有待于進(jìn)一步的研究。

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